Avaliação de nanossondas baseadas em gadolínio teranóstico marcadas com 64Cu em camundongos nus portadores de tumor HepG2

Resumo

A radioterapia do câncer de fígado é limitada pela baixa tolerância do fígado à radiação. Os radiossensibilizadores podem efetivamente reduzir a dose de radiação necessária. As nanopartículas AGuIX são pequenas nanopartículas multifuncionais à base de gadolínio que podem transportar radioisótopos ou marcadores fluorescentes para tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia por emissão de pósitrons (PET), imagens de fluorescência e até imagens de multimodalidade. Além disso, devido ao alto número atômico do gadolínio, ele também pode servir como sensibilizador de radiação tumoral. É fundamental definir a biodistribuição e farmacocinética dessas nanopartículas à base de gadolínio para quantificar a magnitude e a duração de sua retenção no microambiente tumoral durante a radioterapia. Portanto, neste estudo, rotulamos com sucesso o AGuIX com ⁶⁴ Cu através do quelador embutido conveniente. Os estudos de biodistribuição indicaram que o radiotraçador ⁶⁴ Cu-AGuIX se acumula em altos níveis no xenoenxerto HepG2 de camundongos nus, sugerindo que seria uma nanossonda teranóstica potencial para radioterapia guiada por imagem em HCC. Também usamos um microscópio eletrônico de transmissão para confirmar a captação de AGuIX nas células HepG2. Em estudos de terapia de radiação, uma diminuição em ¹⁸ A captação de F-FDG foi observada nos xenoenxertos de camundongos nus irradiados com AGuIX, que foi injetado 1 h antes. Esses resultados fornecem uma prova de conceito de que o AGuIX pode ser usado como um radiossensibilizador teranóstico para imagens PET para orientar a radioterapia para câncer de fígado.

Histórico

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos tumores malignos mais comuns no mundo. Houve 782.500 novos casos de câncer de fígado diagnosticados e 745.500 mortes por câncer de fígado em 2012, dos quais 70 a 90% foram HCC [1]. A maioria dos pacientes com CHC é classificada em estágio avançado ou terminal quando são diagnosticados pela primeira vez, portanto, apenas 20–25% dos pacientes são adequados para o tratamento curativo [2, 3]. Portanto, o tratamento do câncer de fígado requer um tratamento multidisciplinar abrangente que inclui a radioterapia como a principal técnica clinicamente viável [4].

Uma das principais limitações da radioterapia para pacientes com CHC é a toxicidade relacionada à radiação no tecido hepático normal circundante. Com o aumento da dosagem, a incidência de complicações de radioterapia, incluindo doença hepática induzida por radiação (RILD), é uma séria ameaça à vida dos pacientes [5]. Uma das estratégias para evitar esse problema é usar radiossensibilizadores que podem se acumular no tecido tumoral para aumentar a sensibilidade das células tumorais à radiação, de modo que as células tumorais tenham maior probabilidade de serem mortas por doses mais baixas de radiação [6].

Em 2013, Mignot et al. construiu um novo tipo de nanopartícula de gadolínio multifuncional, AGuIX, que é pequeno em diâmetro (cerca de 5 nm), relatado como sendo rapidamente excretado pelos rins [7], e pode ser conjugado a marcadores radioativos ou fluorescentes para SPECT, PET, MRI, ou imagens de fluorescência. Como essas nanopartículas carregam um alto número de gadolínio (número atômico 64), elas podem ser usadas como sensibilizadores de radioterapia tumoral [8]. Vários estudos demonstraram que as nanopartículas de AGuIX aumentaram a sensibilidade das células tumorais à radioterapia em várias células tumorais (incluindo linhas celulares resistentes à radiação) in vitro. Razões de realce de sensibilização (SER) foram observadas na faixa de 1,1 a 2,5 [8]. Dado o fundo hepático muito mais baixo de AGuIX em comparação com a alta captação tumoral de AGuIX na maioria dos modelos de tumor devido ao efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR), este tipo de nanopartícula tem um grande potencial para ser desenvolvido em um sensibilizador de radioterapia ideal para HCC [9].

Estas nanopartículas AGuIX foram desenvolvidas principalmente para radioterapia guiada por ressonância magnética (RT); no entanto, a farmacocinética de AGuIX não foi totalmente compreendida. Para determinar quantitativamente o efeito da dose para a terapia de radiação, é fundamental definir a biodistribuição e farmacocinética dessas nanopartículas. ⁶⁴ Cu, um dos radioisótopos mais comumente usados ​​na tomografia por emissão de pósitrons (PET), tem características de decaimento ( T _1/2 =12,4 h) que fornecem a flexibilidade para criar imagens de pequenas moléculas e grandes proteínas e nanopartículas de eliminação lenta. Neste estudo, nós radiomarcamos AGuIX com ⁶⁴ Cu para a avaliação inicial de sua biodistribuição in vivo em camundongos nus portadores de tumor HepG2 para medir com mais precisão a magnitude e a duração de sua retenção no microambiente tumoral. Para conduzir ainda mais estudos de prova de conceito com AGuIX como um sensibilizador de radiação em camundongos nus portadores de tumor HepG2, usamos ¹⁸ F-FDG PET / CT, uma tecnologia de imagem clinicamente comprovada para o metabolismo do tumor para monitorar a resposta à terapia e para avaliar o metabolismo da glicose do tumor HepG2 antes e depois da radioterapia com ou sem AGuIX.

Métodos

Informações gerais

Nanopartículas desidratadas, esféricas e sub-5 nm de gadolínio (AGuIX) foram obtidas da Nano-H (Lyon, França) e usadas sem purificação. As nanopartículas consistem em átomos de gadolínio ligados a uma casca de polissiloxano por meio de quelantes DOTA embutidos. As nanopartículas foram reidratadas em água tratada com DEPC estéril (Invitrogen, EUA) e armazenadas a 4 ° C até o uso de acordo com as instruções do fabricante. O acetato de megestrol foi adquirido a Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, EUA). A linha celular HCC humana, HepG2, foi obtida da American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, University of Virginia, VA, EUA). ⁶⁴ O isótopo Cu foi adquirido na Wisconsin University. Outros produtos químicos e reagentes foram adquiridos da Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, EUA) e usados ​​sem purificação ou processamento adicional. Ratinhos nus atímicos BALB / c machos com seis semanas de idade e pesando entre 16 e 18 g foram adquiridos a Charles River. O estudo em animais foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Universidade da Virgínia.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

Nanopartículas de AGuIX a uma concentração de 0,5 mM nas soluções acima foram incubadas com células HepG2 por 1 h [10]. Em seguida, as nanopartículas residuais foram lavadas com solução salina tampão de fosfato 0,1 M e purificadas por centrifugação. Os pellets celulares com nanopartículas foram corados com formaldeído 4% e glutaraldeído 1% em Pb 0,1 M para imagens.

⁶⁴ Marcação radioactiva de Cu

Nanopartículas de AGuIX foram radiomarcadas com o ⁶⁴ Isótopo Cu. Primeiro misturamos 200 μl de solução de nanopartículas de AGuIX (10 μmole de AGuIX) com 100 μl de 0,5 M de NH ₄ Tampão OAc (pH =5,5). Após incubação por 5 min, 1–3 mCi de ⁶⁴ CuCl ₂ em 0,1 N de HCl foram adicionados, e a mistura de reação foi incubada a 37 ° C durante 1 h. A mistura de reação foi então esterilizada por filtração através de um filtro centrífugo 3k Amicon Ultra (Merck Millipore). A pureza radioquímica foi determinada por iTLC usando 20 mM de ácido cítrico como fase móvel, conforme descrito anteriormente [11].

Modelos de tumor

As células HepG2 foram cultivadas em MEM contendo 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de aminoácidos não essenciais e 10% de FCS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, EUA). As células foram mantidas em uma atmosfera umidificada de ar / CO ₂ (19/1), e eles foram subcultivados a cada 2-3 dias.

Células HepG2 (5 × 10 ⁶ ) foram coletados em 0,1 ml de HBSS, e essas suspensões de células foram então injetadas por via subcutânea no flanco direito de cada camundongo nu usando uma agulha de calibre 27. As orelhas dos camundongos nus que receberam injeções de células foram marcadas para identificação. Geralmente, os tumores sólidos começaram a se tornar visíveis 2 semanas após a injeção de células HepG2.

Biodistribuição em camundongos com tumor de ⁶⁴ Cu-AGuIX

Camundongos nus portadores de tumor (5 machos e 4 fêmeas) foram divididos aleatoriamente em três grupos e injetados intraperitonealmente com o ⁶⁴ Cu-AGuIX, com atividade de aproximadamente 0,9 MBq, em um volume de 0,2 mL. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia com inalação de isofluorano em 9, 21 e 40 h após a injeção. Os órgãos de interesse (coração, músculo, pulmão, rim, baço, fígado e tumor, etc.) foram dissecados e pesados, e 100 μL de sangue foram retirados da cavidade ventricular. A atividade para cada amostra foi determinada usando um contador γ (CRC-7, Capintec Inc., NJ, EUA). A distribuição da radioatividade em diferentes tecidos e órgãos foi calculada e expressa como a porcentagem da dose de injeção por grama (% ID / g).

Imagens Micro-PET de ⁶⁴ Cu-AGuIX em ratos nus

O ⁶⁴ Cu-AGuIX (22,2 MBq) em 0,2 mL de solução salina foi injetado intraperitonealmente em cada camundongo pelado com tumor. Cada animal foi colocado em decúbito ventral na cama de um sistema PET (SuperArgus, Sedecal, Espanha). As imagens PET foram adquiridas por diferentes períodos de tempo às 9 e 21 h após a injeção de ⁶⁴ Cu-AGuIX sob anestesia de 4–5% de isoflurano para indução e 1–2% para manutenção, ambos balanceados com oxigênio.

Configuração de irradiação e ¹⁸ Avaliação de PET F-FDG de xenoenxertos

Para estudos de imagem PET para avaliar a radiossensibilização de AGuIX durante a terapia de radiação, 12 camundongos nus com tumores HepG2 foram divididos em três grupos, com quatro camundongos atribuídos aleatoriamente por grupo. Para a imagem de base de PET, os camundongos foram injetados com ¹⁸ F-FDG (16,4 ± 4,7 MBq) através da veia da cauda e mantido sob anestesia geral por 10 min de PET estático a 30 min p.i. (pós-injeção) com um scanner PET para pequenos animais (Madiclab, Shandong, CN). As imagens PET foram reconstruídas usando o algoritmo 3D OSEM, um tamanho de voxel de 0,91 × 0,90 × 0,90 mm e uma resolução espacial no centro do campo de visão de 1,3 mm.

Para o estudo de irradiação, cada grupo recebeu injeções pela veia da cauda com 0,1 mL de solução salina normal, 1 mg (0,1 mL) de AGuIX e 10 mg (0,1 mL) de AGuIX. Em 1 h após a injeção, esses camundongos nus foram irradiados usando uma fonte de raios-X (X-RAD 320, Precision X-Ray, North Branford, CT, EUA), que foi operado a 250 kV e 8 mA, com um 2- Filtro de mm de Al a uma taxa de dose de 1,2 Gy / min para uma dose total de 6 Gy. No dia seguinte, o mesmo protocolo de irradiação foi repetido com os camundongos. No dia 1 após dois tratamentos de irradiação, esses camundongos foram fotografados com ¹⁸ PET F-FDG (11,1 ± 1,0 MBq) usando o mesmo protocolo da primeira varredura PET. O valor máximo de captação padrão (SUVmax) foi determinado desenhando regiões de interesse (ROIs) nas áreas de tumor (Madiclab, Shandong, CN).

Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados expressos como a média ± erro padrão (SE). Diferenças estatisticamente significativas foram calculadas usando um t bicaudal não pareado teste ou análise de variância unilateral; p valores de <0,05 (*) e <0,01 (**) foram considerados significativos.

Resultados e discussão

Embora a ressonância magnética com contraste tenha sido amplamente utilizada na radioterapia guiada por imagem baseada em AGuIX, o limite de detecção da concentração das nanopartículas é uma preocupação devido ao tempo mais longo de medição da farmacocinética das nanopartículas. Com uma capacidade quantitativa muito mais sensível e superior, o PET estende a faixa dinâmica de concentrações para concentrações nanomolares muito mais baixas que são indetectáveis ​​por ressonância magnética com contraste. Neste relatório, descrevemos a rotulagem e avaliação da biodistribuição e farmacocinética de AGuIX com ⁶⁴ Cu para potencial radioterapia guiada por imagens PET.

Estudo TEM

Para estudos de incubação de células, uma concentração de 0,5 mM de nanopartículas de AGuIX foi escolhida com base em dados publicados e as nanopartículas de AGuIX foram incubadas com células HepG2 por 1 h [10]. Foi observada captação para o citoplasma de células HepG2 (Fig. 1). Este resultado está de acordo com estudos publicados anteriormente nos quais nanopartículas de AGuIX foram incubadas com outros tipos de linhagens celulares [12, 13]. Observamos também que o AGuIX apresentou excelente forma de dispersão nas células HepG2, sugerindo que o AGuIX era estável nas células.

Localização de AGuIX nas células HepG2. a . Imagens TEM (× 6500) mostram a captação de AGuIX nas células HepG2. b . A imagem TEM ampliada (× 52000) mostra a distribuição de nanopartículas de AGuIX no citoplasma

Marcação radioativa

A marcação foi convenientemente realizada com a forma atual de AGuIX com o quelante integrado DOTA em uma etapa para> 98% de rendimento radioquímico. Usando o teste de iTLC para identificar as nanopartículas radiomarcadas que foram retidas nos pontos originais, a marcação resultou em atividade específica e pureza radioquímica de aproximadamente 3-10 MBq / μmol e 98%, respectivamente. Uma média de 50–100 MBq do produto final foi obtida por cada síntese.

Estudos de biodistribuição

⁶⁴ Nanopartículas de Cu-AGuIX foram injetadas intraperitonealmente, a biodistribuição foi determinada em camundongos nus portadores de tumor HepG2, e foi comparada com outros relatados anteriormente. Conforme mostrado na Fig. 2, a biodistribuição em cada órgão / tecido é apresentada como a porcentagem da atividade administrada (dose injetada) por grama de tecido (% ID / g). Os resultados mostraram claramente que ⁶⁴ Cu-AGuIX acumulou-se no tumor com excelente retenção de 9, 21 e 40 h p.i. com a captação de 7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23 e 6,84 ± 1,40% ID / g, respectivamente. Esta retenção de longo prazo pode ser atribuída à absorção das nanopartículas de AGuIX dentro das células e, portanto, está relacionada a ⁶⁴ Residência de cobre nas células. De acordo com outros relatórios [11, 14], embora diferentes rotas de radiomarcação e injeção de isótopos tenham sido usadas, o ⁶⁴ Nanossondas radiomarcadas com cobre exibiram uma captação muito menor (menor que 1% ID / g) em outros órgãos e tecidos normais e eliminação rápida. Coletivamente, esses dados sugerem o uso potencial de ⁶⁴ AGuIX marcado com Cu como uma ferramenta para medir a biodistribuição e farmacocinética de AGuIX para ajudar a guiar o plano de radioterapia em que essas nanopartículas são usadas como radiossensibilizadores. Neste estudo, a captação renal é muito menor do que outros relataram porque este estudo usou injeção intraperitoneal [11, 14].

Biodistribuição de ⁶⁴ Cu-AGuIX em camundongos nus com tumores HepG2. A captação de radioatividade em cada tecido / órgão foi apresentada em% ID / g em 9, 21 e 40 h após a injeção intraperitoneal de ⁶⁴ Cu-AGuIX (média ± DP, n =3)

Imagens Micro-PET em camundongos nus

Imagens de micro-PET mostraram alta captação de ⁶⁴ Cu-AGuIX foi observado em tumor, rins e fígado em camundongos nus portadores de tumor (Fig. 3). O tumor era claramente visível após a administração de ⁶⁴ Cu-AGuIX às 9 he ser ainda mais claro até 21 h após a injeção conforme o fundo diminui.

Imagens de micro-PET de camundongos com tumor. Imagens PET (superior, visão coronal; inferior, visão transversal) de camundongos nus com tumores ( seta vermelha ) foram adquiridos 9 h (esquerda) e 21 h (direita) após a injeção intraperitoneal de ⁶⁴ Cu-AGuIX

¹⁸ Avaliação PET / CT F-FDG de xenoenxertos irradiados com ou sem AGuIX

Para avaliar as diferentes respostas de radioterapia com ou sem administração de AGuIX, ¹⁸ A imagem F-FDG PET / CT foi realizada para monitorar as alterações metabólicas após a irradiação com ou sem injeção de AGuIX em duas dosagens diferentes. A diminuição em ¹⁸ A captação de F-FDG nos xenoenxertos foi observada em todos os camundongos irradiados (Fig. 3). SUVmax (B / A), o indicador primário de eficácia da radiossensibilização, foi 1,03 ± 0,03, 1,04 ± 0,04 e 1,24 ± 0,02 para os camundongos que receberam solução salina normal, 1 mg de AGuIX e 10 mg de AGuIX, respectivamente (Fig. 4). Para o grupo de 10 mg de AGuIX, T / L (B / A) foi significativamente aumentado em comparação com o grupo de 1 mg de AGuIX ( p <0,001, teste de amostra independente) e com o grupo de solução salina normal ( p <0,001, teste de amostra independente). Não houve diferença significativa para T / L (B / A) entre os grupos que receberam 1 mg de AGuIX e solução salina normal ( p =0,83, teste de amostra independente) (Fig. 5). Esses resultados sugerem que o metabolismo da glicose dos xenoenxertos foi suprimido principalmente nos camundongos irradiados que receberam uma injeção de 10 mg de AGuIX; embora a radioterapia possa induzir inflamação, que também pode levar à captação de FDG. Neste estudo, escolhemos a mesma dose de radiação e o mesmo momento pós-terapia de RT para todos os grupos para compensar quaisquer erros sistêmicos. Portanto, a extensão da inflamação causada pela RT deve ser aproximadamente a mesma para todos os três grupos e a contribuição para a captação de FDG induzida pela inflamação deve ser aproximadamente o mesmo nível também. Outras sondas de imagem PET podem ser usadas para evitar essa preocupação. No entanto, essas descobertas fornecem uma prova de conceito de que o AGuIX pode ser usado como um sensibilizador de radiação tumoral em camundongos portadores de tumor HepG2.

¹⁸ Imagens F-FDG PET dos camundongos antes e depois da radiação. ¹⁸ As imagens F-FDG PET foram comparadas em cada painel antes (à esquerda) e 1 dia (à direita) após a irradiação, e os três painéis mostraram as imagens de camundongos injetados por injeção na veia da cauda de soro fisiológico (painel esquerdo), 1 mg de AGuIX ( painel do meio) e 10 mg de AGuIX (painel direito), respectivamente. A mesma escala de cores foi aplicada a cada uma das imagens

¹⁸ Avaliação quantitativa da PET F-FDG antes e após a irradiação. T / L (B), a proporção de SUVmax (tumor) para SUVave (fígado) antes da irradiação; T / L (A), a proporção de SUVmax (tumor) para SUVave (fígado) após a irradiação; T / L (B / A), a razão de T / L (B) para T / L (A); AGuIX (1 mg), 1 mg de AGuIX injetado; AGuIX (10 mg), 10 mg de AGuIX injetado

Por último, a dose de radiação absorvida pela própria sonda de imagem nuclear também é uma preocupação crítica ao se considerar uma mudança para o uso clínico. A forma atual de nanopartículas de AGuIX foi exaustivamente investigada quanto ao metabolismo e toxicidade in vivo e aprovada para estudos em humanos pelo FDA [15]. Rotulando ⁶⁸ Ga (meia-vida de decaimento de ~ 1 h) ou ⁸⁹ Zr (meia-vida de decaimento de 78 h), os resultados do estudo de biodistribuição em camundongos por injeção intravenosa mostraram uma captação extremamente alta nos rins em mais de 20% ID / g desde 30 min até ⁶⁸ Ga até 72 h até ⁸⁹ Zr [11, 14]. Embora a excreção rápida pelos rins seja geralmente benéfica, devido à sensibilidade dos rins à radiação, se os rins podem tolerar essa alta captação e o mecanismo de retenção por um longo período de tempo são desconhecidos. Neste estudo, a captação renal foi de ~ 5% ID / g, menor do que no fígado e tumor durante todo o período da investigação. Pode-se presumir que essa diferença seja devida às diferentes rotas de injeção. Por injeção intraperitoneal, as nanopartículas de AGuIX foram continuamente absorvidas pelo peritônio, enquanto por injeção intravenosa, as nanopartículas foram excretadas rapidamente pelos rins. Como a sensibilidade à radiação de cada órgão e tecido é diferente, a determinação final das sondas teranósticas radioativas para tradução em uso clínico precisa de estudos de dosimetria detalhados.

Conclusões

Nanopartículas AGuIX foram rotuladas com sucesso com ⁶⁴ Cu com alto rendimento. Os estudos de biodistribuição indicaram que o radiotraçador ⁶⁴ Cu-AGuIX exibiu alto acúmulo em tumores e foi retido por um longo período no xenoenxerto HepG2 de camundongos nus, sugerindo que eles são nanossondas teranósticas potenciais para radioterapia guiada por imagem em HCC. A redução significativa de ¹⁸ A captação de F-FDG após radioterapia no grupo de camundongos nus tumorais injetados com AGuIX forneceu evidências de que AGuIX pode ser usado como um sensibilizador de radiação tumoral para aumentar a radioterapia em camundongos portadores de tumor HepG2. Mais investigações sobre a dosimetria são necessárias para determinar a toxicidade da radiação para tradução potencial em aplicações clínicas.

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