Promoção do crescimento celular SH-SY5Y por nanopartículas de ouro modificadas com 6-mercaptopurina e um peptídeo penetrador de neurônio

Resumo

Muito esforço tem sido dedicado à descoberta de biomateriais eficazes para a regeneração nervosa. Aqui, relatamos uma nova aplicação de nanopartículas de ouro (AuNPs) modificadas com 6-mercaptopurina (6MP) e um peptídeo de penetração de neurônios (RDP) como um agente neurófico para promover a proliferação e o crescimento de neurites de células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). Quando as células foram tratadas com conjugados 6MP-AuNPs-RDP, apresentaram maior atividade metabólica do que o controle. Além disso, as células SH-SY5Y foram transplantadas para a superfície revestida com 6MP-AuNPs-RDP para examinar o efeito do desenvolvimento de neurites. Pode-se concluir que 6MP-AuNPs-RDP aderiu à superfície celular e, em seguida, internalizou nas células, levando a um aumento significativo do crescimento de neurites. Embora as células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP tenham sido recuperadas do armazenamento congelado, as células ainda mantiveram um crescimento constante, indicando que as células têm excelente tolerância a 6MP-AuNPs-RDP. Os resultados sugeriram que o 6MP-AuNPs-RDP tinha potencial promissor para ser desenvolvido como um nanomaterial neurológico para o crescimento neuronal.

Histórico

A promoção da proliferação de células neuronais e do crescimento de neuritos é importante na regeneração nervosa [1, 2], para a qual muitos esforços foram feitos a fim de tratar doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP) e derrames [3 , 4]. Foi demonstrado em uma série de estudos que as propriedades de superfície dos materiais podem afetar a morfologia celular, inclusive interferir / promover a replicação e diferenciação celular, o que traz grandes promessas na medicina regenerativa e no desenvolvimento de uma nova estratégia de nanomateriais com funcionalidade biológica ativa como agentes neurofísicos [5 , 6].

Entre os biomateriais existentes, os nanomateriais de ouro são usados em uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo detecção, rotulagem, distribuição de drogas e imagens, devido à sua facilidade de síntese, conveniência para funcionalização de superfície, baixa toxicidade, boa estabilização e biocompatibilidade [7, 8]. Por exemplo, um estudo anterior relatou que os nanobastões de ouro associados à exposição a laser de baixa potência estimularam o aumento do comprimento da neurita em até 25 μm de células neuronais NG108-15 em comparação com o controle [9].

6-mercaptopurina (6MP; Fig. 1a), um medicamento anti-inflamatório, tem sido usado para funcionalizar a superfície de nanopartículas de ouro (AuNPs) para formar AuNPs modificados por 6MP (6MP-AuNPs) por meio de uma ligação Au-enxofre [10] . Foi relatado que 6MP-AuNPs foram usados para analisar quantitativamente a concentração de 6MP no solvente por meio de um mecanismo liga e desliga [11]. No entanto, nenhum dado mostra o efeito de 6MP-AuNPs nas células.

Esquema do procedimento experimental. a Estrutura 6-mercaptopurina. b Procedimento experimental. As partículas foram sintetizadas em pH 9,0 e apareceram agregadas em pH 7,4. Quando as partículas foram adicionadas ao meio de células SH-SY5Y, elas foram internalizadas nas células e estimularam o crescimento celular

Aqui, usamos linhagem de células neuronais para investigar a interação de 6MP-AuNPs e células, uma vez que é bem conhecido que as células neuronais são fortemente afetadas pela propriedade dos substratos de cultura. Dentre as linhagens celulares neuronais, a célula do neuroblastoma humano (SH-SY5Y) é considerada um sistema modelo amplamente utilizado devido a sua alta sensibilidade à estimulação ambiental e importância para biomateriais funcionais na pesquisa neural. Além disso, a fim de aumentar a eficiência de captação de células neurais de 6MP-AuNPs, um peptídeo direcionado a neurônios (RDP) foi ligado à superfície da partícula para formar um conjugado 6MP-AuNPs-RDP. Os resultados sugeriram que o conjugado mostrou uma atividade neurológica óbvia, mas não um efeito antiproliferativo de 6MP, levando a um aumento significativo na proliferação celular e no crescimento de neuritos.

Métodos / Experimental

Síntese do Conjugado 6MP-AuNPs-RDP

AuNPs revestidos com citrato com o tamanho de 20 nm foram sintetizados pelo método de redução. Resumidamente, uma solução aquosa de HAuCl ₄ · 3H ₂ O (100 mL, 0,01%) foi aquecido com agitação vigorosa durante 30 min, em seguida, solução de citrato de sódio (10 mL, 38,8 mM) foi rapidamente adicionada ao HAuCl ₄ solução. A mistura foi refluxada por mais 30 min, até que uma solução vermelho escuro foi obtida, e resfriada à temperatura ambiente naturalmente.

6MP-AuNPs foram preparados pela mistura de AuNPs (0,33 mM) e solução de 6MP (concentração final 0,046 nM) por 5 h em temperatura ambiente de acordo com um relatório anterior [12]. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 17.000 g por 30 min. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o pellet (6MP-AuNPs) foi ressuspenso e lavado com água desionizada por três vezes.

Para obter 6MP-AuNPs modificados por RDP, RDP (FAM w / CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC; sintetizado por Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) e 6MP, com a respectiva concentração final de 0,023 nM, foi adicionado simultaneamente à solução AuNP (0,33 mM) durante 5 h e depois centrifugado a 17.000 g por 30 min. Como um controle, um peptídeo codificado marcado com FAM (FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC) foi sintetizado (Shanghai Ji’er Biotech. Co., China) e 6MP-AuNPs-SP-FAM foi preparado em paralelo. Em seguida, o sobrenadante das partículas foi descartado, e as partículas foram lavadas respectivamente com água desionizada. As soluções de partículas foram respectivamente ajustadas para pH 9,0 com NaOH 0,1 M e, em seguida, passadas por filtros de seringa de 0,22 μm e armazenadas a 4 ° C para uso.

Características das partículas

Os espectros de absorção foram medidos à temperatura ambiente com um espectrofotômetro UV / vis (UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Japão) para detectar a absorção óptica das partículas. O tamanho de partícula e o potencial zeta das partículas foram medidos respectivamente usando um aparelho de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern) após diluição com água desionizada. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM; Shimadzu) foi usada para observar a estrutura das partículas.

Cultura de células

As células SH-SY5Y foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio F-12 com a proporção de 1:1. Os meios foram suplementados respectivamente com 10% de soro fetal de vitela (FCS), 100 unidades / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO ₂ em uma incubadora umidificada (Thermo Fisher Scientific, EUA). Todos os reagentes para cultura de células foram adquiridos na HyClone (EUA).

Captação de células

As células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 × 10 ⁴ células / poço. Quando a confluência celular atingiu 60%, 6MP-AuNPs-RDP e 6MP-AuNPs-SP marcados com FAM de concentração final de 0,25 μg / mL foram respectivamente adicionados ao meio celular para uma incubação de 2 h. Em seguida, a mídia celular foi descartada e substituída por mídia nova. As células foram observadas e fotografadas em microscópio de fluorescência (Olympus, Japão).

Impacto de 6 MP-AuNPs-RDP no crescimento neuronal

As células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 × 10 ⁵ células / poço durante a noite. Em seguida, RDP-6MP-AuNPs com diferentes concentrações (0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 μg / mL) foram respectivamente adicionados à mídia para uma incubação de 24 h. O número de células foi contado usando um contador automático de células (Bio-Rad, EUA).

Além disso, a atividade metabólica celular foi medida pelo ensaio do brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) de acordo com o relatório anterior [13]. Resumidamente, as células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 10 ⁴ células / poço e incubadas em meio contendo FBS a 10% durante a noite. Em seguida, as partículas foram respectivamente adicionadas ao meio por 24 h. As células foram lavadas com PBS por três vezes e, em seguida, 100 μL de mídia fresca e 10 μL de MTT (5 mg / mL em tampão PBS) foram adicionados a cada poço. Após uma incubação de 4 h, os meios de comunicação foram removidos e 200 μL de sulfóxido de dimetil (DMSO) foram adicionados para dissolver o formazan produzido. A absorbância do sobrenadante foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas (Bio-Rad, EUA). As células sem quaisquer adições são usadas como branco, e as células com apenas solvente (NaOH 0,1 M (pH 9,0) foram ajustadas para pH 7,4 por HCl 0,1 M) como controle. A atividade metabólica celular relativa foi calculada como atividade metabólica (%) =DO ₄₉₀ (amostra em branco) / OD ₄₉₀ (controle em branco). Cada valor foi calculado a partir de quatro experimentos independentes.

Para determinar o efeito de 6MP-AuNPs-RDP no crescimento de neurites, células SH-SY5Y foram transplantadas em placas de 6 poços e cultivadas até 30% de confluência. Em seguida, as células foram tratadas com 6MP-AuNPs-RDP (0,25 μg / mL) uma vez por dia durante 3 dias. Os comprimentos das neurites foram observados em microscopia óptica (Olympus, Japão) e calculados usando um software ImageJ [14].

Proliferação celular na superfície revestida com 6MP-AuNPs-RDP

6MP-AuNPs-RDP foram semeados homogeneamente no fundo das placas de cultura de 3,5 cm de diâmetro e, em seguida, as células foram transplantadas para as placas revestidas com partículas. Após a incubação, as células foram observadas ao microscópio óptico e o comprimento das neurites foi contado. As células com apenas solvente foram utilizadas como controle. Cada experimento foi repetido quatro vezes independentes, e 200 neuritos foram calculados em média para o cálculo do comprimento dos neuritos.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± SEM. Os dados foram analisados com um programa de computador por análise de variância unilateral (ANOVA), seguida do teste de alcance múltiplo de Dunnett, com o software SPSS 13.0. Diferenças com p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Aparência e características das nanopartículas

A solução aquosa de AuNPs mostrou uma cor escarlate sob a luz visível (Fig. 2a, 0 s). Após a adição de 6MP, a cor tornou-se gradualmente escura quando 6MP foi conjugado com AuNPs e, finalmente, uma precipitação azul-escura de 6MP-AuNPs apareceu após 5 h de reação. A precipitação pôde ser resolvida ajustando o pH para 9,0 e, na ocasião, a solução aquosa de 6MP-AuNPs apresentava uma cor rosa. A precipitação seria formada novamente quando o pH fosse ajustado para pH 7,4.

Processo de reação e características das nanopartículas. a Processo de reação para a preparação de 6MP-AuNPs. Após 6MP ter sido adicionado à solução AuNP, a cor da solução mudou e a precipitação foi formada gradualmente em 5 h. b A precipitação de 6MP-AuNPs-RDP foi dissolvida quando o pH foi ajustado para 9,0 por NaOH 0,1 M. c Medição DLS da distribuição do tamanho das partículas. d Potencial Zeta de AuNPs, 6MP-AuNPs e 6MP-AuNPs-RDP. e Estruturas de partículas sob TEM

6MP-AuNPs-RDP foi preparado conjugando os AuNPs com grupos tiol de 6MP ou RDP em pH 9,0. A solução aquosa de 6MP-AuNPs-RDP mostrou a mesma cor rosa que a da solução 6MP-AuNP (Fig. 2b). Quando o pH da solução 6MP-AuNPs-RDP foi ajustado para 7,4, as partículas precipitaram no fundo da solução.

O tamanho e o potencial zeta de 6MP-AuNPs e 6MP-AuNPs-RDP solução (pH 9,0) foram examinados respectivamente por DLS (Fig. 2c). Os dados mostraram que o tamanho médio de 6MP-AuNPs-RDP era ligeiramente maior do que o de 6MP-AuNPs (24,6 vs 20,5 nm), enquanto o potencial zeta do primeiro era significativamente maior do que o último (- 25,8 vs - 37,2 mV), sugerindo que o RDP catiônico aumentou o potencial de superfície da partícula. As imagens TEM mostraram que ambas as nanopartículas tinham formato esférico (Fig. 2d).

Captação celular das nanopartículas

Quando as soluções de partículas foram ajustadas para pH 7,4 e adicionadas ao meio celular, as partículas começaram a agregar e gradualmente afundaram no fundo dos poços. No entanto, 30 minutos depois, uma placa em branco óbvia apareceu em torno das células, e a lacuna das células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP tinha menos agregação de partículas do que a de 6MP-AuNPs (Fig. 3a). Além disso, mais nanopartículas foram observadas dentro das células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP em comparação com as células tratadas com 6MP-AuNPs.

Captação celular das nanopartículas. a Soluções de 6MP-AuNPs e 6MP-AuNPs-RDP de 0,25 μg / mL foram respectivamente ajustadas para pH 7,4 e adicionadas ao meio celular para uma incubação de 30 min. As partículas foram internalizadas em células SH-SY5Y ou precipitadas no fundo dos poços. b Diagrama esquemático de AuNP modificado com peptídeo marcado com 6MP e fluorescência. Depois que as células SH-SY5Y foram incubadas com as partículas por 2 h, as imagens foram tiradas ( c ) e intensidade de fluorescência ( d ) foi medido. Os dados são apresentados como média ± SEM. Os valores foram calculados em média para quatro experimentos independentes. ^** p <0,01 em comparação com as células tratadas com 6MP-AuNPs-SP

Para identificar ainda mais que as partículas poderiam entrar nas células neuronais, os peptídeos marcados com fluorescência foram conjugados com as partículas (Fig. 3b). Após 2 h de incubação das células com essas nanopartículas, uma fluorescência forte foi observada nas células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP, enquanto uma fluorescência verde relativamente fraca era visível nas células tratadas com 6MP-AuNPs-SP. (Fig. 3c). O resultado da medição da intensidade de fluorescência com espectrômetro de fluorescência (Hitachi Ltd. Co. Tóquio, Japão) mostrou que as células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP tinham intensidade de fluorescência significativamente maior do que as células tratadas com 6MP-AuNPs-SP (Fig. 3d ), sugerindo que RDP, um tipo de peptídeos de penetração celular (CPPs), poderia aumentar a eficiência de absorção celular da partícula.

Efeitos das nanopartículas no crescimento neuronal

Para examinar se as partículas tiveram efeitos no crescimento neuronal, o ensaio de MTT e a contagem de células foram usados para medir a atividade metabólica celular e os números após a incubação das células com as partículas por 24 h. Os resultados indicaram que RDP sozinho não afetou o crescimento celular, enquanto 6MP-AuNPs-RDP e 6MP-AuNPs na respectiva concentração acima de 0,125 e 0,5 μg / mL, aumentaram a atividade metabólica celular e o número de células de uma forma dependente da dose (Fig. 4a, b). Além disso, células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP mostraram maior atividade metabólica do que células tratadas com 6MP-AuNPs, o que provavelmente estava relacionado à maior eficiência de penetração celular de 6MP-AuNPs-RDP do que 6MP-AuNPs.

As partículas aumentaram a atividade metabólica celular ( a ) e números ( b ), e a concentração de 6MP-AuNPs e 6MP-AuNPs-RDP variou de 0 a 1,0 μg / mL. Os dados são apresentados como média ± SEM. As células com apenas solvente {0,1 M NaOH (pH 9,0) é ajustado para pH 7,4 por 0,1 M HCl} foram usadas como controle. Os valores foram calculados em média para quatro experimentos independentes. ^* p <0,05, ^** p <0,01 em comparação com células tratadas com RDP, ^# p <0,05 e ^## p <0,01 em comparação com as células tratadas com 6MP-AuNPs

Efeitos das nanopartículas no comprimento da neurita

Além de as partículas poderem aumentar a atividade metabólica celular, o impacto das partículas no comprimento da neurita também foi observado em altas concentrações (1 μg / mL) das partículas. As imagens (Fig. 5a) mostraram que as nanopartículas agregadas assentaram no fundo dos poços, e uma área de placa em branco maior apareceu em torno das células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP.

As nanopartículas promoveram o crescimento de neurites. Imagens ( a ) e comprimento da neurite ( b ) após as células terem sido tratadas respectivamente com RDP, 6MP-AuNPs e 6MP-AuNPs-RDP por 24 h. As células com apenas solvente foram utilizadas como controle. Os valores foram calculados em média para 200 neurites. ^* p <0,05 e ^** p <0,01 em comparação com o controle

Após a incubação de 24 horas, os resultados mostraram que as células tratadas com as partículas tinham neurita mais longa do que as células de controle, enquanto não houve diferença significativa entre as células tratadas com RDP e o controle. Além disso, a neurite de células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP foi notavelmente mais longa do que a das células tratadas com 6MP-AuNPs (Fig. 5b).

A partir do resultado da Fig. 5, 6MP matou todas as células SH-SY5Y devido à sua citotoxicidade; portanto, não usamos 6MP para revestir a placa. Além disso, conforme exibido pelas Figs. 3, 4 e 5, quantidade relativamente pequena de 6MP-AuNPs entraram nas células, e tanto o comprimento da neurite quanto o número de células foram obviamente menores do que 6MP-AuNPs-RDP. Portanto, 6MP-AuNPs-RDP foi escolhido para o estudo adicional para examinar o efeito no crescimento celular.

Proliferação celular e crescimento de neurito após administração repetida de 6MP-AuNPs-RDP

Para identificar ainda mais os resultados de 6MP-AuNPs-RDP na proliferação celular e crescimento de neurita, 6MP-AuNPs-RDP foram adicionados ao meio celular por três vezes nos dias 1, 2 e 3 após a cultura das células em placas de 6 poços (dia 0). Os resultados mostraram que o comprimento da neurita das células tratadas com partículas tornou-se obviamente maior do que o do controle (Fig. 6a, b), e a atividade metabólica da célula aumentou quando as células foram tratadas com as partículas (Fig. 6c).

A nanopartícula induziu a proliferação celular e o crescimento de neurites. a imagens de células nos dias 1, 2, 3 e 4. b Comprimentos de neurita de células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP e o controle. Os valores foram calculados em média para 200 neurites. ^** p <0,01 em comparação com o controle. c Atividade metabólica de células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP. As células receberam tratamento três vezes uma vez ao dia durante 3 dias. No primeiro momento, 6MP-AuNPs-RDP foi adicionado ao meio celular após as células terem sido cultivadas por 24 horas a partir do transplante celular. Cada concentração das partículas foi de 0,25 μg / mL. d Imagens do crescimento de neurites das células no revestimento de superfície com 6MP-AuNPs-RDP. 6MP-AuNPs-RDP foi semeado no fundo de placas de cultura de 3,5 cm de diâmetro e, em seguida, as células foram transplantadas nas placas. e O comprimento da neurite foi medido em 0 ~ 3 dias. As células com apenas solvente foram utilizadas como controle. Os valores foram calculados em média para 200 neurites. ^** p <0,01 comparado com o controle, ^* p <0,05, ^** p <0,01 em comparação com as células do dia 1. A seta azul aponta para os neuritos representativos

Para examinar o efeito de 6MP-AuNPs-RDP no crescimento de neurita quando a partícula foi usada como um material de revestimento de superfície, o fundo das placas de cultura foi revestido com 6MP-AuNPs-RDP e, em seguida, as células foram transpladas nos revestimentos. As imagens mostraram que as partículas rapidamente aderiram à membrana celular (Fig. 6d), depois as partículas foram internalizadas e distribuídas em todas as células, incluindo citoplasma, membrana nuclear e núcleo celular. Os resultados também mostraram que as células tratadas com partículas tinham neuritos significativamente mais longos do que o controle (Fig. 6e).

Efeitos da nanopartícula no crescimento celular após armazenamento congelado

Para examinar a tolerância das células às partículas e identificar se as células mantiveram a capacidade proliferativa após o estado de crescimento destacado, as células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP foram congeladas e armazenadas por vários dias quando atingiram a fase de crescimento exponencial. Em seguida, as células foram recuperadas e cultivadas em placas de 24 poços (Fig. 7a). Os resultados mostraram que o número de células tratadas com partículas aumentou significativamente e as neurites tornaram-se mais longas do que o controle (Fig. 7b, c), sugerindo que o crescimento das células tratadas com partículas não poderia ser afetado por um processo de congelamento e recuperação .

A nanopartícula aumentou o comprimento da neurite e o número de células após o armazenamento congelado. ( a ) As células foram tratadas com 6MP-AuNPs-RDP (1,0 μg / mL) antes do armazenamento e as células foram recuperadas e continuadas a cultura por 3 dias. Comprimento da neurita ( b ) e números de celular ( c ) de células tratadas com 6MP-AuNPs-RDP aumentaram significativamente após o armazenamento. As células com apenas solvente foram utilizadas como controle. Os dados são apresentados como média ± SEM. ^** p <0,01 em comparação com o controle. A seta azul aponta para os neuritos representativos

Discussão

AuNPs têm mostrado grande potencial de aplicações em vários campos da química, física, materiais, biologia, medicina e áreas interdisciplinares relacionadas. A fim de estabilizar a estrutura de AuNPs, mais frequentemente ligantes modificados com tiol foram usados como agentes estabilizadores que poderiam se ligar à superfície de AuNPs pela formação de ligações Au-S. No estudo, grupos tiol de 6MP e RDP foram conjugados com a superfície de AuNPs, e a estrutura da partícula era estável e poderia ser usada para estudos posteriores.

Como pode ser visto a partir dos resultados, as partículas possuíam uma propriedade ácido-base óbvia, que estava relacionada à dissociação do grupo N (9) -H da molécula de 6MP que ocorreu em uma faixa de pH de 10,4 ~ 11,2 em solução, e a agregação ocorreu quando o valor de pH da solução 6MP-AuNP estava abaixo de 6. A protonação de N9 da molécula 6MP neutralizou 6MP-AuNPs com valor de pH inferior a 6, e então, as interações intermoleculares (interações de empilhamento de base) ficaram muito fortes e compensadas a repulsão eletrostática. Após a modificação do RDP, as partículas apresentaram comportamento ácido-base mais complexo porque o pI do tiol-RDP foi cerca de 11,5 além da propriedade ácido-base de 6MP-AuNPs. Na titulação, o valor pI de 6MP-AuNPs-RDP foi de 7,8, próximo à condição fisiológica (pH 7,4). Assim, 6MP-AuNPs-RDP e 6MP-AuNPs podem precipitar a partir do meio celular.

Neste estudo, identificamos que o RDP melhorou a captação celular de 6MP-AuNPs, o que foi consistente com os estudos anteriores. É comumente conhecido que RDP é um peptídeo longo consistindo de 39 aminoácidos, que é derivado da glicoproteína do vírus da raiva que tem a capacidade de transportar macromoléculas estranhas para as células neuronais [15, 16]. Em nosso estudo anterior, a eficiência de captação de células de nanoclusters de ouro foi significativamente aumentada quando os nanoclusters foram conjugados com RDP [17]. O mecanismo de penetração de RDP nas células pode estar associado à endocitose mediada por receptor de ácido γ-aminobutírico (GABA) da membrana celular neural ou receptor de acetilcolina nicotínico [18, 19].

O estudo também sugeriu um efeito oposto do 6MP-AuNPs-RDP em relação ao 6MP que o 6MP-AuNPs-RDP promoveu a proliferação celular e o crescimento de neuritos, mostrando óbvia atividade neurológica. O mecanismo desta diferença distintiva de 6MP-AuNPs-RDP e 6MP pode estar associado à estrutura química de 6MP (um derivado de purina do grupo tiol C6) [20]. Na superfície de 6MP-AuNPs-RDP, o grupo tiol de 6MP estava envolvido na ligação com AuNPs e, portanto, bloqueado. Portanto, o grupo purina foi exposto na superfície da partícula. É bem aceito que a purina desempenha um papel vital na promoção do crescimento neuronal (como diferenciação celular, formação e extensão de neuritos, sinaptogênese) por meio de vias de sinalização purinérgica intracelular [21, 22], incluindo proteína quinase ativada por mitogênio / proteína regulada por sinal extracelular vias da quinase (MAPK / ERK) e fosfatidilinositol 3-quinase / serina-treonina quinase Akt (PI3K / Akt) (as mesmas vias induzidas por neurotrofinas e citocinas) [23]. Portanto, a purina de 6MP-AuNPs-RDP pode estar contribuindo para os efeitos de proliferação celular e crescimento de neurites.

Deve-se ressaltar que as células SH-SY5Y apresentaram boa tolerância excelente ao 6MP-AuNPs-RDP. Quando as células tratadas com partículas receberam administração repetida das partículas ou recuperação do armazenamento congelado, mesmo quando as células cresceram na superfície revestida com as partículas, elas ainda mantêm atividade proliferativa, sugerindo que o 6MP-AuNPs-RDP deve ter o potencial para aplicativo.

Conclusões

Aqui, sugerimos que AuNPs modificados com 6MP e RDP poderiam efetivamente promover a proliferação celular e o crescimento de neurites. Devido à excelente biocompatibilidade e biossegurança das nanopartículas, elas são um biomaterial promissor que pode ser utilizado como nanomaterial neurológico para o crescimento neuronal.

Abreviações

6MP:: 6-mercaptopurina
AD:: Doença de Alzheimer
AuNPs:: Nanopartículas de ouro
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
DMEM:: Meio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO:: Dimetilsulfóxido
FCS:: Soro fetal de bezerro
MTT:: Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio
PD:: Mal de Parkinson
RDP:: Peptídeo derivado do vírus da raiva
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

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