Estudo antitumoral de nanogéis de sulfato-metotrexato de condroitina

Resumo

Nanogéis de automontagem (NGs) foram formados por bioconjugação de metotrexato (MTX) com sulfato de condroitina (CS). MTX-CS NGs pode aumentar muito a solubilidade e melhorar a eficácia de entrega de MTX devido à propriedade de ligação de CD44 de CS. Experimentos vivos revelaram que MTX-CS NGs mostrou menos toxicidade do que MTX. O MTX-CS NGs pode melhorar o efeito antitumoral enquanto reduz os efeitos colaterais do MTX. Devido à sua propriedade de ligação ao CD44, os conjugados de sulfato de condroitina-droga podem ser uma plataforma promissora e eficiente para melhorar a solubilidade de moléculas de droga moderadamente solúveis, bem como distribuição direcionada para células cancerosas e tecidos tumorais.

Histórico

O metotrexato (ácido 4-amino-10-metilfólico, MTX) é um análogo do folato, pertencente à família dos antimetabólitos antifolato [1]. O MTX foi o primeiro fármaco utilizado na terapia tumoral a partir da década de 1950 [2], sendo um antitumoral mutagênico e teratogênico, atuando bloqueando a atividade enzimática e interferindo na síntese de DNA [3]. Estudos anteriores demonstraram que a administração de drogas quimioterápicas à célula-alvo sozinha não é suficiente para induzir a morte celular, e altas doses de MTX podem melhorar significativamente a taxa de cura e o prognóstico dos pacientes [4]. A baixa solubilidade em água, a baixa permeabilidade e a meia-vida curta do MTX limitam sua aplicação clínica [5, 6]. O efeito da quimioterapia de MTX é amplamente influenciado por sua baixa captação de células tumorais, biodistribuição tecidual e efeitos colaterais graves [7]. No entanto, uma concentração mais alta de MTX pode aumentar o risco de efeitos adversos devido à baixa biodisponibilidade do MTX [8]. Há uma necessidade urgente de desenvolver um novo sistema de entrega de drogas para melhorar a biodisponibilidade do MTX e reduzir seus efeitos colaterais.

A nanotecnologia tem vantagens em sistemas de entrega de drogas, incluindo melhorar a estabilidade da droga, estender a circulação sanguínea, reduzir os efeitos colaterais e controlar a liberação da droga [9,10,11,12,13,14,15]. A tecnologia de automontagem tem sido amplamente utilizada no campo da entrega de medicamentos para aumentar a eficácia e diminuir os efeitos adversos dos medicamentos [16,17,18,19,20]. Nosso estudo tem como objetivo projetar um sistema de entrega de drogas nanogel para MTX para melhorar sua solubilidade e biodistribuição e reduzir seus efeitos colaterais. O sulfato de condroitina (CS) é um glicosaminoglicano ácido (GAG), que constitui um importante componente da cartilagem, paredes dos vasos sanguíneos, pele, tendões e outros tecidos conjuntivos [21]. Nanogéis baseados em sulfato de condroitina foram estudados anteriormente [22, 23]. Estudos descobriram que o CD44 se liga a um proteoglicano CS [24,25,26]. CD44 é uma glicoproteína transmembrana com domínios extracelulares e tem sido implicada na mediação de interações célula-célula e célula-ECM e desempenha um papel na migração celular [27]. O CD44 é altamente expresso no câncer metastático, em contraste com seus baixos níveis de expressão em tecidos normais [28]. Nanopartículas baseadas em CS foram relatadas para direcionamento de tumor e administração de drogas antitumorais [29, 30]. Aqui, nós fabricamos um novo tipo de nanogéis de auto-montagem CS-MTX em um esforço para melhorar a distribuição direcionada de moléculas de drogas MTX para células cancerosas por meio da interação CS-CD44.

Métodos

Materiais e Amostras

O sulfato de condroitina foi adquirido na Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Liaoning, China). 4-metilmorfolina, tetrahidrofurano e 2-cloro-4, 6-dimetoxi-1,3,5-triazina foram adquiridos na Sun Chemical Technology (Shanghai, China) Co., Ltd., e soro fetal bovino (FBS) foi adquirido da HyClone (Utah, EUA). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Os ratos Lewis foram adquiridos a Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China).

Síntese de DMT-MM

Cloreto de 4- (4,6-Dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il) -4-metilmorfolínio (DMT-MM) é usado para reações de condensação de desidratação com ativação de ácido carboxílico que pode ser usado em solvente aquoso ou de próton sistemas. Vinte e cinco gramas de 2-cloro-4, 6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) foram dissolvidos em 200 ml de tetra-hidrofurano (THF). Em seguida, 18,79 mL de 4-metilmorfolina (NMM) foram adicionados gota a gota à solução CDMT sob agitação. A fim de garantir uma resposta completa, a agitação deve ser mantida por 30 min. Em seguida, o produto filtrado foi lavado três vezes com THF e seco sob vácuo por 24 h. O DMT-MM foi obtido como um pó branco (Esquema 1).

Vias sintéticas na formação de DMT-MM

Síntese de MTX-CS

O CS conjugado com MTX foi ativado por DMT-MM. Para a ativação do CS, o CS (1,0 g) foi dissolvido em 20 ml de água ultrapura e ativado pela adição de DMT-MM (0,769 g). A reação foi conduzida por 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, o CS ativado foi posteriormente reagido com MTX por 24 h em temperatura ambiente. A solução foi dialisada por 48 h com troca de água a cada 4 he liofilizada. O MTX-CS foi obtido como um pó amarelo. O pó amarelo foi examinado por espectrometria de infravermelho com transformada de Fourier (ALPHA, BRUKER, EUA). Os espectros FTIR foram registrados de 400 a 4000 cm ⁻¹ . ¹ H NMR foi usado para determinar se o MTX estava conjugado com CS (Esquema 2).

Vias sintéticas na formação de MTX-CS

Citotoxicidade de nanogéis de MTX-CS

A citotoxicidade dos nanogéis foi analisada usando A549T e células tumorais Hela e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). As células A549T e Hela foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ células por poço em 1640, suplementado com FBS a 10% e incubado por 24 h sob 5% de CO ₂ a 37 ° C. O A549T foi seguido por tratamento com diferentes concentrações de MTX-CS NGs (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM), e o Hela foi seguido por tratamento com diferentes concentrações de MTX- CS NGs (0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 μM) por mais 48 h. As concentrações de MTX-CS NGs foram baseadas no conteúdo de MTX em cada amostra. As concentrações de CS foram baseadas no conteúdo de MTX-CS NGs em cada amostra. Os HUVECs foram semeados em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ³ células por poço em DMEM, suplementado com FBS a 10% e incubado por 24 h sob 5% de CO ₂ a 37 ° C. O HUVEC foi então adicionado a diferentes concentrações de MTX-CS NGs (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM). As concentrações de MTX-CS NGs foram baseadas no conteúdo de MTX em cada amostra. As concentrações de CS foram baseadas no conteúdo de MTX-CS NGs em cada amostra. O ensaio MTT é uma medida da atividade celular. Vinte microlitros de tampão CCK-8 foram adicionados a cada poço e incubados a 37 ° C sob 5% de CO ₂ por mais 4 horas. O meio foi removido e 200 μL de DMSO foram adicionados a cada poço. A absorbância foi medida em um comprimento de onda de 490 nm (570 nm como referência) em um leitor de microplacas MULTISKAN GO (Thermo Scientific, EUA).

Design Animal e Experimental

A fim de analisar a toxicidade de MTX-CS NGs in vivo, 18 ratos Sprague-Dawley machos foram adquiridos no Experimental Animal Center da Zhejiang Academy of Medical Sciences (Hangzhou, Zhejiang, China). Esses ratos foram alojados sob um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, com livre acesso a água e comida. Os ratos, com 8 semanas de idade (200 ± 10 g), foram divididos aleatoriamente em três grupos:grupo controle (injetado com o mesmo volume de solução salina), grupo MTX (injetado com 1,25 μmol kg ⁻¹ dia ⁻¹ ), e grupo MTX-CS NG (injetado com 25 mg kg ⁻¹ dia ⁻¹ MTX-CS NGs). A dose de MTX do grupo MTX-CS NG foi igual a uma dose livre do grupo MTX (1,25 µmol kg ⁻¹ dia ⁻¹ ) Os medicamentos foram administrados em outro dia por meio de injeções intraperitoneais, respectivamente. Após 2 semanas de tratamento (total de sete injeções), todos os ratos foram mortos por decapitação para pesquisas adicionais.

Estudo histológico

Após a decapitação, todos os baços dos ratos foram dissecados rapidamente e lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixados em 4% ( w / v ) paraformaldeído (pH =7,4) (Sigma-Aldrich, MO, EUA) durante 24 h. Em seguida, os tecidos foram preparados para coloração com hematoxilina e eosina (H&E) usando procedimentos padrão e obtidos em microscópio óptico de alta qualidade.

Resultados e discussão

Síntese de MTX-CS

Para determinar se o MTX foi conjugado a CS, usamos FTIR e ¹ H NMR para analisar as amostras de bioconjugado MTX, CS e MTX-CS. A Figura 1 mostra os espectros de FTIR de CS (Fig. 1a), MTX (Fig. 1b) e bioconjugados MTX-CS (Fig. 1c). Conforme mostrado pela Fig. 1b, o MTX tinha transmitância característica em 3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403 e 1207 cm ⁻¹ . O FTIR atinge o pico em 1600 e 1540 cm ⁻¹ pode ser atribuído ao alongamento de para-benzeno, que pode ser encontrado no espectro FTIR de MTX (Fig. 1b) e bioconjugados MTX-CS (Fig. 1c). Os resultados do FTIR indicaram que o MTX foi conjugado com sucesso ao CS.

a Espectro FTIR de CS. b Espectro FTIR de MTX. c Espectro FTIR de MTX-CS

A Figura 2 mostra o ¹ Espectros de H NMR de bioconjugados CS, MTX e MTX-CS. Os picos em 6,93 (2H, d, J =10,1 Hz) e 7,84 (2H, d, J =10,1 Hz) pode ser atribuído ao grupo benzoílo de MTX. Os picos em 4,90 (2H, s) podem ser atribuídos ao metileno próximo ao grupo 2, 4-diamino-6-pteridinil, e os picos em 8,69 (1H, s) podem ser atribuídos ao 2, 4-diamino- Grupo 6-pteridinil de MTX como sugere a Fig. 2b. O ¹ H NMR de CS-MTX (Fig. 2c) sugeriu a CS (parte do dissacarídeo δ _H os sinais estavam entre 3,20 e 5,40, com 5,39 atribuído como o carbono anomérico) foi anexado com sucesso ao MTX (o deslocamento químico do grupo benzoil foi de 8,00 e 6,88, e o grupo metil foi de 3,20). O NMR também provou que o MTX estava conjugado ao CS.

¹ Espectro de H NMR de CS, MTX e CS-MTX. a ¹ Espectro de H RMN de CS; CS foi dissolvido em D ₂ O. b ¹ Espectro de H RMN de MTX; MTX foi dissolvido em dimetilsulfóxido-d6. c ¹ Espectro de H RMN de CS-MTX; CS-MTX foi dissolvido em D ₂ O

Para o cálculo da quantidade de MTX conjugado ao CS, as amostras foram dissolvidas em água ultrapura e agitadas por 48 h em temperatura ambiente. A quantidade de MTX foi determinada por meio de espectrofotômetro UV-vis a 309 nm. A quantidade de MTX foi medida por espectroscopia UV-vis. Finalmente, a quantidade calculada de metotrexato em MTX-CS NGs foi de 13,65%. Os nanogéis formados pelo encapsulamento de moléculas hidrofóbicas de MTX pela camada externa das cadeias laterais hidrofílicas de CS (Fig. 3a). Os nanogéis foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz (DLS), microscópio de força atômica (AFM) e microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Conforme mostrado, os dados DLS mediram o tamanho de todos os nanogéis na faixa de 100–400 nm (Fig. 3b). O tamanho de partícula das nanopartículas é principalmente de cerca de 200 nm. A imagem AFM dos nanogéis confirmou que as nanopartículas estavam bem distribuídas com tamanho semelhante de cerca de 200 nm e morfologia (Fig. 3c). As imagens TEM também mostraram o tamanho dos nanogéis como nanoesferas com tamanho na faixa de 200–240 nm. O tamanho de partícula das nanopartículas é principalmente de cerca de 200 nm (Fig. 3d, e).

Ilustração esquemática do MTX-CS NGs. Espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscópio de força atômica (AFM) e caracterização de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de MTX-CS NGs. a Ilustração esquemática do MTX-CS NGs. b Tamanho de MTX-CS NGs medido por DLS em experimentos representativos. c Imagens AFM de MTX-CS NGs. d , e Imagens TEM de MTX-CS NGs

Para o cálculo da quantidade de MTX conjugado ao CS, as amostras foram dissolvidas em água ultrapura e agitadas por 48 h em temperatura ambiente. A quantidade de MTX foi determinada por meio de espectrofotômetro UV-vis a 313 nm.

A quantidade de MTX foi medida por espectroscopia UV-vis. Em primeiro lugar, foi estabelecida uma curva padrão de absorção de UV de metotrexato livre (Fig. 4). A relação entre a absorbância e a concentração de MTX livre é:
$$ A \ kern0.5em =\ kern0.5em 0.0518 \ mathrm {C} \ kern0.5em + \ kern0.5em 0.0019 \ \ left ({R} ^ 2 \ kern0.5em =\ kern0.5em 0.9998 \ right) $$

Curva padrão de absorção de UV de metotrexato

Em seguida, 28,8 mg de MTX-CS foram dissolvidos em 1000 ml de água ultrapura e a absorção de UV é de 0,2055. Finalmente, a quantidade calculada de metotrexato em MTX-CS NGs foi de 13,65%.

Citotoxicidade de nanogéis de MTX-CS

A atividade antitumoral in vitro de MTX-CS NGs, MTX livre e MTX misturado com CS foi analisada usando A549T e cultura de células tumorais Hela. Conforme mostrado pelo ensaio MTT (Fig. 5), o MTX-CS NGs pode reduzir significativamente a viabilidade de ambas as células cancerosas, enquanto o MTX livre não mostrou quaisquer efeitos em altas concentrações. MTX misturado com CS em alta concentração promove até o crescimento de células cancerosas. A viabilidade de Hela diminuiu de 73,81% para MTX livre para 60,16% para MTX-CS NGs (redução de 13,65% na viabilidade celular) na concentração de fármaco de 10 μM (Fig. 5a). Da mesma forma, a viabilidade das células A549T diminuiu de 80,23% para MTX livre para 46,04% para MTX-CS NGs (34,09% de diminuição na viabilidade celular) na concentração de fármaco de 50 μM (Fig. 5b). Polissacarídeos como o ácido hialurônico são usados como uma porção de direcionamento dos conjugados de drogas ou nanopartículas para terapia do câncer, uma vez que se liga especificamente ao receptor CD44 [31]. O sulfato de condroitina também pode atuar como um ligante para o receptor CD44 [25, 27], o que significa que o CS pode promover a captação de MTX-CS NGs pelas células cancerosas e aumentar a eficácia do MTX. Além disso, as nanopartículas podem melhorar a estabilidade da droga e controlar a liberação das drogas [32, 33]. Todos os resultados provaram que a atividade antitumoral de MTX-CS NGs era melhor do que MTX livre, bem como MTX misturado com CS. Com o aumento da eficiência de entrega intracelular de moléculas de drogas MTX, a seletividade de direcionamento de MTX-CS NGs também melhorou quando comparada à mesma concentração de MTX livre. Estes resultados demonstram que o MTX-CS NGs tem um melhor efeito antitumoral do que o MTX livre.

a Viabilidade celular de A549 T na presença de MTX livre, MTX e CS livres e MTX-CS NGs em 48 h. b Viabilidade celular de Hela na presença de MTX livre, MTX e CS livres e MTX-CS NGs em 48 h. c Viabilidade celular de HUVEC na presença de MTX, CS e MTX-CS NGs livres em 48 h

O efeito adverso de MTX-CS NGs, MTX livre e CS foi analisado por meio de cultura HUVEC. Conforme mostrado pelo ensaio MTT (Fig. 5c), o MTX-CS NGs pode reduzir significativamente o efeito colateral, enquanto o MTX livre pode reduzir significativamente a viabilidade de HUVEC. A viabilidade de HUVEC foi aumentada de 63,6% para MTX livre para 73,5% para MTX-CS NGs (aumento de 9,9% na viabilidade celular) na concentração de droga de 10 μM (Fig. 5c). A viabilidade celular de HUVEC em 400 μM ainda era de 69,95%. O resultado indicou que o MTX-CS NGs pode reduzir o efeito colateral na célula normal.

Design Animal e Experimental

Um dos principais efeitos colaterais tóxicos secundários do MTX usado para tratar pacientes com câncer é a mucosite intestinal, que causa rápida redução no peso corporal [34]. Em seguida, testamos os efeitos protetores do MTX-CS NGs contra a perda de peso induzida pela quimioterapia em ratos Sprague-Dawley machos. A sobrevivência e os pesos foram monitorados por 14 dias após a injeção de solução salina, MTX livre e MTX-CS NGs. Nenhuma morte foi encontrada em qualquer um dos três grupos. Uma diminuição abrupta foi observada no peso corporal de todos os grupos de MTX (1,25 µmol kg ⁻¹ dia ⁻¹ por 14 dias), indicando claramente que os ratos experimentaram síndrome de quimioterapia e danos induzidos por quimioterapia, resultando em doença e perda de peso corporal, enquanto o peso corporal de ratos tratados com MTX-CS NGs (4,25 mg kg ⁻¹ dia ⁻¹ por 14 dias) teve um ligeiro aumento (Fig. 6). Os resultados mostram que o MTX-CS NGs não causou efeitos adversos. Esses achados apóiam a entrega alvo de MTX ao tecido tumoral por meio da interação CD44-CS e reduzem a citotoxicidade do medicamento MTX.

Efeitos do MTX e do MTX-CS NG no peso corporal de ratos. O dia da primeira injeção foi considerado como dia 0. Solução salina, MTX (1,25 µmol kg ⁻¹ dia ⁻¹ ), e MTX-CS NGs (4,25 mg kg ⁻¹ dia ⁻¹ ) foram administrados em outro dia por meio de injeções intraperitoneais, respectivamente, no grupo correspondente. Os resultados são expressos como média ± SEM e analisados usando t teste. * P <0,05 em comparação com a data no dia 0

A fim de investigar mais a toxicidade in vivo de MTX-CS NGs, uma análise histológica do baço de ratos foi realizada para determinar se MTX-CS NGs causou dano ao tecido (Fig. 7). Cortes do grupo controle mostraram a estrutura do baço normal, composto por polpa branca (formas) e polpa vermelha (RP), com trabéculas fibrosas (T) estendendo-se até a polpa esplênica. A polpa branca contém bainhas linfoides periarteriais e folículos esplênicos e é circundada por zonas marginais, enquanto a polpa vermelha é composta por cordões esplênicos e é separada por sinusóides esplênicos (Figs. 7a e 7b). O grupo tratado com MTX apresentou estreitamento sério tanto da polpa branca (caixa preta) quanto do RP. Os depósitos de hemossiderina também podem ser encontrados no grupo tratado com MTX (Figs. 7c e 7d). O grupo tratado com MTX-CS NG apresentou estreitamento moderado tanto da polpa branca (formas) quanto do RP, sem depósitos de hemossiderina encontrados. Tanto a polpa branca quanto a vermelha apresentaram estreitamento leve em comparação com o grupo MTX (Figs. 7e e 7f). Os resultados acima indicaram que o MTX-CS NGs tem poucos efeitos colaterais no tecido normal [35, 36].

Os efeitos de toxicidade de MTX e MTX-CS NGs no baço dos ratos. Baço corado com H&E excisado de camundongos após 14 dias de tratamento após sete injeções intraperitoneais. a , b Seções do grupo de controle. c , d O grupo tratado com MTX. e , f O grupo tratado com MTX-CS NG

Conclusões

Em resumo, fabricamos com sucesso nanogéis automontados para distribuição de drogas antitumorais altamente eficientes. Os nanogéis conjugados com MTX-CS tinham cerca de 200 nm de tamanho, mostrando boa estabilidade e solubilidade. O MTX-CS NGs apresentou citotoxicidade mais forte e mais específica do que o MTX. Experimentos in vivo revelaram que o MTX-CS NGs apresentou menos toxicidade do que o MTX. O MTX-CS NGs pode melhorar o efeito antitumoral enquanto reduz os efeitos colaterais do MTX. Devido à sua propriedade de ligação de CD44, os conjugados de sulfato de condroitina-droga podem ser uma plataforma promissora e eficiente para melhorar a solubilidade de moléculas de droga moderadamente solúveis, bem como distribuição direcionada ativa e seletiva para células cancerosas e tecidos tumorais.

Abreviações

¹ H NMR:: Ressonância magnética nuclear de 1H
AFM:: Microscópio de força atômica
CDMT:: 2-cloro-4, 6-dimetoxi-1, 3, 5-triazina
CS:: Sulfato de condroitina
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
DMT-MM:: Cloreto de 4- (4,6-Dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il) -4-metilmorfolínio
FTIR:: Transformada de Fourier Infra-vermelho
MTT:: Brometo de 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazólio
MTX:: Metotrexato
MTX-CS NGs:: Nanogéis de metotrexato-condroitina sulfato
NGs:: Nanogels
NMM:: 4-metilmorfolina
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
THF:: Tetrahidrofurano
UV-vis:: Espectroscopia ultravioleta-visível

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