Nanodots MoSe2 biocompatíveis e direcionados a tumor @ Nanoesferas de albumina como agente de terapia de modalidade dupla para radioterapia fototérmica sinérgica

Resumo

A integração de múltiplas funções de terapia tumoral em uma nanoplataforma tem sido uma nova estratégia de terapia tumoral nos últimos anos. Aqui, um agente de terapia de modalidade dupla que consiste em nanopontos de seleneto de molibdênio (MoSe ₂ NDs) e nanoesferas montadas com albumina de soro bovino (BSA) (MoSe ₂ @BSA NSs) foi sintetizado com sucesso. Após a conjugação de moléculas de ácido fólico (FA) via "pontes" de polietilenoglicol (PEG), o FA-MoSe ₂ @BSA NSs foram equipados com função de direcionamento de tumor. As modificações BSA e PEG forneceram o MoSe instável ₂ NDs com excelente estabilidade fisiológica. Desde o produto final FA-MoSe ₂ Os NSs @BSA tinham fortes propriedades de absorção de infravermelho próximo (NIR) e de raios X, exibiam boas propriedades fototérmicas com excelente estabilidade fototérmica e capacidade de rádio-sensibilização, portanto, foram explorados como agentes de radioterapia fototérmica. Experimentos in vitro e in vivo indicaram que o FA-MoSe ₂ @BSA NSs possuía efeito de direcionamento de tumor altamente eficiente, grande biocompatibilidade e efeito de radioterapia fototérmica sinérgica. Este trabalho sugere que tal FA-MoSe biocompatível ₂ @BSA NSs pode ser um agente de terapia de tumor de modalidade dupla multifuncional promissor para uso em terapia de tumor de combinação.

Histórico

Globalmente, o câncer de mama ocorre com uma taxa de incidência muito alta em mulheres e é notório por sua baixa taxa de sobrevivência e altas taxas de metástase e recidiva [1,2,3]. Ressecção cirúrgica, radioterapia (RT) e quimioterapia são estratégias de tratamento comumente usadas na prática, embora essas terapias tenham desvantagens [4]. RT é uma terapia altamente eficaz, mas também prejudicial ao tecido normal. A RT foi explorada para aumentar o efeito terapêutico, ao mesmo tempo que diminui seus efeitos prejudiciais. RT emprega radiação ionizante (por exemplo, raios γ, raios X) para ionizar moléculas de água em radicais livres reativos que danificam o DNA em células cancerosas localmente, mesmo na região profunda [5]. Uma vez que o microambiente tumoral foi relatado como hipóxico, este foi considerado um dos principais obstáculos para a RT [6, 7]. Dadas essas desvantagens, a combinação de RT com outras estratégias terapêuticas de modalidade foi relatada como eficiente em aumentar os efeitos terapêuticos. Até o momento, a terapia fototérmica (PTT) tem sido explorada extensivamente como um tratamento contra o câncer minimamente invasivo devido a menos efeitos colaterais, alta especificidade e efeitos colaterais mínimos para tecidos normais [8,9,10,11,12,13,14,15 ] No entanto, o PTT sozinho costuma ser insuficiente, devido à supressão incompleta do tumor, especialmente para os tumores inacessíveis, que podem causar uma recidiva do tumor [16,17,18]. Curiosamente, foi relatado que o PTT leva à hipertermia induzida pelo infravermelho próximo (NIR), aumentando a circulação sanguínea intratumoral e, subsequentemente, aumentando a disponibilidade de oxigênio no microambiente tumoral, fazendo com que as células sejam mais sensíveis à RT [19,20,21]. A combinação de RT com PTT poderia combinar as vantagens de ambos, o que é preferível para melhorar os resultados terapêuticos do câncer.

Recentemente, dichalcogenetos de metais de transição (TMDs) bidimensionais (2D), como MoS ₂ , WS ₂ , ReS ₂ , e assim por diante, têm sido empregados como agentes adsorventes de NIR ou rádiossensibilizadores para aumentar a eficácia do PTT ou RT devido às suas propriedades físicas [7, 19, 21]. Shen e os co-autores relataram uma preparação ascendente de ReS ultrafino uniforme ₂ nanofolhas para PTT e RT altamente eficazes guiados por imagem [21]. Além desses TMDs, seleneto de molibdênio (MoSe ₂ ) foram relatados como um transdutor fototérmico NIR para PTT [22, 23]. Visto que o PTT sozinho tem sua desvantagem, há mais motivos para a exploração do MoSe ₂ propriedades como rádio-sensibilização para uma melhor terapia do câncer.

Neste trabalho, primeiro preparamos o ultra-pequeno MoSe ₂ nanopontos, que foram então montados com albumina de soro bovino (BSA) em nanoesferas (NSs) e finalmente conjugados com a molécula de ácido fólico (FA) de alvo tumoral via "pontes" de polietilenoglicol (PEG). Além do grande efeito fototérmico, o obtido FA-MoSe ₂ Descobriu-se que os NSs da @BSA têm excelente propriedade de sensibilização por rádio. A modificação BSA dotou o MoSe ₂ nanopontos (NDs) com excelente estabilidade fisiológica e biocompatibilidade. Experimentos in vitro e in vivo demonstraram que o FA-MoSe ₂ @BSA NSs exibiu excelente efeito de direcionamento de tumor, enquanto funcionava simultaneamente como agente fototérmico NIR e rádio-sensibilizador para radioterapia fototérmica sinérgica sem toxicidade para tecidos saudáveis.

Métodos

Materiais

FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS e CH ₃ -PEG ₅₀₀₀ -NHS foram obtidos de Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Isotiocianato de fluoresceína (FITC), albumina de soro bovino (BSA, purificado ≥ 98,0%), MoSe em massa ₂ pó e coloração com Calceína-AM (CA) -iodeto de propídio (PI) foram adquiridos na Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EUA). 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI) foram obtidos de Aladdin (Shanghai, China). Os reagentes de cultura de células foram todos fornecidos pelo kit-8 de contagem de células Corning Inc. (CCK-8) foi fornecido por Dojindo Laboratories (Japão). O anticorpo γ-H2AX foi fornecido por Millipore (Temecula, CA).

Preparação do FA-MoSe ₂ @BSA NSs

Em primeiro lugar, em um procedimento típico, 50 mg de MoSe ₂ pó foi adicionado em 25 mL de água destilada com agitação de 20 min e, em seguida, foi sonicado em um banho de gelo usando sonicação de ponta (Scientz-IID, 950 W, 25 kHz). A sonicação foi pulsada por 2 s ligada e 3 s desligada por um tempo total de sonicação de 12 h com amplitude de 70%. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 6.000 rpm por 25 min. O sobrenadante foi coletado e centrifugado novamente a 12.000 rpm por 30 min, resultando em MoSe ₂ nanopontos (MoSe ₂ NDs) solução. Posteriormente, 25 mg de pó de BSA foram adicionados ao sobrenadante acima com leve agitação, formando coacervatos endurecidos após agitação por 6 h sob 25 ° C e pH =7,4, e então foi processado por reticulação com 0,5% de glutaraldeído (250 μL). Posteriormente, o glutaraldeído foi removido por diálise em água por 1 dia, resultando no MoSe ₂ Nanoesferas @BSA (MoSe ₂ @BSA NSs). A seguir, MoSe ₂ As nanoesferas @BSA foram divididas em duas partes, uma é misturada com FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 mg), e o outro foi misturado com CH ₃ -PEG ₅₀₀₀ Solução de -NHS (8 mg) e agitada durante 2 h. Por fim, a solução foi dialisada em água para resultar em FA-MoSe ₂ purificado @BSA NSs e MoSe ₂ Solução @BSA NSs. A solução preparada foi armazenada a 4 ° C. Além disso, o espectrômetro UV-VIS foi usado para quantificar o FA no FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Em detalhes, depois de misturar MoSe ₂ Nanoesferas @BSA com FA-PEG ₅₀₀₀ -NHS (8 mg) e reagindo por 2 h, a mistura foi centrifugada para remover o FA não ligado. O sobrenadante foi coletado para detecção de absorção. A concentração de FA foi detectada por um espectrômetro UV-vis no pico de absorção de FA (280 nm). A eficiência de encapsulamento de FA (EE) foi calculada conforme descrito na seguinte equação:
$$ \ mathrm {EE} \ \ left (\% \ right) =\ frac {{\ mathrm {FA}} _ {\ mathrm {total}} - {\ mathrm {FA}} _ {\ mathrm {descarregado} }} {{\ mathrm {FA}} _ {\ mathrm {total}}} \ vezes 100 \% $$

Caracterizações de FA-MoSe ₂ @BSA NSs

A morfologia das amostras foi observada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEOL JEM2011, Tóquio, Japão) e microscópio eletrônico de varredura (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK) foi usado para o tamanho e potencial zeta. Os espectros de absorção no ultravioleta-visível (UV-Vis) foram registrados em um espectrofotômetro ultravioleta-visível UV2550 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Os espectros de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram detectados por um espectrômetro FTIR (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Alemanha). A difração de pó de raios-X (XRD) das nanoesferas foi registrada por um difratômetro de raios-X (Seifert Jso-Debyerex-2002, Alemanha). O conteúdo de Mo nas células e nos tecidos foi medido por espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES, Hitachi P4010, Japão). Durante a irradiação NIR, a variação da temperatura foi registrada a cada 30 s por meio de um termopar (Fluke, EUA).

Cultura celular e captação celular

Células de tumor mamário de camundongo 4T1 foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO ₂ .

Para a absorção celular, o FITC foi usado para marcar os NSs por meio de absorção física. As células 4T1 aderiram a lâminas de vidro em placas de 6 poços e foram incubadas com FITC livre, MoSe ₂ @BSA NSs, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA e FA-MoSe ₂ @BSA NSs na mesma concentração de FITC (0,05 mg / mL) por 3 h, respectivamente. As células foram então lavadas com PBS três vezes e fixadas com 0,2 mL de glutaraldeído, seguido de coloração com DAPI por 10 min. As imagens de fluorescência das células foram capturadas usando o microscópio de varredura a laser. Para observar melhor a captação celular, células 4T1 (2 × 10 ⁵ células / poço) foram cultivadas em placa de cultura de células de 6 poços por 24 h e, em seguida, incubadas com MoSe ₂ @BSA NSs, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA e FA-MoSe ₂ @BSA NSs por 3 h extras. Em seguida, as células tratadas foram lavadas suavemente com PBS por três vezes, homogeneizadas e tratadas com 1 mL de solução de água régia por 4 h. ICP-AES foi usado para detectar o conteúdo de Mo dentro das células. Taxa de absorção =\ (\ frac {\ mathrm {Ma}} {\ mathrm {Mb}} \) × 100%, onde Ma é a massa de Mo dentro das células e Mb é a massa de Mo total adicionado.

Biocompatibilidade In Vitro

Em primeiro lugar, sangue total de camundongos saudáveis foi coletado para detectar a hemólise in vitro do FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Em detalhe, os glóbulos vermelhos (RBCs) foram recolhidos por centrifugação. Descartando os sobrenadantes, os RBCs coletados foram misturados com FA-MoSe ₂ @BSA NSs (em PBS, 1:4) em concentrações predeterminadas (50 μg / mL, 100 μg / mL, 150 μg / mL, 200 μg / mL e 400 μg / mL). Como controle positivo ou negativo, os RBCs foram incubados com água desionizada ou PBS. Depois de permanecer incubado a 37 ° C por 1 h, o conjunto de suspensões acima foi centrifugado (10.000 rpm, 1 min) e a absorvância dos sobrenadantes a 541 nm foi monitorada por um espectrômetro UV-Vis. A taxa de hemólise foi calculada usando a seguinte equação.
$$ \ mathrm {HR} \ \ left (\% \ right) =\ frac {\ {A} _t- {A} _ {nc}} {A_ {pc} - {A} _ {nc}} \ times 100 \% $$
onde A _t , A _pc e A _nc são a absorbância do sobrenadante a 541 nm da amostra teste, controles positivos e negativos, respectivamente.

Além disso, a citotoxicidade de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs foi detectado por um ensaio CCK-8 padrão. Células 4T1 (1 × 10 ⁵ células / mL, 0,5 mL) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h. Depois de descartar o meio antigo, meio novo contendo 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 e 0,4 mg / mL de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs foram incubados com células 4T1 durante 24 h. PBS foi usado para lavar suavemente as células três vezes. Uma solução de trabalho CCK-8 de 100 μL (10% CCK-8 + 90% DMEM) foi então adicionada a cada poço, seguido por incubação a 37 ° C por 1 h. O valor de absorvância a 450 nm foi detectado usando um leitor de microplacas (Labtech, Inc., Durham, Carolina do Norte).

Radioterapia fototérmica in vitro

Primeiramente, o desempenho fototérmico in vitro dos NSs foi investigado. MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs com as mesmas concentrações de Mo cultivadas com células por 3 he então irradiadas por irradiação NIR por 5 min (808 nm, 1 W / cm ² ) A temperatura das células tratadas em cada poço foi detectada com uma câmera térmica infravermelha (Fluke TI25, EUA), respectivamente.

Em seguida, para terapia fototérmica in vitro, células 4T1 aderentes foram cultivadas com diferentes concentrações de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs por 3 h. Os NSs fora das células foram removidos. As células foram então tratadas com ou sem NIR (808 nm, 1 W / cm ² , 5 min) e dosagem diferente de irradiação de raios-X (RT, 0–5 Gy, 0,084 Gy / s). Após outra incubação de 24 horas, a viabilidade celular foi detectada por um ensaio CCK-8 padrão. As células tratadas acima foram ainda co-coradas por calceína-AM / PI para detectar as células vivas e mortas e, em seguida, fotografadas por um microscópio confocal de varredura a laser (calceína-AM:Ex =488 nm, Em =515 nm; PI:Ex =535 nm, Em =617 nm). Além disso, as células tratadas também foram analisadas por imunofluorescência γ-H2AX. Após o tratamento acima, as células foram fixadas em paraformaldeído 4% por 10 min e permeabilizadas com metanol por 15 min a -20 ° C e lavadas com PBS. Posteriormente, as células foram misturadas com um tampão de bloqueio (1% BSA em solução PBS) por 1 h a 25 ° C e posteriormente incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-fosfo-histona γ-H2AX (diluição 1:500) durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem com PBS, a fluorescência das células foi observada por microscópio confocal de varredura a laser.

Modelo Animal

Camundongos nus Balb / c (5–8 semanas de idade) foram fornecidos pela Charles River Laboratories (Pequim, China). Para estabelecer o modelo de tumor 4T1 animal, 150 μL de 10 ⁶ as células em suspensão foram injetadas subcutaneamente nas costas do camundongo. Os ratos foram alimentados na sala dos animais e observados a cada 2 dias. Todos os procedimentos experimentais e de bem-estar neste estudo foram realizados de acordo com as políticas do Ministério da Saúde Nacional e aprovados pelo Comitê de Ética do First People’s Hospital of Shangqiu City. Quando o volume do tumor atingiu 100 mm ³ , os camundongos foram aplicados em experimentos in vivo.

Biodistribuição In Vivo e Circulação de Sangue

A biodistribuição sistêmica dos NSs foi investigada em camundongos com tumor 4T1. Em 1 h, 1 dia, 7 dias e 24 dias após a injeção intravenosa de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA (10 mg / kg), o tumor e os órgãos principais (coração, fígado, baço, pulmão e rim) foram pesados e digeridos por solução de água régia 12 h. O conteúdo de Mo e Se nesses tecidos foi analisado por um ICP-AES. Além disso, camundongos Balb / c saudáveis foram injetados por via intravenosa com FA-MoSe ₂ @BSA (10 mg / kg). Aproximadamente 10 μL de sangue da cauda dos camundongos foram coletados e analisados por um ICP-AES para circulação sanguínea.

Radioterapia fototérmica in vivo

Para radioterapia fototérmica in vivo, camundongos com tumor ( n =5 por grupo) foram tratados com PBS + NIR, PBS + RT, MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR e FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT (com 5 mg / kg de MoSe ₂ ) A dose de radioterapia foi de 5 Gy. Em 24 horas após a injeção intravenosa, a região do tumor foi irradiada por 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) Durante a irradiação, as imagens térmicas dos camundongos foram registradas por câmera térmica infravermelha. Nos 30 dias seguintes, o comprimento e a largura do tumor foram monitorados a cada 4 dias. O volume relativo do tumor foi calculado como V / V ₀ , onde V ₀ representa o volume do tumor quando o tratamento foi iniciado. Enquanto isso, o peso corporal de cada camundongo também foi monitorado a cada 4 dias.

Biocompatibilidade In Vivo

Para biocompatibilidade in vivo, 150 μL de FA-MoSe ₂ @BSA NSs (15 mg / kg) foi injetado por via intravenosa em camundongos nus Balb / c saudáveis. Antes da injeção e após 30 dias, o sangue foi coletado para avaliações de hemogramas completos, incluindo glóbulos brancos (WBC), glóbulos vermelhos (RBC), hemoglobina (HGB), volume plaquetário médio (MPV), hemoglobina corpuscular média (MCH), hematócrito (HCT), concentração média de hemoglobina corpuscular (MCHC), volume corpuscular médio (MCV) e plaquetas (PLT). Ao mesmo tempo, os camundongos foram sacrificados e o coração, fígado, baço, pulmão e rim foram coletados. Os órgãos obtidos foram fixados com paraformaldeído 4% e seccionados em fatias de 5 μm e corados com hematoxilina e eosina (H&E). As seções coradas foram fotografadas por um microscópio digital.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± DP. Aluno bicaudal t teste foi usado para analisar a significância estatística de dois grupos. As diferenças foram consideradas significativas para * P <0,05 e altamente significativo para ** P <0,01.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de FA-MoSe ₂ @BSA NSs

O procedimento de preparação do FA-MoSe ₂ @BSA NSs está representado na Fig. 1a. Resumidamente, MoSe instável ₂ nanopontos foram preparados a partir de MoSe em massa ₂ sob ultrassonicação, então estabilizado e montado pela proteína BSA e conjugado simultaneamente à molécula alvo FA via "pontes" de PEG. O MoSe preparado ₂ NDs eram nanopontos ultrapequenos, conforme observado em TEM (Fig. 1b). O padrão XRD de MoSe ₂ NDs foi mostrado no arquivo adicional 1:Figura S1. O pico de difração em 13,1 ° pertence ao plano (002), correspondendo à posição do pico do MoSe em massa ₂ . O pico distinto (002) indica a existência de poucas camadas no eixo c de MoSe ₂ NDs. O pico de difração do plano (100) para MoSe ₂ NDs amplia significativamente em comparação com MoSe em massa ₂ , que pode se originar da redução de tamanho do MoSe ₂ NDs [23]. Após a montagem e conjugação com a proteína BSA e FA, os nanocompósitos formaram partículas semelhantes a esferas (Fig. 1c). Os espectros de FTIR mostraram a existência de ligação –CONH- em FA-MoSe ₂ @BSA NSs, indicando que FA provavelmente foi conjugado em MoSe ₂ através da ligação éster (Arquivo adicional 1:Figura S2). Além disso, quantificamos o FA no FA-MoSe ₂ Nanoesferas @BSA, que era de 10,5 ± 0,11%. A análise DLS revelou que os diâmetros médios de MoSe ₂ NDs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs foram aproximadamente 3,8 nm e 139,8 nm, respectivamente (Fig. 1d). Após 7 dias de armazenamento, o tamanho do MoSe ₂ NDs aumentou de 3,8 para 63,2 nm, enquanto FA-MoSe ₂ @BSA NSs não mostrou nenhuma mudança óbvia no tamanho (Fig. 1e), indicando agregação e a baixa estabilidade de MoSe ₂ NDs em armazenamento de longo prazo. Além disso, quando disperso em diferentes meios como água, PBS e meio celular, FA-MoSe ₂ @BSA NSs exibiu distribuição de tamanho semelhante (Fig. 1f). Esses resultados indicaram o FA-MoSe ₂ @BSA NSs são estáveis em condições fisiológicas e esta estabilidade melhorada do MoSe ₂ NDs é provavelmente atribuído à montagem de BSA e revestimento de PEG [24, 25]. Como mostrado na Fig. 1g, o espectro ultravioleta-visível (UV-Vis) de MoSe ₂ NDs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs tinham características de absorbância NIR similarmente altas, indicando que as modificações de BSA e FA não afetaram a absorbância de MoSe ₂ .

a Um esquema do FA-MoSe ₂ Síntese @BSA NSs . b Imagem TEM de MoSe ₂ NDs. Inserido estava a imagem TEM de alta resolução. c As imagens TEM e SEM do FA-MoSe ₂ @BSA NSs. d A distribuição de tamanho do MoSe ₂ NDs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs. e A mudança de tamanho de MoSe ₂ NDs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs na água durante 7 dias. f A distribuição de tamanho de FA-MoSe ₂ @BSA NSs em água, PBS e meio, respectivamente. g Os espectros de absorbância de MoSe ₂ NDs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs

Efeito fototérmico de FA-MoSe ₂ @BSA NSs

A Figura 2a mostra que a temperatura de FA-MoSe ₂ A solução @BSA NSs aumentou com o aumento das concentrações (0–200 μg / mL). Após a irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) por 5 min, a mudança de temperatura de FA-MoSe ₂ A solução @BSA NSs a 200 μg / mL atingiu aproximadamente 41 ° C, enquanto a temperatura da água pura aumentou apenas cerca de 1,5 ° C nas mesmas condições. Além disso, a mudança de temperatura do FA-MoSe ₂ @BSA NSs irradiados sob diferentes intensidades de potência (0,5–2,0 W / cm ² ) por 5 min também foi registrado. Conforme mostrado na Fig. 2b, a temperatura aumentou até um máximo de 40,6 ° C com o aumento da intensidade da potência do laser. A Figura 2c representa a fotoestabilidade de FA-MoSe ₂ @BSA NSs, implicando que o FA-MoSe ₂ @BSA NSs manteve seus excelentes efeitos fototérmicos sem qualquer atenuação da elevação da temperatura após três ciclos de irradiação NIR. Estes resultados demonstraram que FA-MoSe ₂ @BSA NSs teve fotoestabilidade significativa e excelentes propriedades fototérmicas. Como mostrado na Fig. 2d, os valores da unidade Hounsfield (HU) de FA-MoSe ₂ As imagens do @BSA NSs obtidas com tomografia computadorizada (TC) foram positivamente correlacionadas com suas concentrações, indicando que os NSs poderiam ser potencialmente usados como um rádio-sensibilizador.

a Curvas de aquecimento fototérmico de FA-MoSe ₂ Solução @BSA NSs em diferentes concentrações (0, 50, 100 e 200 μg / mL) sob irradiação de laser de 808 nm na densidade de potência de 1 W / cm ² . b Curvas de aquecimento fototérmico de FA-MoSe ₂ Solução @BSA NSs a 100 μg / mL sob irradiação de laser de 808 nm em diferentes densidades de potência (0,5, 1, 1,5 e 2 W / cm ² ) c Variações de temperatura de FA-MoSe ₂ @BSA NSs sob três ciclos de irradiação de laser de 808 nm na densidade de potência de 1 W / cm ² . d Imagens CT (inseridas) e valores HU de FA-MoSe ₂ @BSA NSs com diferentes concentrações

Captação celular e biocompatibilidade in vitro

Para avaliar a absorção celular, MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs foram rotulados pela FITC. Conforme representado na Fig. 3a, uma fluorescência FITC muito mais forte foi observada dentro do citoplasma em FA-MoSe ₂ Células tratadas com @BSA NSs, em comparação com as de MoSe ₂ @BSA NSs- e células tratadas com FITC livres. A análise quantitativa de ICP-AES mostrou maior captação celular de FA-MoSe ₂ @BSA NSs do que MoSe ₂ @BSA NSs (Fig. 3b). Estes resultados demonstraram que o FA aumentou a absorção celular de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Curiosamente, após um bloqueio de FA, o FA-MoSe ₂ As células tratadas com @BSA NSs mostraram fluorescência FITC verde mais fraca dentro do citoplasma em comparação com aquela sem bloqueio de FA. Correspondente, a taxa de absorção celular de FA-MoSe ₂ @BSA NSs + células tratadas com FA é menor do que FA-MoSe ₂ Células tratadas com @BSA NSs. Isso indica que o receptor de FA na membrana celular é impedido (por FA livre), por sua vez, reduz a capacidade de direcionamento e acessibilidade de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Demonstra ainda que o receptor FA é superexpresso em células 4T1 e FA-MoSe2 @ BSA NSs entra nas células provavelmente através de uma via de endocitose mediada por receptor [26, 27].

a Imagens de fluorescência confocal de células 4T1 após incubação com FITC livre e MoSe rotulado com FITC ₂ @BSA NSs, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA bloqueio e FA-MoSe ₂ @BSA NSs. As cores vermelha e azul representam fluorescência FITC e núcleos de células coradas com DAPI, respectivamente. b Análise quantitativa ICP-AES de células 4T1 para MoSe ₂ @BSA NSs, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + FA bloqueio e FA-MoSe ₂ @BSA NSs

A biocompatibilidade in vitro dos NSs foi avaliada por análises de hemólise e citotoxicidade. A Figura 4a não mostrou hemólise óbvia para FA-MoSe ₂ Glóbulos vermelhos tratados com @BSA NSs (RBCs) ou RBCs tratados com PBS. Além disso, quando as concentrações de até 0,4 mg / mL de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs foram incubados com células por 24 h, havia menos de 10% de supressão de viabilidade. Esses resultados sugeriram que o FA-MoSe ₂ @BSA NSs tem grande biocompatibilidade in vitro.

a Razão de hemólise de RBCs após 1 h de incubação com FA-MoSe ₂ @BSA NSs em diferentes concentrações. A inserção mostra a fotografia de RBCs expostos a água destilada, PBS e FA-MoSe ₂ @BSA NSs com diferentes concentrações seguidas de centrifugação. b Viabilidade celular de células 4T1 após tratamento com MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs em diferentes concentrações por 24 h

Radioterapia fototérmica in vitro

Como mostrado na Fig. 5a, b, células tratadas com FA-MoSe ₂ @BSA NSs mostrou o maior aumento de temperatura (ΔT =23,6 ° C) após 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) em comparação com MoSe ₂ @BSA NSs- e células tratadas com PBS. A Figura 5c mostrou um aumento da eficácia de RT pela adição de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. Com o aumento das doses de raios-X, a eficácia RT de FA-MoSe ₂ Os NSs do @BSA melhoraram muito mais do que o MoSe ₂ @BSA NSs. Foi demonstrado que FA-MoSe ₂ @BSA NSs podem aumentar o efeito da radioterapia, provavelmente devido à sua capacidade de atenuação de raios-X que poderia concentrar a energia da radiação de raios-X dentro das células tumorais e gerar elétrons Auger secundários, resultando em dano ao DNA e supressão do crescimento celular [28, 29].

a Imagens térmicas de PBS, MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ Células tratadas com @BSA NSs e b as curvas de mudança de temperatura correspondentes sob irradiação contínua com um laser de 808 nm (1 W / cm ² ) c Viabilidade celular de 4 células T1 tratadas com PBS, MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs combinados com diferentes doses de irradiação de raios-X (0–5 Gy). d Viabilidade celular de células 4T1 tratadas com diferentes amostras sob laser NIR de 808 nm (5 min, 1 W / cm ² ) e irradiação de raios-X (5 Gy)

Para avaliação adicional do efeito terapêutico combinado de RT e PTT, as células 4T1 foram tratadas apenas com NIR ou RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR ou FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT. Conforme mostrado na Fig. 5d, FA-MoSe ₂ O grupo tratado com @BSA NSs + NIR + RT exibiu a morte celular dependente da concentração mais significativa, com taxa de supressão de 92,8%. O excelente efeito terapêutico do FA-MoSe ₂ @BSA NSs foi provavelmente devido a (1) ablação fototérmica de PTT e danos no DNA por RT de FA-MoSe ₂ @BSA NSs, e (2) FA direcionado melhorou a internalização celular de FA-MoSe ₂ @BSA NSs e, portanto, a geração de mais calor e raios-X para matar as células.

Como mostrado na Fig. 6a, poucas células mortas puderam ser observadas nos grupos de controle PBS + NIR e PBS + RT. Mesmo que células mortas tenham sido encontradas em FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT ou FA-MoSe ₂ @BSA NSs + grupos NIR, mas ainda existiam células vivas. Por outro lado, no FA-MoSe ₂ Grupo @BSA NSs + NIR + RT, mais de 95% das células foram danificadas e mostraram fluorescência vermelha, indicando que RT e PTT combinados de FA-MoSe ₂ @BSA NSs pode aumentar a eficiência terapêutica.

a Morto-vivo e b Imagens de coloração de γ-H2AX de células 4T1 tratadas com PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NSs, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe ₂ @BSA NSs + RT e FA-MoSe ₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectivamente

Desde FA-MoSe ₂ @BSA NSs têm alta absorbância de raios-X, seria potencial ter a capacidade de melhorar o RT. Como mostrado na Fig. 6b, níveis muito baixos de sinais de γ-H2AX foram observados nos grupos tratados com PBS, FA-MoSe ₂ @BSA NSs apenas, e FA-MoSe ₂ @BSA NSs + grupos tratados com NIR. Enquanto isso, FA-MoSe ₂ O grupo tratado com @BSA NSs + NIR + RT mostrou níveis mais elevados de sinais γ-H2AX, indicando danos mais significativos ao DNA no interior dos núcleos das células. Estes resultados demonstraram que FA-MoSe ₂ @BSA NSs poderia aumentar o efeito RT atribuindo a sua capacidade de atenuação de raios-X, que concentraria a energia da radiação de raios-X dentro das células tumorais e geraria elétrons secundários e Auger para causar danos ao DNA e supressão do crescimento celular [30-32].

Biodistribuição In Vivo e Circulação de Sangue

Como mostrado na Fig. 7a, b, 24 horas após a injeção, os elementos Mo e Se acumularam no tumor, exceto para o fígado e rim. O conteúdo dos elementos de Mo no tecido tumoral pós-injeções de MoSe ₂ @BSA NSs e FA-MoSe ₂ @BSA NSs também foram avaliados. Como mostrado na Fig. 7c, os níveis de Mo no tecido tumoral para FA-MoSe ₂ O grupo tratado com @BSA NSs aumentou com o tempo e atingiu o pico 24 horas após a injeção, que foi maior do que o de MoSe ₂ Grupo tratado com @BSA NSs. A Figura 7d mostra a curva de circulação sanguínea de Mo em diferentes pontos de tempo pós-injeção de FA-MoSe ₂ @BSA NSs. O Mo t _1/2 α (meia-vida de distribuição do sangue) e t _1/2 β (meia-vida de eliminação terminal do sangue) do FA-MoSe ₂ O grupo @BSA NSs é de 0,91 ± 0,06 he 16,96 ± 1,3 h, respectivamente. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

O a Mo e b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm² ) The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

a In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm² ) b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

a H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Conclusões

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.