Nova entrega de mitoxantrona com nanopartículas de pululano modificadas hidrofobicamente para inibir as células cancerosas da bexiga e o efeito do tamanho do nanofármaco na eficiência da inibição

Resumo

Reduzir a dosagem de drogas quimioterápicas por meio do aumento da eficiência de entrega usando novas nanopartículas tem grande potencial para o tratamento do câncer. Aqui, nos concentramos em melhorar a entrega de mitoxantrona usando polímeros de pululano substituídos por colesterol (CHPs) e selecionamos um tamanho de nano-droga adequado para inibir o crescimento de células de câncer de bexiga. Sintetizamos três tipos de CHPs, denominados CHP-1, CHP-2, CHP-3. Suas estruturas químicas foram identificadas por RMN e o grau de substituição do colesterol foi de 6,82%, 5,78% e 2,74%, respectivamente. Seus diâmetros eram 86,4, 162,30 e 222,28 nm. Testamos a taxa de liberação de mitoxantrona em solução salina tamponada com fosfato por 48 h:a taxa de liberação foi de 38,73%, 42,35% e 58,89% para os três CHPs. O grau de substituição hidrofóbica no polímero foi associado ao processo de automontagem das nanopartículas, que afetou seu tamanho e, portanto, a taxa de liberação do fármaco. A liberação das três nanopartículas carregadas com a droga foi significativamente acelerada em meio de liberação de ácido. Quanto maior for a nanopartícula, maior será a velocidade de liberação do fármaco. Às 24 horas, o IC ₅₀ o valor foi de 0,25 M, para a melhor inibição de mitoxantrona em células de câncer de bexiga.

Experimentos com brometo de 3- (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT) demonstraram que nanopartículas CHP-3 carregadas com drogas com o maior tamanho foram as mais tóxicas para o câncer de bexiga células. A imunofluorescência e a citometria de fluxo revelaram que as nanopartículas CHP-3 carregadas com o fármaco com o maior tamanho tiveram o efeito mais forte na promoção da apoptose de células de câncer de bexiga. Além disso, as três nanopartículas carregadas com drogas poderiam inibir a migração de células MB49, com nanopartículas de CHP-3 de tamanho grande tendo a inibição mais poderosa.

Histórico

A quimioterapia é um tratamento comum para tumores. No entanto, devido à falta de especificidade do tecido, o efeito terapêutico da quimioterapia é limitado e freqüentemente tem fortes efeitos colaterais [1, 2]. Portanto, a pesquisa sobre o uso de preparações de nanopartículas (NP) para aumentar a capacidade alvo dos quimioterápicos aumentou [3,4,5].

Após direcionar passivamente os tecidos tumorais por meio do efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR), nano-drogas, como drogas antitumorais de pequenas moléculas carregadas com NP, exercem sua eficácia principalmente de duas maneiras:(1) sendo liberadas em tecidos tumorais e entrando células em uma forma livre para exercer eficácia e (2) por serem captadas por células na forma de micropartículas e liberadas na célula para exercer efeitos farmacodinâmicos [6, 7]. Quando um agente nanofarmacêutico é direcionado passivamente para um tumor, qual dos dois métodos desempenha um papel principal ou se ambos desempenham um papel principal ao mesmo tempo e se outros fatores estão envolvidos é uma questão complexa. Por causa da atividade metabólica dos tecidos tumorais, isquemia e hipóxia e o acúmulo de ácido láctico e porque o líquido extracelular dos tecidos tumorais mostra acidez fraca, muitos nano-drogas apresentam liberação aumentada em ambientes ácidos, para maior eficácia [8]. A eficiência de liberação de nano-drogas em um ambiente ácido está intimamente relacionada às propriedades físico-químicas dos nanomateriais e também é afetada pelo tamanho dos NPs [9,10,11]. Depois que os NPs visam passivamente o tecido tumoral, porque as células tumorais têm uma função de fagocitose, a preparação nanofarmacêutica entra nas células principalmente por meio de pinocitose e processos complexos mediados pelas proteínas da membrana celular [12, 13]. Sob a degradação das lisozimas intracelulares, os nanofármacos liberam drogas e exercem eficácia [14].

A eficiência de captação das células-alvo no tecido-alvo está intimamente relacionada às propriedades dos nanomateriais, modificação da superfície, morfologia, carga e tamanho do NP [15,16,17,18]. A captação celular depende em grande parte do tamanho do NP. A internalização (endocitose) de NPs Her-gold depende altamente do tamanho, a absorção mais eficaz ocorrendo em NPs na faixa de 25 a 50 nm [19]. NPs extremamente pequenos ou grandes terão absorção ineficiente. O tamanho de 40 a 50 nm é o ponto crítico para a endocitose mediada por receptor [20]. Além disso, o tamanho da NP afeta a citotoxicidade. Na comparação de NPs de 45 e 90 nm, o tamanho dos NPs de polímero está inversamente relacionado à citotoxicidade [21]. O tamanho dos NPs afeta a liberação da droga no tecido tumoral e também a eficiência de captação das células e, em última análise, desempenha um papel importante na eficácia da droga.

A adesão local de polissacarídeos melhora a localização e a função de direcionamento. O ambiente ácido das células cancerígenas externas leva a uma liberação parcial de nano-drogas polissacarídicas, desencadeando o duplo efeito terapêutico de NPs carregados de drogas e drogas livres após o direcionamento passivo de tecidos tumorais [22, 23].

O pululano, que não é tóxico, é facilmente degradado no corpo, e seu colesterol é uma substância intrínseca ao corpo, por isso é seguro e adequado como portador de drogas [24, 25]. Polímeros de colesteril pululano hidrofobicamente modificado (CHP), que têm grupos colesteril hidrofóbicos e cadeias de açúcar hidrofílicas, podem se automontar em estruturas semelhantes a nanosfera com núcleos centrais hidrofóbicos e conchas hidrofílicas [26, 27]. Polímeros anfifílicos se auto-agrupam em NPs em estruturas esferóides, com o núcleo hidrofóbico formado por grupos hidrofóbicos, como grupos colesteril [28].

A mitoxantrona, um antibiótico antraciclina ativo anticâncer de amplo espectro que pode intercalar o DNA e inibir a topoisomerase II, é uma droga antitumoral clássica. No entanto, devido à sua cardiotoxicidade, o uso de mitoxantrona é limitado. A mitoxantrona é carregada no centro hidrofóbico de NPs de CHP por interação hidrofóbica para formar preparações de nanômetro de CHP que têm um efeito de direcionamento passivo por meio do efeito EPR. Em comparação com drogas livres, os NPs CHP carregados com drogas mostram efeitos tóxicos reduzidos de drogas e aumento da eficiência anticâncer [29, 30]. O grupo hidrofóbico colesteril no polímero CHP conduz a formação da estrutura do núcleo do NP, e dentro de uma certa faixa, quanto maior o grau de substituição do grupo hidrofóbico, menor o tamanho do NP [31, 32]. A estabilidade dos CHPs foi superior em pelo menos 2 meses, sem alterações significativas de tamanho e potencial zeta, e as nanopartículas de pululano podem atingir o tecido tumoral para matar células cancerosas por efeito EPR [33, 34].

Neste estudo, utilizamos NPs de pululano (CHP) modificados hidrofobicamente com colesterol como carreadores de drogas antitumorais para carregar mitoxantrona. Tamanhos diferentes de NPs de pululano carregados com mitoxantrona foram gerados sintetizando polímeros CHP em diferentes razões de carga de éster de colesterol de anidrido succínico (CHS) para estudar o efeito do tamanho de NP na liberação sustentada de uma droga, liberação de droga em um ambiente ácido, toxicidade para câncer de bexiga células, eficiência de captação celular e migração celular. Este experimento avaliou a faixa de tamanho de NPs com direcionamento passivo para rastrear um NP adequado como um carreador de drogas e para uma maior eficiência de drogas.

Materiais e métodos

Reagentes e instrumentos

A mitoxantrona era da Aladdin Chemistry (Shanghai); a bolsa de diálise (BioSharp, EUA, 8000 ~ 12.000 Da) era da Tianjin Junyao Biotechnology. Outros reagentes eram da Beijing Xinze Technology.

Usamos o espectrofotômetro de fluorescência Japan F-4500, cromatógrafo de dicroísmo circular J-810 (Jasco Co., Japão), analisador de tamanho de partícula (MALVERN, Nano 2S-90, Japão) e um microscópio eletrônico de projeção (JEM-100CXII, Japão) .

Síntese e caracterização do polímero CHP e cálculo do grau de substituição do colesterol

A síntese de anidrido succínico CHS foi relatada anteriormente [35]. Uma quantidade de 0,5 g de amostra de pululano foi dissolvida em 15 mL de dimetilsulfóxido desidratado para reserva. CHS (unidade de açúcar / CHS =0,20, 0,15, 0,05 mmol / mmol), 4-dimetilpiridina (DMAP ∕ CHS =1 mmol / mmol) e cloridrato de 1- (3-dimetilaminop ropil) -3-etil-carbodiimida (EDC ∕ CHS =1,2 mmol / mmol) foram dissolvidos separadamente em 10 mL de DMSO, agitados à temperatura ambiente e ativados durante 1 h; a reação de ativação foi descartada na solução de pululano; e a reação foi interrompida após 48 h. A reação foi gotejada em 200 mL de etanol absoluto e, em seguida, formou-se um precipitado branco. A filtração foi por sucção e o produto foi lavado com quantidades apropriadas de etanol, tetra-hidrofurano e éter dietílico e depois seco a 80 ° C. Foram obtidos três tipos de polímeros CHP com diferentes graus de substituição do colesterol:CHP-1, CHP-2 e CHP-3 [36]. Polissacarídeo de pululano e polímero CHP 10–20 mg foram dissolvidos por DMSO-d6 sob condições ultrassônicas e ¹ Os espectros de H NMR foram examinados. O grau de substituição do colesterol no polímero CHP foi determinado com base nas ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6 e na área sob o pico de metileno.

Preparação e caracterização de NPs CHP carregados com droga

Síntese de NPs CHP carregados com mitoxantrona como descrito [37, 38], NPs carregados com droga foram obtidos por diálise com 40 mg de cada um dos três NPs CHP substituídos com vários graus de colesterol e 4 mg de mitoxantrona para backup. Os NPs carregados com droga recentemente preparados ou NPs carregados com droga dispersos em água destilada após a liofilização foram gotejados em uma grade de cobre com um filme de suporte de carbono, e o papel de filtro foi drenado. As grades foram colocadas em um dessecador, a seguir 2% ( w / w ) foi adicionado ácido fosfotúngstico (2%), que foi negativo após a secagem natural, e observado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) [38]. A solução de NPs carregados com droga recentemente preparados ou NPs carregados com droga dispersos em água destilada após a liofilização foi vertida em cuvetes e colocada em um analisador de tamanho de partícula para detecção. Cada amostra foi processada três vezes para obter um tamanho e potencial uniformes de NPs.

Medição da carga de drogas e eficiência de encapsulamento de NPs CHP carregados com drogas

O conteúdo de carga de droga (LC%) e a eficiência de encapsulação (EE%) de CHP NPs carregados com mitoxantrona foram medidos conforme descrito [31, 39] como segue:
$$ \ mathrm {EE} =\ frac {\ mathrm {O} \ \ mathrm {quantidade} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {droga} \ \ mathrm {em} \ \ mathrm {o} \ \ mathrm { NPs}} {\ mathrm {Total} \ \ mathrm {quantidade} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {Droga}} $$ $$ \ mathrm {LC} =\ frac {\ mathrm {The} \ \ mathrm { montante} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {Droga} \ \ mathrm {em} \ \ mathrm {o} \ \ mathrm {NPs}} {\ mathrm {O} \ \ mathrm {montante} \ \ mathrm {de } \ \ mathrm {NPs} \ \ mathrm {peso}} $$

Estudo de liberação de drogas

Os três tipos de NPs carregados com mitoxantrona foram colocados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em meio de liberação de pH =6,8 e 4,0. A liberação de mitoxantrona foi estudada in vitro por diálise, e a porcentagem de liberação acumulada (Q%) foi calculada conforme descrito [40].

Linhas celulares e condições de cultura

A linha celular de câncer de bexiga murina MB49 fornecida pelo Dr. P Guo (Instituto de Urologia, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi, China) foi cultivada em DMEM (Lonza) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan , UT, EUA) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em ar umidificado contendo 5% de CO ₂ .

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada por ensaio baseado em tetrazólio. Resumidamente, as células foram semeadas em 2 × 10 ⁴ por poço em placas de cultura de 96 poços e foram autorizados a anexar por 24 h. Diferentes densidades de semeadura foram otimizadas no início dos experimentos. As células foram tratadas com diferentes concentrações de mitoxantrona por 24 h em uma incubadora. Mitoxantrona a 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 μM foi dissolvida em DMEM suplementado com 1% de soro fetal bovino. Uma quantidade de 50 μL de sal de tetrazólio MTT (Sigma) dissolvido na solução balanceada de Hank a 2 mg / mL foi adicionada a cada poço com o tratamento indicado e incubado em um CO ₂ incubadora por 5 h. Finalmente, o meio foi aspirado de cada poço e 150 μL de DMSO (Sigma) foram adicionados para dissolver os cristais de formazan. A absorvância de cada poço foi obtida usando um leitor de placas Dynatech MR5000 no comprimento de onda de teste 490 nm e comprimento de onda de referência 630 nm.

IC ₅₀ os valores da mitoxantrona foram determinados por curvas de dose-resposta. As três concentrações de NPs (0,0625, 0,125, 0,25 μM) com três graus de substituição foram comparadas por MTT. O procedimento experimental foi igual ao da mitoxantrona.

Avaliação da apoptose

A taxa de apoptose celular foi determinada por citometria de fluxo com Anexina V-FITC / iodeto de propídio (PI). Resumidamente, as células tratadas foram lavadas duas vezes com PBS frio, em seguida, ressuspensas em tampão de ligação a 2 × 10 ⁶ células / mL de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 5 μL de anexina V-FITC e 5 μM de PI foram adicionados a uma suspensão de células de 100 μL e incubados por 30 min em temperatura ambiente no escuro. Depois de adicionar 300 μL de tampão de ligação, as células marcadas foram detectadas por citometria de fluxo dentro de 1 h.

Todas as células apoptóticas precoces (Anexina V-FITC-positivas [coradas em verde], PI-negativas), células necróticas (Anexina V-FITC-negativas, PI-positivas), células apoptóticas tardias (duplo positivo), bem como células vivas ( duplo negativo) foram detectados por citometria de fluxo (FCM) e analisados ​​usando o software Cell Quest (Becton Dickinson). O comprimento de onda de excitação do laser de argônio foi de 488 nm e o comprimento de onda de emissão 530 nm (canal FL-1) para isotiocianato de fluoresceína (FITC) e 670 nm (canal FL-3 c3) para PI. Além disso, a apoptose foi examinada por microscopia de fluorescência. Primeiro, 1,0 × 10 ⁵ as células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e após 24 h, as células foram tratadas como acima, então 24 h mais tarde, 100 μL de tampão de ligação, 1 μL de Anexina V-FITC e 1 μLPI foram adicionados às células em temperatura ambiente no escuro por 15 min, mantidos em baixa temperatura e observados por microscopia de fluorescência.

Ensaio de migração celular

Um total de 8 × 10 ⁵ as células foram semeadas em placas de seis poços e permitidas atingir a confluência total. A monocamada foi ferida com o uso de um palito de coquetel. As células foram incubadas com DMEM sem soro conforme indicado. As imagens digitais foram tiradas em 0, 6, 12, 24 e 48 h. A área média foi calculada usando a imagem J e os experimentos foram repetidos três vezes.

Resultados e discussão

Conjugados CHP e grau de substituição de colesterol

O ¹ O valor de H NMR para CHP (DMSO-d6 com TMS, ppm) foi 2,53 ppm (2 grupos metileno, –OCH ₂ CH ₂ O–). A Figura 1 mostra ¹ Espectro de H NMR, confirmando que o colesterol estava quimicamente ligado à cadeia longa de pululano por meio de um braço espaçador succínico. Os espectros para os três CHP NPs sintetizados em diferentes proporções de alimentação (a, b, c) mostraram os picos característicos de pululano; As ligações glicosídicas α-1-4 e α-1,6 eram ∂ _4,68 (1Hα _1–6 ), ∂ _5.05 (1Hα _1–4 ), e ∂ _2,53 (2 grupos metileno, –OCH ₂ CH ₂ O–), respectivamente, que também era fácil de distinguir. Novos picos característicos apareceram em 0,40 a 2,40 (hidrogênio no esqueleto colestérico), o que confirmou que os três polímeros CHP foram sintetizados com sucesso. A área sob o pico reflete o número de átomos, e o grau de substituição colestérica pode ser calculado da seguinte forma [41]:

Espectro de NMR para CHP-1 ( a ), CHP-2 ( b ), e CHP-3 ( c )

$$ \ mathrm {DS} =\ frac {A _ {\ parcial 2,53}} {4 \ esquerda ({A} _ {\ parcial 4,68} + {A} _ {\ parcial 5,05} \ direita)} \ vezes 100 \ % $$
onde a soma de A _∂4,68 e A _∂5,05 representa o número de unidades de açúcar, A _{∂ 2,53} é o número de átomos de hidrogênio em –OCH ₂ CH ₂ O– do colesteril succínico, e A _{∂ 2,53} / 4 é o número de –OCH ₂ CH ₂ O–, isto é, o número de colesteróis no anidrido succínico CHS. Assim, a fórmula acima representa o grau de substituição colestérica na molécula de CHP como o número de grupos colesteril por 100 unidades de glicose. As razões de alimentação calculadas e as razões molares de unidades de açúcar colesteril e pululano foram 1/5, 3/20 e 1/20, respectivamente, e o grau de substituição dos três CHP-1, CHP-2 e CHP-3 sintetizados os polímeros eram 6,82%, 5,78% e 2,74%, respectivamente. O grau de substituição do colesterol na cadeia de pululano aumentou com o aumento da proporção de alimentação. No entanto, o grau real de substituição foi menor do que ambas as proporções de alimentação.

A cadeia pululana pode existir como uma cadeia enrolada flexível no solvente e, após a adição de uma certa quantidade de colesterol, o colesterol enxertado mostra um impedimento estérico molecular maior, que afeta a reação de esterificação direta posterior do colesterol succinil e do grupo hidroxila na cadeia de pululano. A dificuldade da reação aumentou significativamente, de modo que o grau de substituição tornou-se menor.

CHP NPs carregados com drogas e seu tamanho

Os tamanhos dos três CHP NPs em branco para CHP-1, CHP-2 e CHP-3 foram 79,1, 104,9 e 166,8 nm. Em um certo grau de substituição, a hidrofobicidade se fortaleceu com o aumento do grau de substituição do colesterol. Quanto mais forte a hidrofobicidade, melhor as NPs auto-agregadas de CHP formaram um núcleo hidrofóbico mais compacto, que diminuiu o tamanho das NPs [42]. A Figura 2 mostra o tamanho de CHP NPs carregados com fármaco. Os tamanhos de partícula para CHP-1, CHP-2 e CHP-3 foram 86,4, 162,30 e 222,28 nm, respectivamente. Na mesma proporção de drogas e materiais, o tamanho de partícula do NP carregado com a droga com um alto grau de substituição do grupo hidrofóbico do polímero era pequeno, mas o diâmetro da partícula do NP carregado com a droga era maior do que a droga não encapsulada - contendo NP em branco com o mesmo grau de substituição. Conforme a mitoxantrona entra no núcleo hidrofóbico, o tamanho de partícula dos NPs é aumentado. Na Fig. 2d, o potencial zeta dos CHP NPs carregados com fármaco é -1,12 mV. A Fig. 2e é uma imagem TEM que mostra que os NPs carregados com a droga são esféricos.

Imagens de tamanho NP carregadas com mitoxantrona (CHP-1 ( a ), CHP-2 ( b ), CHP-3 ( c )), imagens potenciais (CHP-2 ( d )) e imagens TEM (CHP-2 ( e ))

Liberação de droga de NPs carregados com drogas de tamanhos diferentes e sob diferentes meios ácidos

Quando as proporções do fármaco e do polímero CHP eram iguais, a carga de fármaco e a eficiência de aprisionamento dos NPs CHP-1, CHP-2 e CHP-3 carregados com fármaco eram 8,17% e 88,92%; 7,62% e 82,28%; e 4,83% e 50,67%, respectivamente. Quanto maior for a substituição hidrofóbica colestérica no polímero CHP, menor será o tamanho da partícula formada e maior será a carga de droga e a eficiência de aprisionamento. A Figura 3 mostra os perfis de liberação de droga para os três CHP NPs carregados com droga. No PBS, o medicamento foi liberado por 48 horas. As taxas de liberação para CHP-1, CHP-2 e CHP-3 foram 38,73%, 42,35% e 58,89%, respectivamente. Todos os três NPs mostraram propriedades de liberação sustentada, mas quanto menor o tamanho do NP, mais forte a hidrofobicidade e mais lenta a liberação do medicamento. Em pH 6,8, as taxas de liberação do fármaco para CHP-1, CHP-2 e CHP-3 foram 43,82%, 49,48% e 64,18%, respectivamente. Em condições fracamente ácidas, os NPs CHP liberaram a droga de forma sustentável, mas a taxa de liberação aumentou significativamente. Em pH 4,0, após 48 h da liberação do fármaco, as taxas de liberação do fármaco para CHP-1, CHP-2 e CHP-3 foram 51,25%, 56,23% e 75,46%, respectivamente. A liberação do fármaco CHP NP foi significativamente mais rápida em pH mais baixo, especialmente para CHP-3 NP, o maior dos três CHP NPs.

Liberação de mitoxantrona (MTO) de NPs de pululano em solução salina tamponada com fosfato (quadrado preto:CHP-1, círculo branco:CHP-2, triângulo preto apontando para baixo:CHP-3), em pH 6,8 (triângulo branco apontando para cima:CHP- 1, diamante preto:CHP-2, quadrado branco:CHP-3) e em pH 4,0 (triângulo preto:CHP-1, diamante branco:CHP-2, círculo preto:CHP-3) a 37 ° C in vitro

Citotoxicidade de NPs CHP carregados com mitoxantrona

No ensaio MTT (Fig. 4), o IC ₅₀ os valores de mitoxantrona para inibir o crescimento de células de câncer de bexiga foram 0,25, 0,20 e 0,06 μM em 24, 48 e 72 h, respectivamente (Tabela 1). Consideramos 24 horas como o tempo de dosagem.

Efeito do tratamento com mitoxantrona e NPs na proliferação celular da linha celular de câncer de bexiga MB49. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio baseado em tetrazólio com tratamento de 24, 48 e 72 horas com mitoxantrona e nano-drogas de 0 a 0,5 μg / mL na linha celular de câncer de bexiga murina MB49

Com a concentração de mitoxantrona livre e NPs de mitoxantrona-CHP sendo a mesma com a mesma administração, os resultados dos experimentos de MTT na Fig. 5 mostram que a concentração de mitoxantrona livre foi mais tóxica para células de câncer de bexiga do que NPs de mitoxantrona-CHP. Ao comparar os NPs de mitoxantrona-CHP com os três graus de substituição do colesterol, o efeito citotóxico mais potente foi CHP-3, seguido por CHP-2, e o mais fraco foi CHP-1.

Citotoxicidade de mitoxantrona livre e NPs CHP carregados com mitoxantrona em 24 h (quadrado azul:mitoxantrona, círculo rosa:CHP-1, triângulo verde:CHP-2, triângulo vermelho apontando para baixo:CHP-3)

Embora os efeitos tóxicos de várias concentrações de mitoxantrona-CHP NPs em células de câncer de bexiga fossem semelhantes, especialmente CHP-2 e CHP-3, o efeito de CHP-1 foi significativamente reduzido. Cada concentração de CHP-1 mostrou esse fenômeno. Assim, quanto maior o tamanho da mitoxantrona-CHP NP, mais forte é a citotoxicidade.

O efeito terapêutico dos NPs tem duas partes:(1) a absorção celular dos NPs e (2) os NPs sendo liberados fora da célula e os medicamentos entrando nas células livremente para exercer sua eficácia. Como a mitoxantrona livre tem um efeito mais forte do que mitoxantrona-CHP NPs, o CHP-3 teve um efeito terapêutico mais forte do que os outros dois CHP NPs na mesma dose de medicamento. A liberação de CHP-3 foi a mais rápida, e o efeito terapêutico dos NPs de CHP dependeu principalmente da toxicidade da mitoxantrona livre nas células após a liberação da preparação nanofarmacêutica.

Apoptose celular de NPs de Mitoxantrona-CHP

Usamos imunofluorescência e citometria de fluxo para comparar o efeito da mesma concentração de 0,2 μg / mL de mitoxantrona e os três CHP NPs carregados com droga na apoptose de células MB49. A mitoxantrona livre foi mais forte para apoptose do que os três NPs de mitoxantrona-CHP (Fig. 6). No entanto, o CHP-3 teve o efeito mais potente e o mais fraco foi o CHP-1. Os resultados anteriores do MTT foram posteriormente confirmados.

Apoptose de mitoxantrona e nanodrogas às 24 h em células MB49 de câncer de bexiga ( a DMSO, b mitoxantrona, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1):A. A coloração dupla de anexina V-FITC / PI foi detectada por microscopia de fluorescência, as células apoptóticas iniciais mostraram coloração positiva para anexina V-FITC (verde), as células necróticas foram positivas para PI (vermelho) e células apoptóticas tardias mostrou coloração dupla positiva (amarelo). B. A taxa apoptótica foi determinada por FCM. Célula viva (Q3), taxa de apoptose precoce (Q4), taxa de apoptose tardia (Q2), células necróticas (Q1). Quanto maior a coloração da célula, maior a taxa de apoptose

Migração de células de NPs CHP carregados com mitoxantrona

A capacidade de 24 e 48 h da mitoxantrona livre e os três CHP NPs para inibir a migração de células MB49 foi observada em comparação com os controles (Fig. 7). A inibição da migração não foi significativamente mais forte para a mitoxantrona livre do que os três CHP NPs. No ensaio MTT e no teste de apoptose, a inibição da migração foi mais forte para a droga livre do que para os três NPs de CHP, principalmente porque a droga livre entrou mais facilmente nas células para matar as células cancerosas. No experimento de migração celular também, a droga livre pode inibir a migração celular de forma mais eficiente do que nano-fármacos CHP, o que pode ser devido a alguns nano-fármacos CHP não serem fagocitados entre as células, o que resulta na resistência à migração das células cancerosas. Além disso, os três NPs CHP não diferiram na inibição da migração de células cancerosas, portanto, a resistência estérica formada pelos NPs desempenhou um papel importante na migração celular. Portanto, os CHPNPs carregados de drogas inibem as células cancerosas de duas maneiras:(1) a liberação extracelular é a forma dominante, por meio da qual os nanofármacos liberam os medicamentos fora das células e matam as células cancerosas como medicamentos livres, com os NPs CHP-3 sendo mais tóxicos do que os outros CHP NPs e (2) CHP NPs fora das células cancerosas criam resistência estérica, bloqueando, portanto, a migração das células cancerosas.

Mitoxantrona sozinha e NPs CHP carregados com mitoxantrona mostraram migração prejudicada em ensaios de cicatrização de feridas. a DMSO, b mitoxantrona, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1. As imagens mostraram a lacuna da região arranhada em momentos diferentes; A ₀ , A ₂₄ , e A ₄₈ representam 0, 24 e 48 h de tratamento com DMSO, respectivamente

O objetivo deste estudo foi rastrear NPs CHP de tamanho adequado como carreadores de drogas e fornecer evidências experimentais para a ação terapêutica dos NPs CHP. Sintetizamos três tipos de polímeros de pululano substituídos por esterol (CHPs), CHP-1, CHP-2 e CHP-3, com grau de substituição de colesterol 6,82%, 5,78%, 2,74% respectivamente e diâmetro 86,4, 162,30 e 222,28 nm. A taxa de liberação da droga de três tipos de NPs de mitoxantrona-CHP por 48 h foi de 38,73%, 42,35% e 58,89%, respectivamente. O grau de substituição hidrofóbica no polímero foi associado ao processo de automontagem das NPs, afetando seu tamanho e, portanto, a taxa de liberação do fármaco. Em meio de liberação de ácido, a liberação foi significativamente acelerada. Quanto maior for o NP, maior será a velocidade de liberação do medicamento. Às 24 horas, o IC ₅₀ o valor foi de 0,25 M, para o melhor efeito de inibição da mitoxantrona no crescimento de células de câncer de bexiga. Os NPs CHP-3 carregados com drogas com o tamanho maior foram os mais tóxicos para as células do câncer de bexiga e os NPs CHP-3 tiveram o efeito mais forte na promoção da apoptose das células. Todos os NPs poderiam inibir a migração de células MB49, mas os NPs CHP-3 de tamanho grande tiveram a inibição mais poderosa.

Os polímeros anfifílicos podem se automontar em NPs em soluções aquosas; exemplos são os polissacarídeos pululano e quitosana, que podem ser modificados em polímeros anfifílicos por modificação hidrofóbica de pequenas moléculas e automontados em NPs esféricos em soluções aquosas com grupos hidrofóbicos como o núcleo e conchas hidrofílicas da cadeia de açúcar [43, 44]. Durante a automontagem, os grupos hidrofóbicos são a força motriz para a formação de NPs e a chave para a formação de sua casca e estrutura central. As propriedades e o peso molecular dos grupos hidrofílicos também têm um efeito importante na formação e no tamanho das NPs [45, 46]. Quando o mesmo polímero é modificado com uma pequena fração de um grupo hidrofóbico, o grau de substituição hidrofóbica deve ser moderado, e apenas dentro de uma certa faixa a substituição hidrofóbica pode ser auto-montada em NPs. Se o grau de substituição hidrofóbica for muito alto, a hidrofobicidade do polímero é muito forte, o que não conduz à automontagem. Se a substituição hidrofóbica for muito baixa, a força motriz hidrofóbica é muito pequena para formar NPs [47].

Neste estudo, sintetizamos com sucesso três tipos de polímeros CHP com vários graus de substituição de colesterol, projetando uma proporção de alimentação adequada, e todos puderam se automontar em NPs de um determinado tamanho. Durante a automontagem de polímeros CHP, drogas hidrofóbicas, como mitoxantrona, podem ser incorporadas no centro hidrofóbico de NPs para formar NPs carregados de droga (Fig. 8). O tamanho dos NPs carregados de droga está relacionado ao grau de substituição do polímero CHP:quanto maior o grau de substituição, menor o tamanho. O grau de substituição de polímeros também afeta a quantidade de droga carregada em NPs após a automontagem. Quando a proporção de polímero para fármaco é a mesma, quanto maior o grau de substituição, maior a carga de fármaco [48]. Além disso, a proporção de polímero para droga afeta a eficiência de encapsulação e carga de droga. Somente quando a proporção de alimentação está na faixa adequada a carga de droga e a eficiência de encapsulamento serão relativamente altas [31]. A liberação de drogas de NPs afeta diretamente seus efeitos terapêuticos, que estão intimamente relacionados aos tipos de nanomateriais, a carga de superfície e grupo hidrofóbico de NPs, o valor de pH da mídia de liberação e a adsorção da proteína albumina sérica humana (HSA) in vivo [49, 50]. A liberação da droga de CHP NPs carregados com mitoxantrona mostrou liberação lenta. A liberação do fármaco de NPs CHP de grande tamanho foi mais rápida e a de NPs em ambiente ácido foi mais rápida. A taxa de liberação de drogas de NPs maiores era mais óbvia e mais rápida.

A automontagem de nanopartículas CHP carregadas com mitoxantrona (NPs)

A quimioterapia do câncer é a principal forma de tratar o câncer atualmente, mas os medicamentos da quimioterapia não são específicos para tecidos e são tóxicos para os tecidos normais, e alguns causam grandes danos às células do sistema imunológico, o que prejudica o efeito geral do tratamento [51, 52]. A nanomedicina pode visar passivamente os tecidos cancerosos por meio do efeito EPR, reduzindo assim a deposição da droga em tecidos não-alvo e reduzindo a toxicidade e os efeitos colaterais. Neste estudo, usamos células de câncer de bexiga como células cancerígenas modelo e discutimos os efeitos dos NPs e do tamanho dos NPs no câncer de bexiga. O efeito antitumoral foi mais forte para mitoxantrona livre do que CHP NPs; entretanto, se todo o medicamento for administrado, a mitoxantrona não é tecido-específico. A deposição e perda de tecidos e a toxicidade e efeitos colaterais causados ​​por essas drogas não serão tão eficazes quanto os tratamentos com nano-drogas. Portanto, os efeitos tóxicos sobre as células cancerosas e a inibição da migração celular foram melhores com a droga livre do que NPs carregados de droga, o que não indica que o efeito terapêutico geral dos nanômetros de CHP não seja tão bom quanto o da mitoxantrona livre. Destacamos o efeito do grau hidrofóbico de substituição sobre o tamanho dos fármacos em nanoescala e o efeito do tamanho nano sobre o carregamento, a liberação do fármaco, a citotoxicidade e a migração de células cancerígenas. Depois que os NPs são direcionados passivamente ao tecido canceroso por meio do efeito EPR, a eficácia terapêutica dos NPs carregados com drogas é derivada principalmente da liberação de drogas no tecido e da liberação de NPs para as células (Fig. 9). O efeito terapêutico dos NPs CHP é se sua liberação extracelular ou intracelular desempenha o papel dominante. A partir dos experimentos com células, o tamanho das NPs de CHP tem um efeito forte:com tamanho grande, as drogas são liberadas mais, mas a quantidade da droga é a mesma. Portanto, o efeito terapêutico dos CHP-NPs pode depender principalmente da liberação no tecido em vez da captação pelas células.

A eficácia do tratamento de CHP NPs carregados com mitoxantrona principalmente pela liberação de localização no tecido tumoral

Muitos NPs clássicos são usados ​​como transportadores de drogas, e os NPs CHP que preparamos são superiores aos outros. Por exemplo, NPs biogenéticos (como exossomo, vesículas extracelulares miméticas, vesículas extracelulares modularizadas) são difíceis de preparar [53]. A distribuição alvo de lipossomas comuns não é ideal e sua instabilidade ainda é um problema [54]. NPs inorgânicos como os pontos quânticos NPs são muito estáveis, mas como matéria estranha, sua biocompatibilidade é pobre, o que pode causar efeitos colaterais aos humanos [55]. CHP NPs são fáceis de preparar e podemos controlar seu tamanho controlando o grau de substituição hidrofóbica [48]. Porque eles podem ser diretamente degradados pela amilase in vivo, eles têm boa biocompatibilidade [56]. Além disso, os NPs do CHP têm boa estabilidade e excelentes propriedades de liberação de drogas [57]. A desvantagem é que eles serão inevitavelmente engolidos em parte pelo sistema fagocítico mononuclear [58]. Mais pesquisas são necessárias para reduzir a remoção pelo sistema e melhorar a concentração sanguínea efetiva de NPs.

Conclusão

O tamanho dos CHP NPs carregados com mitoxantrona está relacionado ao grau de substituição do colesterol no polímero. Quanto maior o grau de substituição de hidrofobicidade, menor será o tamanho e maior será a carga de droga e a eficiência de encapsulação, e mais lenta será a liberação da droga. Em condições ácidas, quanto mais forte for a acidez, mais rápida será a liberação de NPs de CHP. Além disso, a liberação de NPs com tamanho maior é melhor e NPs de tamanho maior podem inibir o crescimento das células da bexiga e sua migração melhor do que NPs de tamanho menor. CHP NPs matam células cancerosas principalmente pela liberação de drogas em nanoescala fora da célula.

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