Células-tronco mesenquimais marcadas com nanopartículas de azul da prússia:avaliação da viabilidade celular, proliferação, migração, diferenciação, citoesqueleto e expressão de proteínas in vitro

Resumo

As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido usadas para o tratamento de várias doenças humanas. Para entender melhor o mecanismo dessa ação e o destino dessas células, a ressonância magnética (RM) tem sido utilizada para o rastreamento de células-tronco transplantadas. Foi demonstrado que as nanopartículas de azul da Prússia (PBNPs) têm a capacidade de marcar células para visualizá-las como um agente de contraste de IRM eficaz. Neste estudo, objetivamos investigar a eficiência e os efeitos biológicos de MSCs marcados usando PBNPs. Primeiro, sintetizamos e caracterizamos os PBNPs. Então, o sistema de análise de células em tempo real iCELLigence revelou que os PBNPs não alteraram significativamente a viabilidade celular, a proliferação e a atividade de migração em MSCs marcados com PBNP. A coloração com Oil Red O e a coloração com Alizarin Red revelaram que as MSCs marcadas também têm uma capacidade de diferenciação normal. A coloração com faloidina não mostrou nenhum efeito negativo dos PBNPs no citoesqueleto. A análise de Western blot indicou que os PBNPs também não alteraram a expressão de β-catenina e vimentina das MSCs. Na ressonância magnética in vitro, os pellets das MSCs incubados com PBNPs mostraram um claro efeito de escurecimento do sinal de ressonância magnética. Em conclusão, os PBNPs podem ser usados com eficácia para a marcação de MSCs e não irão influenciar as características biológicas das MSCs.

Histórico

As células-tronco mesenquimais, um tipo de célula-tronco adulta, têm capacidade antiinflamatória, potencial regenerativo e podem migrar para os tecidos lesados para auxiliar na recuperação da função danificada [1]. Eles podem se diferenciar em vários tipos de células no microambiente específico e são facilmente coletados de tecido adulto e fetal [2]. Assim, as células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido utilizadas para medicina regenerativa e terapia oncológica como uma ferramenta promissora devido a essas excelentes propriedades [3, 4]. No entanto, o destino das MSCs após o transplante para o corpo permanece obscuro e o rastreamento não invasivo das MSC é necessário in vivo para avaliar a eficiência do transplante e seu destino, propriedades e localização [5]. Recentemente, a imagem por ressonância magnética (MRI) como uma tecnologia eficaz tem sido amplamente obtida para pesquisar a informação estrutural e funcional de células-tronco mesenquimais in vitro e in vivo [6].

Nos últimos anos, várias nanopartículas foram usadas para rotular as MSCs como uma ferramenta promissora para imagens não invasivas de células para registrar suas distribuições e destino in vivo e in vitro, e até mesmo usadas para o tratamento de tumores [7]. Por exemplo, nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) e pontos quânticos (QDs) têm sido usados para marcar células por muitos anos [8, 9]. E nanopartículas magnéticas fluorescentes (FMNPs) foram usadas para rotular as MSCs para realizar a imagem direcionada e a terapia sinérgica de células cancerosas gástricas in vivo [10]. Para esses novos rótulos, uma análise cuidadosa e completa da toxicidade celular é necessária porque tudo tem uma dose tóxica e pode perturbar a função celular a jusante [11]. Por exemplo, as nanopartículas de óxido de ferro de contraste de ressonância magnética foram atribuídas à geração de ROS e podem causar morte celular [12].

Recentemente, nanopartículas de azul da Prússia (PBNPs) demonstraram ter potencial para ser um agente de contraste de IRM [13,14,15]. O azul da Prússia, considerado uma droga prática, econômica, segura e ecologicamente correta, foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos na clínica para terapia da exposição radioativa. É importante ressaltar que os PBNPs eram altamente dispersíveis e estáveis tanto em água quanto em ambientes biológicos mímicos, como soro sanguíneo, sem o aparecimento de agregação em 1 semana [16], e tinham boa estabilidade fototérmica que poderia reutilizar os PBNPs durante aplicações práticas [17]. Por exemplo, Liang et al. [13] demonstraram pela primeira vez que os PBNPs com forte absorção na região NIR podem ser usados como um excelente agente de contraste para aprimorar a imagem fotoacústica. PBNPs com tamanho uniforme e boa estabilidade coloidal podem ser fabricados a partir de agentes químicos de baixo custo de uma maneira fácil.

Os PBNPs têm sido usados para marcar algumas células tumorais como o agente de MRI em pesquisas [18], mas poucos estudos foram relatados sobre a aplicação de PBNPs nas MSCs. Aqui, relatamos que as células-tronco mesenquimais marcadas com PBNP exibiram viabilidade celular normal, proliferação, migração, citoesqueleto, diferenciação e expressão de proteínas in vitro. Mais trabalhos são necessários se isso for uma realidade in vivo e para se certificar de que a entrega intralesional direcionada de MSCs marcados com PBNP é tão crítica quanto o pensamento de rastreamento de células.

Métodos

Cultura de células

MSCs de camundongo C3H10T1 / 2 foram obtidos de Nanjing KeyGen Biotech. Inc. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Hyclone, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Israel) e 1% de penicilina-estreptomicina (Hyclone, EUA) a 37 ° C com 5% de CO ₂ saturação, e o meio foi trocado a cada 3 dias. Após quatro passagens, as células foram usadas para experimentos.

Preparação de PBNPs

Em uma síntese típica, 2,5 mmol de ácido cítrico (490 mg) foi adicionado primeiro a 20 mL de FeCl aquoso 1,0 mM ₃ solução sob agitação a 60 ° C. A esta solução foi adicionado gota a gota 20 mL 1,0 mM aquoso K ₄ [Fe (CN) ₆ ] solução contendo 0,5 mmol de ácido cítrico (98 mg) a 60 ° C. Uma clara dispersão azul brilhante formou-se imediatamente. Após 30 min, a solução foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente com a agitação continuada durante mais 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, um volume igual de álcool etílico foi adicionado à dispersão e centrifugado a 10.000 rpm por 20 min para resultar na formação de um pellet de nanopartículas. Este último foi separado novamente pela adição de igual volume de álcool etílico e centrifugação.

Caracterização de PBNPs

A espectroscopia de infravermelho dos PBNPs sintetizados foi medida usando um espectrofotômetro de infravermelho (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10). A morfologia dos PBNPs sintetizados foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM; JEM 2100F). A magnetização dependente do campo de PBNPs foi pesquisada usando um magnetômetro de amostra vibratória (VSM; Lakeshore 7307). A análise de difração de raios-X (XRD) foi realizada usando Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD). O índice de polidisperistia dos PBNPs foi determinado pelo Zetasizer Nano ZS.

Distribuições intracelulares de PBNPs e ultraestrutura de células C3H10T1 / 2 marcadas

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi realizada para avaliar as distribuições intracelulares de PBNPs. Depois que o meio foi removido, as células foram enxaguadas com PBS e então digeridas com 0,25% de tripsina. Em seguida, as células foram transferidas para um tubo EP de 1,5 mL para serem centrifugadas (2.000 rpm, 5 min). Em seguida, o sobrenadante foi removido e as células foram fixadas com glutaraldeído 0,25% e ácido de ósmio 1%. Após as células serem enxaguadas novamente, as células foram desidratadas em etanol 50%, etanol 70%, etanol 90%, acetona 90% e acetona 100% por 20 min cada. Em seguida, as células foram incorporadas a 4 ° C durante a noite. Em seguida, foi realizada dupla coloração com acetato de urânio-citrato a 3% nas seções. Finalmente, as imagens foram coletadas pelo TEM.

Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada para avaliar a ultraestrutura de células C3H10T1 / 2 marcadas. Após a remoção do meio, as células foram enxaguadas com PBS e fixadas com pré-resfriamento de glutaraldeído a 3% a 4 ° C durante a noite. Em seguida, as células foram enxaguadas duas vezes com PBS e fixadas com ácido ósmico 1% a 4 ° C por 1 h. Após as células C3H10T1 / 2 serem enxaguadas novamente, as células foram desidratadas em álcoois graduados ascendentes (30% de etanol, 50% de etanol, 70% de etanol, 80% de etanol, 90% de etanol, 95% de etanol e 100% de etanol) por 2 × 10 min cada. Em seguida, as células foram imersas em solução de acetonitrila 70%, 80%, 90%, 95% e 100% por 15 min cada. Em seguida, foi realizada a secagem a vácuo e o revestimento por spray de ouro. Por fim, as imagens foram coletadas por SEM.

Análises de viabilidade celular dos PBNPs

A viabilidade celular foi avaliada pelo MTT (Sigma, EUA). As células foram semeadas em placas de 96 poços em 1 × 10 ³ células por poço a 37 ° C com 5% de CO ₂ atmosfera. Após a incubação durante a noite, o meio de cultura foi substituído por 100 μL de meio fresco contendo diferentes concentrações de PBNPs (0, 5, 10, 20, 40 e 80 μg / mL) e, em seguida, as células foram cultivadas por mais 1 a 3 dias. O meio de cultura foi removido e as células foram incubadas com 20 μL de MTT (5 mg / mL) a 37 ° C por 4 h. Os cristais de corante violeta precipitados foram dissolvidos em 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, EUA) por 10 min agitando suavemente. O valor de densidade óptica (OD) foi medido em um comprimento de onda de 490 nm usando um leitor de microplaca. Os resultados das células foram expressos como porcentagem de células viáveis.

Ensaio de proliferação

Comparando com MTT, MTS, WST-1 e XTT, o RTCA permite a análise de todo o período do experimento e não requer a marcação que afeta negativamente os experimentos de cultura de células [19]. Assim, o sistema xCELLigence (Roche / ACEA Biosciences) foi usado para medir a proliferação celular em tempo real. Resumidamente, as células foram semeadas em E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, EUA) a 5 × 10 ³ células por poço com 150 mL de meio completo. Após crescer 24 h, o meio foi substituído por meio fresco contendo várias concentrações de PBNPs e incubado por mais 96 h. Este sistema mediu a impedância elétrica, que foi criada pela fixação de células nas placas de cultura de células integradas ao microeletrodo [20], para fornecer as informações quantitativas sobre o número de células e viabilidade em tempo real pelo instrumento RTCA-DP [21]. A proliferação celular foi medida periodicamente a cada 15 minutos durante os 4 dias seguintes.

Monitoramento em tempo real da migração celular

A migração de células C3H10T1 / 2 foi medida usando um sistema de ensaio de migração e invasão de células em tempo real (RT-CIM) (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, EUA). As células têm a capacidade de aumentar a impedância para, portanto, leituras de "Índice de célula" quando entram em contato e aderem aos sensores devido à migração da célula da câmara superior para a câmara inferior através da membrana. Simplesmente, as células foram semeadas na câmara superior a uma densidade de 4 × 10 ⁴ por poço em meio sem soro na presença de várias concentrações de PBNPs. As câmaras inferiores das placas CIM foram preenchidas com 165 μL de meio completo contendo 10% de FBS. A migração celular foi monitorada pelo instrumento RTCA DP a cada 10 min por um período de 100 h. O índice celular (CI) foi usado para refletir os resultados. O valor de CI foi derivado da mudança na impedância elétrica conforme as células vivas interagem com a superfície do microeletrodo biocompatível no poço da microplaca para medir com eficácia o número, a forma e a aderência das células. Quanto maior for o número de células migradas, maior será o índice de células.

Investigação da migração celular via Ensaio Transwell

Após serem cultivadas com diferentes concentrações de PBNPs por 48 h, as células com densidade de 2 × 10 ⁶ célula / cm ² foram cultivadas em uma câmara Transwell (tamanho de poro de 8 μm; BD FalconTM, EUA) por 24 h a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Após a cultura, a câmara interna foi limpa e as células migradas no fundo da câmara foram fixadas e coradas com 0,1% de violeta de cristal. Cada etapa foi seguida por lavagem com PBS por 5 min três vezes. As células migradas foram fotografadas em diferentes campos de visão usando um microscópio de contraste de fase invertido (CK2, Olympus, Japão).

Diferenciação celular in vitro

PBNPs marcados com células C3H10T1 / 2 ou não marcados foram induzidos a se diferenciar em duas linhagens de células a jusante de adipócitos ou osteócitos. Depois que as células atingiram a confluência em uma placa de seis poços, as células foram cultivadas em meio de indução osteogênica (10% de FBS / DMEM contendo 10 nM de dexametasona, 50 μM de ácido ascórbico, 10 mM de β-glicerofosfato, Sigma) ou meio de indução adipogênico (10% FBS / DMEM contendo 1 μM de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina, 10 μM de insulina, Sigma). Após 3 semanas, as células foram lavadas com PBS, fixadas com polioximetileno 4% e coradas com Alizarin Red ou Oil Red O (Sigma). As células induzidas foram fotografadas em diferentes campos de visão usando um microscópio de contraste de fase invertido (CK2, Olympus, Japão).

Ensaio de imunofluorescência para visualização de F-actina

As MSCs foram cultivadas com várias concentrações de PBNPs em uma placa de 24 poços por 48 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 10 min, permeabilizadas com Triton-100 a 0,2% por 5 min, bloqueadas com BSA a 1% em PBS por 30 min em temperatura ambiente e depois cultivadas com faloidina (1:100, Thermo Fisher Scientific , EUA) e DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, EUA) por 30 min em temperatura ambiente. A microscopia de fluorescência foi realizada em um microscópio Nikon eclipse Ti-S com software de elementos NIS

Expressão de proteína por análise de Western Blot

A expressão da proteína das células foi avaliada por meio de análise de Western blot. As MSCs foram cultivadas com o meio contendo diferentes concentrações de PBNPs (0, 25, 50 μg / mL) em placas de seis poços por 24 h, lavadas duas vezes com PBS gelado e raspadas em 100 μl de tampão PIPA (Beyotime) contendo inibidores de protease e ortovanadato de sódio (Beyotime, China). Após 30 min, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min a 4 ° C, então as concentrações de proteína das amostras foram determinadas usando o kit BCA (Beyotime, China). A mesma quantidade de proteínas foi submetida a eletroforese em géis SDS-PAGE 10% (Beyotime, China) e transferida para membrana de PVDF (GE Healthcare). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em solução salina tamponada com Tris com Tween20 (TBST) à temperatura ambiente por 2 h e depois incubadas com anti-β-catenina (1:1000, CST, EUA), antivimentina (1:1000 , Abiocode) e anti-β-actina (1:1000, CST, EUA) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas três vezes durante 5 min cada e depois incubadas com os anticorpos secundários apropriados durante 2 h à temperatura ambiente. Os sinais foram detectados com ECL e ECL-plus (Beyotime, China) e expostos ao sistema Molecular Image® ChemiDoc ™ XRS + (Bio-Rad Inc., EUA) com o software Image Lab ™ usando quimioluminescência aprimorada.

Investigação de imagem celular da eficiência da marcação celular por meio de ressonância magnética

As MSCs foram tratadas com diferentes concentrações (25 e 50 μg / mL) de PBNPs, e as células de controle foram cultivadas com meio completo sem PBNPs por 48 h, lavadas três vezes com tampão PBS, tripsinizadas, coletadas e, em seguida, incluídas em 1 mL 1 % ( w / v ) solução de agarose para estudos de imagem. Além disso, as MSCs marcadas com 50 μg / mL de PBNPs foram induzidas à diferenciação osteogênica por 14 dias, então foram examinados o efeito do sinal de ressonância magnética. A imagem ponderada em T2 foi realizada usando uma sequência de gradiente eco de recuperação de inversão com TE =23 ms, TR =400 ms, NEX =2,0, uma espessura de corte de 2 cm, um FOV de 20 × 20 cm e tamanho de matriz de 384 × 256.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± DP de pelo menos três experiências independentes realizadas em triplicado. Os grupos de tratamento foram comparados usando análise de variância unilateral (ANOVA) e t de Student teste foi usado. p <0,05 foi aceito como uma diferença significativa.

Resultados e discussão

Caracterização PBNP

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi realizada para caracterizar os PBNPs (Fig. 1a), que possuem um diâmetro de 20-25 nm. Para a morfologia, os PBNPs apresentaram estrutura cuboidal. A Figura 1b mostra a espectroscopia de infravermelho dos PBNPs sintetizados. Os PBNPs exibiram um pico de absorção típico de Fe ³⁺ -CN em torno de 2085,23 nm, o que estava de acordo com o dos PBNPs. A medição de magnetização dependente de campo foi posteriormente usada para estudar as propriedades magnéticas dos PBNPs. A Figura 1c mostra as curvas de magnetização dos PBNPs à temperatura ambiente, que demonstraram superparamagnetismo dos PBNPs. A Figura 1d mostra os picos de difração em 200, 220, 400 e 420, que corroboram com o padrão de XRD de PBNPs. Além disso, o índice de polidisperistia de PBNPs foi 0,16, o que indicou uma distribuição de tamanho de partícula uniforme.

Captação celular e citotoxicidade de PBNPs

Para confirmar ainda mais a absorção celular dos PBNPs pelas MSCs, a micromorfologia celular das células C3H10T1 / 2 acima tratadas com e sem os PBNPs foi estudada. A Figura 2 mostra imagens SEM e TEM de células C3H10T1 / 2 após a incubação por 48 h com e sem os PBNPs. A partir das imagens de SEM, a ultraestrutura das células C3H10T1 / 2 marcadas não apresentou mudanças óbvias quando comparadas com as células C3H10T1 / 2 de controle. A partir das imagens TEM, as células C3H10T1 / 2 de controle sem a incubação com os PBNPs exibiram uma micromorfologia celular típica com microestruturas celulares óbvias. No entanto, após a incubação com os PBNPs, a distribuição aleatória dos PBNPs foi claramente observada no citoplasma das células C3H10T1 / 2. E alguns PBNPs pareciam estar localizados em vesículas dentro do citoplasma das células. Embora a distribuição aleatória dos PBNPs tenha sido observada no citoplasma das células C3H10T1 / 2, o mecanismo exato de captação intracelular não estava claro. Propomos que a internalização dos PBNPs em células C3H10T1 / 2 pode ocorrer por meio de um mecanismo semelhante ao demonstrado no estudo anterior, que relatou que diferentes nanopartículas inorgânicas, incluindo azul da Prússia - Poli (l-lisina), ouro, prata e metalóxidos podem ser prontamente absorvido pelas células via endocitose [15, 22, 23].

Para avaliar a citotoxicidade e o ensaio de viabilidade celular em CTMs, foi realizado o método MTT. As células foram incubadas por 1 a 3 dias a 37 ° C sob 5% de CO ₂ com várias concentrações de PBNPs suspensos em DMEM. Três ensaios independentes foram conduzidos, e as médias e desvios-padrão foram relatados. A Figura 3 mostra que a viabilidade das MSCs tratadas com PBNPs (5, 10, 20, 40, 80 μg / mL) foi em relação às células de controle em 24 a 72 h, respectivamente. Os resultados indicaram que os PBNPs não eram tóxicos para as células tratadas com a mesma quantidade de PBNPs que o MTT. Além disso, um ensaio de proliferação em tempo real usando o instrumento xCELLigence foi usado para investigar as curvas de crescimento de MSCs. Os resultados mostraram que as curvas de crescimento das MSCs não foram significativamente influenciadas por essas concentrações de PBNPs (Fig. 4a), e as viabilidades celulares foram contadas e mostradas na Fig. 4b após o tratamento em 24, 48, 72 e 96 h. Estes resultados sugerem que os PBNPs não têm efeito na proliferação de MSCs.

Capacidade de migração de células

A migração de MSCs tratadas com várias concentrações de PBNPs foi testada usando o ensaio Transwell e uma nova técnica, o sistema de ensaio RT-CIM. A partir do ensaio Transwell, as células marcadas não mostraram mudanças óbvias na migração. Usando o sistema de ensaio RT-CIM, a migração de células foi monitorada em tempo real, o que refletiu dados mais precisos e pode prever a capacidade de migração de células com mais precisão. Do sistema de ensaio RT-CIM, embora no início da marcação, as células marcadas migraram mais lentamente do que as células não marcadas. Mas às 72 e 96 h, não houve diferença significativa na migração celular entre células marcadas e células não marcadas, indicando que altas concentrações de PBNPs não afetaram a motilidade MSC (Fig. 5).

Diferenciação celular in vitro

A pluripotência de MSCs marcados e não marcados foi investigada por coloração com Alizarin Red e Oil Red O. A Figura 6 mostra que as MSCs marcadas podem ser diferenciadas com sucesso em adipócitos e osteócitos, como fizeram as MSCs não marcadas. Esses resultados sugerem que os PBNPs não interferiram na capacidade de diferenciação das células, o que manteve a pluripotência das MSCs marcadas.

Influência da marcação de PBNPs no citoesqueleto

Para investigar o efeito dos PBNPs no citoesqueleto das MSCs, o ensaio de imunofluorescência da F-actina foi usado. A coloração com faloidina não mostra alteração dos filamentos de actina vermelha do citoesqueleto após marcação por 48 h em comparação com MSCs não marcadas. Uma comparação da integridade e distribuição dos filamentos de actina nas células marcadas e não marcadas por 48 h não revelou alterações (Fig. 7).

Análise de Western Blot

As vias de sinalização Wnt desempenham um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação, apoptose, formação de tecido e destino das células-tronco [24]. Portanto, a β-catenina é a proteína funcional das MSCs. Além disso, a vimentina é o biomarcador mesenquimal e também é a proteína funcional das MSCs [25]. Essas duas proteínas estão relacionadas com a função biológica das MSCs. As expressões de β-catenina e vimentina foram avaliadas por análise de Western blot. A Figura 8 mostra que a expressão de β-catenina e vimentina de MSCs tratadas com várias concentrações de PBNPs por 48 h não teve alterações significativas em comparação com a expressão de MSCs tratadas sem PBNPs. Esses resultados indicaram que os PBNPs não podem alterar a expressão de β-catenina e vimentina das MSCs, o que mostrou estabilidade da função biológica das MSCs após o tratamento com PBNPs.

Ressonância magnética in vitro

As MSCs, como outras células-tronco, têm o potencial de diferenciar células ósseas, cartilaginosas, de gordura, musculares e cardíacas, que se tornaram uma fonte importante de medicina regenerativa. E rastrear a migração e o resultado das MSCs é muito importante para avaliar o papel e o resultado das MSCs exógenas no reparo de defeitos. A ressonância magnética (RM) ajudou a observar as CTM após a administração clínica, e o agente de contraste da RM é necessário. O potencial dos PBNPs usados como um agente de contraste de IRM celular ponderado em T2 eficaz foi demonstrado [14], e alguns outros estudos também demonstraram que a modificação de superfície dos PBNPs melhora seu desempenho na IRM [17, 26]. Atualmente, a marcação PBNP tem sido usada em uma variedade de células. Dumont et al. descreveram PBNPs como agentes para ressonância magnética e imagens baseadas em fluorescência de tumores cerebrais pediátricos [27]; Perera et al. desenvolveram os PBNPs incorporados com gadolínio para a detecção precoce de tumores no trato gastrointestinal [28]; e Cano-Mejia et al. Terapia fototérmica combinada à base de nanopartículas de azul da Prússia (PBNP) (PTT) com inibição do ponto de verificação anti-CTLA-4 para tratar neuroblastoma [29]. No entanto, raramente há relatórios relacionados sobre MSCs marcados com PBNP. Além disso, se há alguma influência negativa na função celular e na viabilidade das MSCs após a marcação de PBNPs permanece obscuro

Para investigar se os PBNPs têm a capacidade de aumentar o contraste de células de ressonância magnética ponderada em T2, incubamos as MSCs com ou sem PBNPs e examinamos o efeito do sinal de ressonância magnética. Para monitorar a estabilidade temporal da marcação e investigar se os PBNPs perderiam sua capacidade de imagem quando as MSCs se diferenciassem, incubamos as MSCs com PBNPs e induzimos as MSCs à diferenciação osteogênica por 14 dias, em seguida, examinamos o efeito do sinal de ressonância magnética. Como mostrado na Fig. 9, os pellets das MSCs incubadas com PBNPs mostraram um claro efeito de escurecimento do sinal de MRI e o valor SI das MSCs marcadas tinha uma diferença óbvia com as MSCs não marcadas. Notavelmente, as MSCs marcadas também mostraram um claro efeito de escurecimento do sinal de MRI quando a diferenciação é induzida. Esses resultados demonstraram que os PBNPs têm potencial para serem usados como um agente de contraste T2 eficaz para imagens celulares de MSCs e podem oferecer retenção de longo prazo do agente de contraste, mesmo após a diferenciação celular.

Existem muitos dados publicados de MSCs marcados com nanopartículas magnéticas (MNPs), mas a aplicação de MNPs foi limitada por sua citotoxicidade. Ao entregar os MNPs ao tecido-alvo, a maioria dos MNPs geralmente se distribui no fígado e no baço, de modo que a toxicidade dos MNPs não pode ser negligenciada [30]. Por exemplo, Costa C descobriu que SPIONs podem produzir citotoxicidade para células neuronais e células da glia [31]. Como mencionamos acima, os PBNPs não mostraram citotoxicidade detectável e não tiveram efeitos nas características celulares das MSCs, incluindo citoesqueleto, morfologia celular e proteína funcional. Assim, a força de usar PBNPs como um agente de contraste de IRM celular ponderado em T2 eficaz seria demonstrada em termos de citotoxicidade.

Conclusões

Em resumo, introduzimos os PBNPs no rastreamento de células-tronco mesenquimais e estudamos a sobrevivência, o potencial de migração e as características celulares das MSCs após serem marcadas com os PBNPs. Além disso, também demonstramos o potencial dos PBNPs como um agente de contraste de IRM ponderado em T2 eficaz para a IRM celular de MSCs. Os PBNPs podem ser usados com eficácia para a marcação de MSCs e não irão influenciar as características biológicas das MSCs. Essa conclusão abriu um novo caminho para o rótulo de MSCs.

Abreviações

DMEM:: Meio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO:: Dimetilsulfóxido
FBS:: Soro fetal bovino
MRI:: Imagem de ressonância magnética
MSC:: Célula-tronco mesenquimal
NIR:: Próximo ao infravermelho
OD:: Densidade ótica
PBNP:: Nanopartícula de azul da Prússia
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
VSM:: Magnetômetro de amostra vibratória

Nanopartículas de albumina sérica bovina com quitosana carregada com curcumina potencialmente aumentaram a fagocitose de Aβ 42 e a polarização de macrófagos modulada na doença de Alzheimer Propriedades aprimoradas de refletância difusa e microestrutura do revestimento nanocompósito de dióxido de titânio híbrido

Nanomateriais

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