Nanopartículas de maghemita atuam como nanozimas, melhorando o crescimento e a tolerância ao estresse abiótico em Brassica napus

Resumo

Γ-Fe estabilizado por dopagem de ítrio ₂ O ₃ nanopartículas foram estudadas quanto ao seu potencial para servir como fertilizante para plantas e, por meio da atividade enzimática, apoiar o gerenciamento do estresse hídrico. Os níveis de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica, após a seca, foram reduzidos quando γ-Fe ₂ O ₃ nanopartículas foram distribuídas por irrigação em uma solução nutritiva para Brassica napus plantas cultivadas no solo. O peróxido de hidrogênio foi reduzido de 151 para 83 μM g ⁻¹ em comparação com o controle, e a formação de malondialdeído foi reduzida de 36 para 26 mM g ⁻¹ . A taxa de crescimento das folhas aumentou de 33 para 50% em comparação com plantas totalmente fertilizadas e as medições SPAD de clorofila aumentaram de 47 para 52, sugerindo propriedades agronômicas aprimoradas pelo uso de γ-Fe ₂ O ₃ nanopartículas como fertilizante em comparação com o ferro quelado.

Histórico

A segurança alimentar é de suma importância e uma questão urgente de nosso mundo em mudança. A mudança do clima e o crescimento da população estão levando os cientistas de plantas e engenheiros agrícolas a inovar em ferramentas aprimoradas para garantir a produção de alimentos com menos impacto ambiental. Nanotecnologias são uma das novas ferramentas que podem ser exploradas para resolver este problema de longa data [1,2,3]. Prevê-se que a nanotecnologia se torne uma parte importante e integrante da cadeia de produção de alimentos, servindo, por exemplo, um papel na proteção de culturas [4,5,6], fertilizantes [7, 8], biossensores e agricultura de precisão [9], e embalagem e segurança de alimentos [10]. As nanopartículas são onipresentes na natureza e as plantas evoluíram expostas a várias nanopartículas [11]. Nanopartículas de óxido de ferro (IONs) constituem uma parte importante das nanopartículas de ocorrência natural [12]. Há evidências de que as plantas e os micróbios do solo produzem IONs [11, 13, 14]. Enquanto alguns pesquisadores têm se preocupado com a toxicidade para as plantas de IONs modificados [15, 16], outros se concentraram na possibilidade de usar IONs como fertilizante [17,18,19,20,21,22]. Nanopartículas magnéticas de magnetita Fe ₃ O ₄ e maghemita γ-Fe ₂ O ₃ estrutura têm sido sugeridos como sendo nanozimas eficazes tanto da capacidade mimética da peroxidase (em pH baixo) quanto da capacidade mimética da catalase (em pH neutro) [23,24,25]. Foi demonstrado que, em certas concentrações, o nano óxido de ferro aumenta o crescimento da planta em comparação com a adição de quantidades equivalentes de íons ferrosos na forma quelatada [17]. Nossa hipótese é que as habilidades enzimáticas do nano óxido de ferro podem estimular o crescimento em plantas acima do que ocorre apenas com a fertilização com ferro. Além disso, sugerimos que isso deve ajudar as plantas durante estresses abióticos comuns, como a seca, onde a catalase e a peroxidase se tornam importantes para a eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS) sendo liberadas. Aqui, apresentamos investigações para testar esta hipótese em γ-Fe ₂ O ₃ e colza, cultivada em solo e ambiente controlado.

Resultados

Efeito das partículas nas características da planta

Ao adicionar IONs, aumentamos o crescimento da colza em comparação com apenas adicionar uma quantidade adequada de ferro quelatado. O comprimento da folha mostrou um aumento estatisticamente significativo em comparação com o controle, sugerindo um aumento na divisão celular ou no alongamento celular (Fig. 1a). Antes das plantas serem submetidas à seca, houve um aumento estatisticamente significativo no conteúdo de clorofila medido pelo medidor SPAD, sugerindo um aumento da aptidão dessas plantas em comparação com o controle (Fig. 1b).

Diferentes parâmetros fisiológicos de plantas cultivadas em vasos com solo irrigado com nutrientes ou nutrientes contendo IONs. a O comprimento da folha individual aumenta de antes até depois de 5 dias de tratamento com ION ( n =16, p valor =0,053). b Conteúdo de clorofila nas folhas, medido com medição SPAD ( n =16, p valor =0,000). Letras diferentes significam diferença estatisticamente significativa

A perda de água não apresentou diferença estatisticamente significativa, mas houve uma tendência de maior retenção de água nos tratamentos com IONs (Fig. 2a). Pesos frescos, que também levam em consideração o crescimento das plantas, sempre apresentaram valores mais elevados para os tratamentos com ION (Fig. 2b) e foram estatisticamente significativos em alguns casos. Por exemplo, um experimento com seca prolongada pode ser visto na Fig. 3.

Parâmetros da planta após estresse hídrico. a Porcentagem do peso da planta que constitui água. b Biomassa vegetal após 5 dias de seca ( n =8, p valor =0,127). Letras diferentes significam diferença estatisticamente significativa

Peso fresco das plantas, medido após 5 dias de seca. Diferença estatisticamente significativa com 15 réplicas biológicas e p valor 0,01

Considerando que o controle também possui quantidade adequada de ferro, grandes diferenças no peso fresco seriam excepcionais. Foi observado que as plantas tratadas com IONs lidaram melhor que o controle durante a seca e se recuperaram melhor após a reidratação (Fig. 4).

Fotos de plantas após a reidratação, após 5 dias de estresse hídrico. a Controle de plantas irrigadas com solução nutritiva. b Plantas irrigadas com solução nutritiva contendo 0,8 mg / ml de IONs. c Plantas irrigadas com solução nutritiva contendo 2 mg / ml de IONs

Efeitos dos IONs na concentração de peróxido de hidrogênio na folha

A quantidade de peróxido de hidrogênio na folha após a seca foi substancialmente reduzida quando IONs foram adicionados à solução nutritiva usada para regar. A variação foi alta no 0,8 mg ml ⁻¹ tratamento; portanto, a diferença em relação aos outros tratamentos não é estatisticamente significativa. No entanto, a diferença entre o controle e a concentração mais alta de 2 mg ml ⁻¹ é estatisticamente significativo com um p valor de 0,004 e uma média 84% maior no tratamento controle (Fig. 5).

Quantidade de peróxido de hidrogênio solúvel por grama de tecido foliar de colza tratada com solução nutritiva contendo IONs e desafiada com seca por 5 dias ( n =16, p valor =0,004)

Efeitos dos IONs na peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica com níveis de MDA como proxy foi reduzida pela adição de IONs, com concentração média 36% menor de MDA nas folhas das plantas com 200 mg de IONs adicionados. Adicionamos um controle positivo com a mesma concentração molar de íons ferro (III); no entanto, a variação era muito grande para tirar qualquer conclusão. A média da concentração inferior de ION também foi menor do que o controle, mostrando uma tendência à redução da peroxidação lipídica nas folhas da colza (Fig. 6).

Concentração do produto de peroxidação lipídica MDA nas folhas de colza tratada com solução nutritiva contendo IONs e seca por 5 dias ( n =8, p valor =0,052)

Absorção de partículas por planta

Para investigar a absorção de partículas no tecido foliar, medimos o conteúdo de ferro das folhas com espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES). De fato, um aumento estatisticamente significativo de ferro foi observado em tratamentos com nanopartículas de maghemita. Curiosamente, a concentração de ferro foi reduzida em folhas irrigadas com íons de ferro (III) supérfluos (Fig. 7).

Concentração de ferro nas folhas das brássicas após tratamento com nanopartículas de maghemita, em comparação ao controle com a mesma solução nutritiva ou a mesma solução nutritiva com proporção de 1:1 M de íons ferro (III). Letras diferentes significam diferença estatisticamente significativa ( n =15)

Para corroborar ainda mais o aumento do teor de ferro como prova de absorção de partículas, medimos a magnetização de baixa temperatura nas mesmas folhas. Uma magnetização maior foi observada no controle sob forte campo magnético, mas sem campo magnético, a magnetização remanescente foi maior nas folhas tratadas com nanopartículas de maghemita (Figs. 8 e 9). Devido ao pequeno tamanho da amostra e grande variação, as diferenças não são estatisticamente significativas, mas a tendência mostra claramente a presença de IONs superparamagnéticos, uma vez que a magnetização é maior no controle sob campos magnéticos elevados, mas menor quando não há campo magnético. É obscurecido pela variação, mas em certas amostras, a presença de IONs era claramente visível (arquivo adicional 1:Figura S2). Por um lado, em temperatura baixa o suficiente e em campo magnético alto o suficiente, a magnetização dos íons de ferro será maior do que a dos IONs ferrimagnéticos. Por outro lado, na mesma temperatura baixa, mas no campo magnético zero, a magnetização remanente será maior para os IONs devido aos momentos magnéticos das nanopartículas bloqueadas.

Magnetização de baixa temperatura (2 K) de folhas queimadas de plantas tratadas com nanopartículas de maghemita em comparação com plantas controle. As barras de erro mostram o erro padrão da média ( n =6)

Magnetização de baixa temperatura (2 K) de folhas queimadas sob diferentes campos magnéticos. O gráfico acima em 10000 Oe tem um p valor de 0,8, e o gráfico abaixo no campo zero tem um p valor de 0,08 ( n =6)

Caracterizações de materiais

Os IONs produzidos pelo método de Cui et al. (2013) formaram um gel, indicando uma produção bem-sucedida de nanopartículas da ordem de ~ 1–10 s nm. O gel seco foi moído em pó. O SEM de baixa resolução não pode mostrar partículas individuais, mas a estrutura hierárquica do pó é evidente; o EDS da amostra não detectou nenhum Y, apenas ferro (fig. 7).

Quando dispersas em água, as partículas formam agregados, com tamanho hidrodinâmico de até 500 nm, porém 84% das partículas agregadas são menores que 300 nm e pelo menos 11% são menores que 50 nm. Em valores absolutos, de acordo com as medições da Nanosight, existem 4,28 × 10 ⁶ partículas menores que 20 nm ml ⁻¹ , na dispersão diluída 50 vezes necessária para a medição (Fig. 8). Calculando de volta, isso significa que existem aproximadamente 2 × 10 ⁸ partículas menores que 20 nm ml ⁻¹ nos tratamentos.

As imagens feitas por AFM mostram um padrão semelhante ao NTA combinado com XRD vide infra, com tamanhos de partículas de alguns nanômetros a agregados de várias centenas de nanômetros (Fig. 9).

O XRD das partículas foi adquirido 1 ano após a produção e ainda mostra um padrão claro de estrutura de maghemita, evidência de estabilização de maghemita com sucesso (Fig. 10). O tamanho do cristalito foi calculado em 3,8 nm pelo uso da equação de Scherrer. Mesmo que a estrutura seja conservada, a introdução de 13% de Y em peso, é claro, afeta os estados vibracionais dos átomos (Arquivo adicional 1:Figura S3).

Varredura de imagem eletrônica de γ-Fe ₂ O ₃ sintetizado através da síntese sol-gel dirigida por ítrio e um espectro de EDS do mesmo material

Discussão

O uso proposto de IONs como fertilizante de ferro foi investigado anteriormente em outros sistemas [17,18,19]. Nesta investigação, foi testado pela primeira vez se existe um efeito enzimático de um fertilizante semelhante, além do efeito de fornecer o micronutriente, o ferro, a uma importante espécie de cultivo. O controle recebeu uma quantidade adequada de ferro quelado. Também testamos um controle positivo, no qual uma quantidade equivalente molar de íons ferro (III) foi suplementada ao controle negativo com uma quantidade adequada de ferro disponível na planta. Conseqüentemente, os efeitos positivos dos IONs vistos em nossos experimentos surgem das propriedades dos IONs. Gostaríamos de sugerir que são os efeitos enzimáticos conhecidos dos IONs que estão em jogo [23, 25, 26]. Outros mecanismos ainda não podem ser excluídos - IONs também podem interagir com proteínas, lipídios e outras biomoléculas [27], ou pode ser que as nanopartículas absorvem íons de ferro nativos na superfície e, portanto, reduzem as reações de Fenton prejudiciais. O fato de que os níveis de peróxido de hidrogênio das folhas foram reduzidos nos tratamentos com ION é em si uma prova indireta da absorção de nanopartículas. Junto com o aumento da concentração de ferro e a alteração da magnetização na maghemita, a imagem se torna mais completa. O controle positivo com íons ferro (III) apresentou concentração reduzida de ferro nas folhas, indicando que as plantas têm capacidade de reduzir a captação de íons ferro como mecanismo de defesa. Isso sugere ainda que o aumento da concentração de ferro nas folhas em tratamentos de maghemita são, de fato, nanopartículas, que não são tão tóxicas para a planta quanto os níveis elevados de íons de ferro podem ser. As medições magnéticas mostram um comportamento superparamagnético e bloqueia os momentos magnéticos das nanopartículas a baixa temperatura típica de γ-Fe ₂ muito pequeno O ₃ nas folhas tratadas com maghemita [28], demonstrando claramente a captação de nanopartículas. A minúscula quantidade de Y administrada não deve produzir nenhum efeito nas plantas; pouco se sabe sobre os efeitos do Y nas plantas, mas Fu et al. (2014) estabeleceu que 2 mg L ⁻¹ Y foi a dose letal mediana (DL50) em um sistema hidropônico, e Maksimovic et al. (2014) começou a ver efeitos tóxicos em 10 ⁻⁵ mol L ⁻¹ Y [29, 30]. Na maior concentração usada em nossos experimentos, uma quantidade aproximada de 50 mg (5,6 10 ⁻⁴ mol) de Y foi adicionado por vaso por irrigação ao solo, do qual apenas uma fração pode ser retirada. O que é absorvido não deve estar prontamente disponível como íons, mas sim ser ligado às partículas de maghemita. O objetivo da introdução do Y na síntese é reduzir a solubilidade das nanopartículas de maghemita e também prevenir a transformação em hematita, uma forma menos enzimática do óxido de ferro. Sem dúvida, é benéfico aumentar a atividade da catalase durante as condições de estresse [31], uma vez que toda uma gama de condições de estresse é conhecida por causar acúmulos tóxicos de H ₂ O ₂ [32] _. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que H ₂ O ₂ também servem como uma molécula de sinalização para o estresse [32, 33]. O aumento da produção de biomassa ainda não foi comprovado, de preferência olhando também para o rendimento e a qualidade das oleaginosas. Outras características, como maior velocidade de crescimento das folhas, uma propriedade muito boa em ambientes agrícolas onde a competição com ervas daninhas é crucial, podem ser prontamente levadas em consideração. Foi mostrado em Arabidopsis que as partículas de ferro nano zero valentes podem induzir a extrusão de prótons no apoplasto das folhas e, assim, permitir a expansão da parede celular impulsionada pelo turgor [34]. O mesmo efeito também foi observado nas raízes, o que também pode ser benéfico durante o estresse hídrico [35]. Eles também observaram um aumento nas aberturas estomáticas das folhas que podem levar à perda de água, mas quando mediram, houve apenas uma diferença marginal em relação ao controle. É um paradoxo conhecido que a relação entre a abertura estomática e a transpiração da água não é linear [36]. Esta relação também é altamente afetada pelo ambiente, por exemplo, umidade relativa ou vento [37]. Embora nanopartículas de valência zero não devam ser consideradas iguais à maghemita, o mecanismo de alongamento da folha visto em nossos experimentos deve ser investigado. Ghafariyan et al. (2013) observaram, como fizemos, um aumento na concentração de clorofila nas folhas após a adição de IONs em comparação com um controle negativo sem ferro. Quando comparados ao ferro quelado, não houve diferença. No entanto, a adição de quantidades iguais de ferro quelado como IONs resultará em mais ferro disponível na planta, uma vez que, no caso de partículas, grande parte do ferro é armazenada nas estruturas cristalinas. Portanto, existe a possibilidade de que as plantas apenas fertilizadas com IONs estejam realmente sofrendo de deficiência de ferro. Encontramos maiores quantidades de clorofila nas folhas (de acordo com as medições SPAD, ver Fig. 1) quando IONs foram adicionados como auxiliares ao ferro quelado. Também medimos uma quantidade reduzida de peróxido de hidrogênio e MDA nas folhas, após a seca, quando adicionamos IONs. Rui et al. (2016) não mediu o peróxido de hidrogênio, mas o MDA e as enzimas relacionadas ao estresse oxidativo. Eles sugeriram que o estresse oxidativo não ocorre com a adição de IONs e, de fato, eles também encontraram uma quantidade reduzida de MDA nas folhas, em comparação com o ferro quelado, em 10 mg kg ⁻¹ concentração. Nas raízes, eles observaram uma redução do MDA à medida que aumentaram a concentração de IONs. Eles também mediram uma quantidade reduzida de superóxido dismutase e atividade da peroxidase em comparação com o ferro quelado, sugerindo que nossa hipótese de que os IONs podem funcionar como captadores de oxigênio reativos, in vivo, pode estar certa. A eliminação reativa de oxigênio foi ainda demonstrada por nossa redução medida de peróxido de hidrogênio nas folhas de Brassica napus . Isso explica o aumento da resistência à seca que é observado com a adição de IONs.

Conclusões

Nossos experimentos forneceram evidências para o mecanismo de IONs agindo como nanozimas in planta , revelando acoplamento entre uma diminuição no conteúdo de peróxido de hidrogênio nas folhas de Brassica napus e introdução de IONs. O aumento da resistência à seca que é observado com a adição de IONs pode, portanto, estar relacionado ao alívio do estresse oxidativo.

Métodos

Condições experimentais e design

Brassica napus sementes, da variedade de colza primavera Larissa (Scandinavian Seed AB, Lidköping, Suécia), foram esterilizadas e germinadas em placas de ágar por 3 dias antes que mudas de tamanhos semelhantes fossem transferidas para vasos com solo S esterilizado (jardim de Hasselfors, Örebro, Suécia) . É um solo para o crescimento profissional de mudas com baixa quantidade de todos os macro e micronutrientes, perlita para aeração, ácidos húmicos estimuladores do crescimento e pH 6. As plantas puderam se estabelecer em vasos por 7 dias, irrigadas com desionizada agua. Antes do início dos tratamentos, as plantas foram distribuídas entre bandejas, para que o tamanho das plantas fosse o mais consistente possível. A partir do sétimo dia, após transferência para vasos, as plantas foram irrigadas com solução nutritiva, solução nutritiva com FeCl extra ₃ ou solução nutritiva com diferentes concentrações de γ-Fe ₂ O ₃ IONs. Cada vaso foi irrigado com 40 ml todos os dias. As plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento com luz de 16 h (180 μE m ⁻² s ⁻¹ ) e escuridão de 8 horas. A temperatura foi ajustada para 25 ° C durante a irradiação e 22 ° durante a escuridão e a umidade relativa para 65%. As plantas foram cultivadas em vasos de 8 x 8 cm em bandejas contendo oito vasos cada. Cada tratamento teve duas bandejas e 16 repetições biológicas. As bandejas foram movidas em ordem rotativa todos os dias para compensar qualquer variação na câmara. O tratamento durou 5 dias adicionando no total 200 ml de 0,5, 0,8, 1 ou 2 mg ml ⁻¹ , totalmente 100, 160, 200 ou 400 mg por planta, respectivamente. Após 5 dias de adição de IONs, todos os tratamentos foram regados com solução nutritiva (Arquivo Adicional 1:Tabela S1), por mais 5 dias antes do início de 4 dias de seca. Após 4 dias de seca, foram realizadas medições de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica e as plantas foram novamente regadas com a mesma solução nutritiva por 3 dias para estudar a recuperação. O experimento foi repetido quatro vezes.

Síntese e caracterização de nanopartículas

As partículas de maghemita foram produzidas de acordo com o método de [38] com aproximadamente 13% de peso de ítrio (Y) e caracterizadas por difração de raios-X (XRD), microscopia eletrônica de varredura (MEV), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), espectroscopia de infravermelho (FTIR), análise termogravimétrica (TGA) e microscopia de força atômica (AFM). As imagens do MEV foram adquiridas com um Hitachi TM1000, com espectrômetro de raios-x dispersivo de elétrons Oxford μDeX (EDS). O tamanho hidrodinâmico foi medido por meio de análise de rastreamento nano (NTA) no Nanosight 300 (Fig. 11). Um Perkin-Elmer Spectrum 100 foi usado para fazer espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) em pelotas de brometo de potássio (KBr). Para análise termogravimétrica (TGA), foi usado um Perkin-Elmer Pyris 1 e para microscopia de força atômica (AFM), um Bruker FastScan (Fig. 12). O XRD foi realizado em um difratômetro multifuncional Bruker Smart ApexII com fonte de molibdênio; o tamanho do cristalito foi calculado com a equação de sherrer usando o maior pico no ângulo 2θ ° 16,197 com uma largura total metade máxima (FWHM) de 1,01358489355378 calculado pela função localizador de pico do software Origin (Fig. 13). Os IONs secos foram suspensos em uma solução nutritiva, com 3,4 mg L ⁻¹ ferro quelado, o mesmo usado como controle. Para uma lista completa de todos os nutrientes, consulte o arquivo adicional 1:Tabela S1.

Distribuição hidrodinâmica do tamanho das partículas na água, conforme medido por NTA, de γ-Fe ₂ O ₃ sintetizado através da síntese sol-gel dirigida por ítrio. Os valores são calculados a partir de quatro medições repetidas, e a área dentro das linhas finas representa o erro médio

Nanopartículas de maghemita sintetizadas através de sol-gel dirigido com ítrio, dispersas em wafer de silício e fotografadas com AFM. A mesma imagem é representada em 3D e 2D

Um difractograma de pó das nanopartículas de maghemita produzidas. Os picos se alinham com as posições da maghemita padrão do banco de dados visto como um ponto com linha de queda na base da figura. O tamanho do cristalito foi calculado a partir do maior pico em 16,197 2 θ ângulo de graus

Medições de características da planta

Antes de o tratamento ser iniciado, o comprimento da folha mais longa, a primeira folha verdadeira, em cada planta foi medido. Posteriormente, após 5 dias de irrigação sequencial com IONs em solução nutritiva ou solução nutritiva sozinha, a mesma folha foi medida novamente. Os resultados são relatados como aumento percentual. A clorofila foliar foi avaliada por medidas SPAD com medidor SPAD Minolta, antes durante e após o tratamento e, posteriormente, após a seca. Três medições, em duas folhas por planta, foram calculadas em média para cada uma das 16 repetições biológicas. Finalmente, a biomassa acima do solo de todas as plantas foi pesada e colocada em uma folha de alumínio para ser seca a 110 ° C por 72 h.

Conteúdo de ferro e medições magnéticas

Após cinco dias de seca, o experimento foi encerrado e todo o tecido vegetal acima do solo foi queimado a 450 ° C por 24 h. Após a homogeneização das cinzas, pesou-se 10 mg por amostra e dissolveu-se em 3 ml de ácido clorídrico 36% em um agitador durante a noite. Em seguida, as amostras foram diluídas com 44,74 ml de etanol a 10% em água Milli-Q e posteriormente medidas para ferro com ICP-AES a 238,204 nm. Para medições magnéticas, a mesma cinza foi colocada no porta-amostra e o peso exato de cada amostra foi pesado com uma balança de precisão. Em seguida, a amostra foi resfriada a 2 K, e uma varredura do campo magnético de 10.000 a 0 Oersted foi realizada em um magnetômetro de dispositivo de interferência quântica supercondutor (SQUID). O momento magnético devido ao suporte da amostra foi subtraído do momento magnético medido antes da normalização com o peso do ferro na amostra.

Medições de peróxido de hidrogênio

O peróxido de hidrogênio nas folhas foi medido pelo método eFOX relatado por [39]. As 16 plantas foram agrupadas em quatro repetições biológicas com quatro plantas cada. Cinquenta miligramas foram retirados da folha mais jovem e ainda fresca de cada planta. Em seguida, 200 mg do material foliar foi pulverizado em argamassa pré-resfriada em nitrogênio líquido. Ao pó, adicionamos 4 ml de tampão fosfato 100 mM (pH 6,9) e moldamos o gelo em um líquido homogêneo. Deste líquido homogêneo, transferimos 1.900 μl para um tubo Eppendorf de 2 ml e adicionamos 20 μl de sulfato de amônio ferroso 25 mM (sal de Mohrs), 20 μl de sorbitol 10 mM, 20 μl de laranja de xilenol 10 mM, 20 μl de 99 % de etanol e 20 μl de ácido sulfúrico 250 mM. Um espectro de absorbância visível completo foi obtido para cada amostra, mas a diferença entre 550 e 800 nm foi usada para a quantificação do peróxido de hidrogênio. Uma curva de calibração de 2 a 40 μM de peróxido de hidrogênio foi feita com R ² valor de 0,9946.

Peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi medida de acordo com o método de [40]. As amostras foram colhidas da mesma maneira que para as medições de peróxido de hidrogênio, exceto que foram homogeneizadas em 4 ml 0,1% w / v ácido tricloroacético (TCA). A absorbância foi medida a 532 nm e corrigida para turbidez não específica subtraindo a absorbância a 600 nm. O coeficiente de extinção de 155 mM cm ⁻¹ foi usado para calcular a concentração de malondialdeído (MDA).

Análise estatística

Todas as estatísticas foram realizadas no software Minitab 17. Todos os dados foram executados por meio de uma ANOVA de uma via com teste de Fisher para agrupamento. t do aluno teste foi realizado para encontrar p específico valores entre os grupos encontrados para ter diferenças estatisticamente significativas.

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