Terapia Fototérmica com Nanotubos de Carbono Direcionada Mais Inibição de Checkpoint: Nova Estratégia para Câncer de Mama Metastático

Resumo

Os maiores contribuintes para a mortalidade por câncer são metástase e as consequências de seu tratamento. Aqui, apresentamos um novo tratamento de câncer de mama metastático que combina terapia fototérmica com nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs) direcionados e imunoestimulação com inibidor de checkpoint. Descobrimos que a ablação fototérmica seletiva de tumores ortotópicos primários de mama EMT6 em camundongos BALB/cJ singênicos usando um bioconjugado de SWCNT funcionalizado com anexina A5 (ANXA5) aumenta sinergicamente uma resposta abscopal dependente de anti-proteína 4 associada a linfócito T citotóxico (anti-CTLA-4), resultando em sobrevivência aumentada (55%) aos 100 dias após inoculação do tumor. Em comparação, não houve sobrevivência aos 100 dias para terapia fototérmica por si só ou imunoestimulação por si só. Antes da terapia fototérmica, o bioconjugado SWCNT-ANXA5 foi administrado sistemicamente em dose relativamente baixa de 1,2 mg/kg, onde então se acumulou na vasculatura tumoral via ligação dependente de ANXA5. Durante a terapia fototérmica, a temperatura máxima média no tumor atingiu 54 °C (duração 175 s). O mecanismo de sobrevivência prolongada resultante da ablação fototérmica combinatória e estimulação imune foi avaliado por quantificação citométrica de fluxo de células efetoras imunes antitumorais esplênicas e quantificação de citocinas séricas.

Introdução

Metástase e as consequências de seu tratamento são a única maior causa de morte em câncer. Por exemplo, quando o câncer de mama metastatiza, as taxas de sobrevivência de 5 anos dos pacientes caem abaixo de 25%. Mesmo que nos últimos 60 anos mais de 200 novos fármacos antineoplásicos tenham melhorado os resultados dos pacientes, a sobrevivência geral permanece pobre na doença metastática. Aqui, uma nova combinação de terapia fototérmica facilitada por um bioconjugado de nanotubo de carbono de parede única (SWCNT) direcionado a tumor e inibição de checkpoint anti-proteína 4 associada a linfócito T citotóxico (anti-CTLA-4) é estudada para tratamento de câncer de mama metastático em modelo murino ortotópico.

As propriedades únicas dos SWCNTs como nanomaterial geraram interesse significativo em seu uso como ferramenta potencial na luta contra o câncer. Embora os SWCNTs exerçam uma variedade de efeitos biológicos, o uso de SWCNTs no tratamento de câncer tem se concentrado principalmente em sua interação com luz infravermelha próxima (NIR) e o efeito fototérmico resultante, onde SWCNTs aquecem rapidamente o tumor no processo chamado terapia fototérmica (PTT). Numerosos grupos investigaram o potencial para SWCNTs serem usados em estratégias de tratamento baseadas em PTT em vários modelos de câncer de mama. Estes trabalhos focaram amplamente na capacidade de PTT de tratar tumores primários em profundidades não maiores que vários mm, onde a atenuação da luz NIR é quase completa.

Anteriormente, mostramos que tumores primários ortotópicos de mama em camundongos singênicos poderiam ser quase completamente eliminados usando luz laser NIR branda em conjunto com um bioconjugado SWCNT de aumento fototérmico. Neste bioconjugado, os SWCNTs foram funcionalizados com a proteína anexina A5 (ANXA5), que se liga com alta afinidade ao fosfolipídeo aniônico fosfatidilserina expresso externamente em células tumorais e em células endoteliais da vasculatura tumoral, mas não em células normais na vasculatura. Este conjugado foi visualizado usando microscopia de força atômica (AFM) para mostrar que a altura do conjugado estava entre 2,5 e 5,0 nm, que é similar àquela para outros conjugados SWCNT-proteína. Embora capaz de erradicar tumores primários neste modelo metastático anterior, a terapia fototérmica por si só apenas estendeu modestamente a sobrevivência. No entanto, encontramos evidências preliminares sugerindo que tratamento concomitante com imunomoduladores como ciclofosfamida era capaz de aumentar a sobrevivência.

Recentemente, o potencial para imunomoduladores como ciclofosfamida aumentarem sinergicamente PTT direcionada por SWCNT tem sido objeto de muito interesse. Uma categoria de agentes imunomoduladores promissores são inibidores de checkpoint. Inibidores de checkpoint são anticorpos como anti-CTLA-4, anti-PD-1, e anti-PDL-1 que ligam proteínas celulares críticas responsáveis por modular a resposta do corpo ao câncer. Estes anticorpos bloqueiam "checkpoints" biológicos chave onde o corpo pode regular negativamente a resposta do sistema imune ao câncer. Estas proteínas normalmente servem um papel importante no controle da resposta imunológica do corpo. Ao bloquear a ação destas proteínas, inibidores de checkpoint removem um mecanismo pelo qual o sistema imune normalmente suprime sua resposta antitumoral natural. Recentemente, vários grupos observaram que a combinação de inibição de checkpoint anti-CTLA-4 com PTT aumentada por SWCNT tem o potencial de promover uma resposta imune robusta em câncer de mama.

No estudo atual, avaliamos a combinação de nossa nova modalidade PTT em conjunto com o agente imunoestimulatório anti-proteína 4 associada a linfócito T citotóxico (anti-CTLA-4). Originalmente aprovado para tratamento de melanoma metastático, anti-CTLA-4 agora está sendo testado para tratamento de câncer de mama em ensaios clínicos combinado com outros agentes imunoestimulatórios. Avaliamos o mecanismo de imunidade antineoplásica aprimorada em PTT em combinação com inibição de checkpoint anti-CTLA-4, bem como o destino a longo prazo de SWCNTs em órgãos alvo.

Materiais e Métodos

Materiais

O plasmídeo codificando ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, foi previamente construído neste laboratório. Albumina sérica bovina (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoetanol, fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), e tampão Tris-acetato-EDTA foram da Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Fosfato de sódio e dodecil sulfato de sódio (SDS) foram da Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Etanol grau HPLC foi da Acros Organics (Waltham, MA). Colunas His-trap foram da GE Healthcare (Chicago, IL). Tampão de coloração para citometria de fluxo, tampão de fixação/permeabilização, tampão de permeabilização, kit de quantificação cromogênica de endotoxina, e cassetes de diálise Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) foram da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Membranas de diálise de 2 e 100 kDa foram da Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Meio de cultura celular Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e solução salina balanceada de Hank's foram da ATCC (Manassas, VA). Soro fetal bovino (FBS) foi da Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Triptona, extrato de levedura, e monossulfato de kanamicina foram obtidos da Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Hidróxido de sódio, cloreto de potássio, e cloreto de sódio foram da VWR Inc (Radnor, PA). Protease HRV-C3 foi da Sino Biologics (Portland, OR). Anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 de camundongo (clone: 9H10) e kits ELISA de citocinas de camundongo (TNF-α, IFN-γ, IL-6) foram obtidos da BioLegend (San Diego, CA). SWCNTs CoMoCAT (diâmetro médio 0,8 ± nm, comprimento médio 1,5 ± 0,5 µm) foram obtidos da CHASM (Boston, MA). O método CoMoCAT é conhecido por produzir SWCNT de um pequeno número de quiralidades (n,m) com alta seletividade. A amostra usada neste estudo é altamente enriquecida em SWCNTs [5, 6], que exibe forte absorção de luz NIR em comprimento de onda de 980 nm. Esta absorção corresponde à transição S₁₁ para este tipo de nanotubo entre uma singularidade de van Hove ocupada à correspondente desocupada. Portanto, para maximizar a absorção de radiação pelos SWCNTs depositados nos tumores, o comprimento de onda do laser usado neste estudo foi 980 nm para corresponder exatamente à transição óptica S₁₁. A Figura S1 no Arquivo Adicional 1 mostra os espectros de fluorescência, mostrando claramente a emissão NIR S₁₁ após excitar a transição S22 com luz visível.

Cultura Celular

Células de câncer de mama EMT6 da ATCC (Manassas, VA) foram cultivadas em meio Waymouth's MB 752/1 com 2 mM L-glutamina suplementado com 15% FBS. Todas as células foram cultivadas a 37 °C e 100% umidade sob 5% CO₂. Todas as células foram passadas usando 0,25% (p/v) tripsina em 0,53 mM EDTA. Linhagem celular e status livre de micoplasma foram confirmados via teste STR (Charles River) e ensaiados como livres de endotoxina por ensaio limulus.

Produção de ANXA5 e SWCNT-ANXA5

O conjugado SWCNT-ANXA5 foi preparado usando um procedimento que desenvolvemos previamente que dá 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT. Brevemente, E. coli transfectado com plasmídeo codificando ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, foram cultivados e purificados usando cromatografia de afinidade por metal imobilizado com Ni²⁺ imobilizado para isolar ANXA5, que envolveu clivagem enzimática para remover uma tag (His)₆. SWCNTs CoMoCAT liofilizados foram dispersos em 1% dodecil sulfato de sódio (SDS) usando dois ciclos de sonicação com sonda a 20 W e centrifugação a 29.600 g por 30 min cada. Os SWCNTs suspensos foram caracterizados por fluorescência NIR (Arquivo Adicional 1: Figura S1) e então conjugados a um ligante 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-polietileno glicol-maleimida (DSPE-PEG-maleimida) por 30 min à temperatura ambiente para permitir interação hidrofóbica entre SWCNTs e o grupo funcional DSPE. Isso foi seguido por diálise de 8 h em água destilada para remover excesso de ligante e SDS. O conjugado dialisado foi então reagido com ANXA5, que contém um grupo cisteína, por 2 h e bloqueado com 1,5 mg mL⁻¹ L-cisteína. O produto final, SWCNT-ANXA5, foi dialisado contra tampão fosfato de sódio 20 mM por 8 h para remover excesso de ANXA5 e L-cisteína. Peso e pureza da proteína foram caracterizados via SDS-PAGE. O conteúdo de SWCNT e ANXA5 do bioconjugado foi caracterizado por espectroscopia UV-Vis-NIR de fluorescência, análise de Fourier-transform infravermelho (FT-IR) Raman, e ensaio Bradford (Arquivo Adicional 1: Figura S2).

Estudos In Vivo

Todos os procedimentos cumpriram com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Oklahoma. Camundongos fêmeas BALB/cJ de 6 semanas de idade foram usados (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Camundongos foram alimentados com dieta padrão. Durante irradiação fototérmica de tumores com luz laser NIR, camundongos foram anestesiados com 2% isoflurano e 98% oxigênio usando cone nasal.

Tumores foram induzidos por injeção ortotópica de 10⁶ células de câncer de mama de camundongo EMT6 em 100 µL de PBS na almofada de gordura mamária IV. Tumores foram permitidos crescer por 12 dias, e quando atingiram volume de 60 mm³ (~ 5 mm de diâmetro), camundongos receberam injeção sistêmica i.v. de 1,2 mg/kg de bioconjugado SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT por kg peso corporal) via veia lateral da cauda. Após 3 h, uma região de 5 mm em excesso do limite do tumor foi irradiada com luz NIR (980 nm) em nível de energia e potência de 175 J/cm² e 1 W/cm², respectivamente (tempo de 175 s; laser NIR Diodevet-50, B&W Tek Inc., Newark, DE). Inibição de checkpoint foi realizada por administração serial i.p. de 200 µg anticorpo anti-CTLA-4 em 100 µL de PBS nos dias 8, 11 e 16 após inoculação do tumor. Volume do tumor foi calculado com a fórmula elipsoide modificada V = 1/2 × comprimento × largura² usando medidas de paquímetro da dimensão mais longa e largura perpendicular. Temperatura do tumor foi monitorada por câmera térmica portátil FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK) configurada para varredura automática de temperatura máxima detectada. Órgãos alvo foram colhidos para avaliação de toxicidade e fixados em formalina neutra tamponada 10%, e lâminas de parafina fixada em formalina (FFPE) preparadas foram coradas com hematoxilina e eosina para análise de toxicidade.

Detecção Ex Vivo de SWCNT

Camundongos receberam injeção sistêmica de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg peso corporal) via veia lateral da cauda. Em pontos de tempo selecionados, camundongos (n = 3) foram eutanasiados, necropsiados, e órgãos alvo removidos para análise. Amostras de tecido foram preparadas como descrito anteriormente. A presença de SWCNTs em amostras de tecido ex vivo foi então determinada por espectroscopia de fluorescência NIR relativa usando um NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Citometria de Fluxo

Camundongos foram eutanasiados 14 dias pós-tratamento, e células efetoras imunes antitumorais esplênicas foram quantificadas como descrito anteriormente.

Detecção de Citocinas

Após tratamento como descrito acima, camundongos (n = 4–5) foram eutanasiados 7 dias após terapia fototérmica para coleta de sangue. A concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (IFN-γ), e interleucina 6 (IL-6) em amostras de soro diluídas foi quantificada por ELISA de acordo com o protocolo do fornecedor.

Análise Estatística

Dados foram analisados com software Graphpad Prism. Significância estatística foi avaliada usando ANOVA de uma via e teste de comparações múltiplas Tukey-Kramer. Significância estatística de curvas de sobrevivência foi determinada pelo teste log-rank Mantel-Haenszel. Significância estatística de concentração sérica de citocinas foi analisada por ANOVA de uma via e teste de comparações múltiplas de Dunnett. Comparações múltiplas foram corrigidas pelo limiar Bonferroni. Erro é representado graficamente como erro padrão da média a menos que o erro não excedesse o tamanho do símbolo de ponto médio plotado, caso em que as barras foram excluídas para clareza.

Resultados

Cinética Térmica

Usando dose de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, a temperatura máxima dos tumores foi registrada ao longo do tratamento com luz NIR, como indicado na Fig. 1. Camundongos que receberam SWCNT-ANXA5 antes da irradiação tiveram temperaturas de tumor mais altas durante todo o tratamento com luz NIR comparados a camundongos que receberam soro fisiológico. A temperatura média do tumor para camundongos recebendo SWCNT-ANXA5 foi significativamente diferente daquela para camundongos recebendo soro fisiológico (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Como resultado desta terapia fototérmica aprimorada, apenas no grupo SWCNT-ANXA5 ocorreu ablação tumoral visível. Ablação tumoral foi caracterizada por descoloração rápida, seguida por contração da pele e aparecimento de rugas. Dentro de 48 h, uma escara significativa formou-se no local de ablação fototérmica. Recrescimento completo da pele levou várias semanas.

Cinética térmica resultante da radiação de tumores com luz NIR a 980 nm. Camundongos BALB/cJ portadores de tumores EMT6 foram injetados por i.v. na veia da cauda com 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. Após esperar 3 h para permitir clearance de SWCNTs da circulação, tumores foram irradiados com laser NIR a densidade de energia e potência de 175 J/cm² e 1 W/cm², respectivamente (t = 175 s). A temperatura máxima do tumor foi registrada como função do tempo. A temperatura dos tumores de camundongos recebendo SWCNT foi significativamente maior que para camundongos recebendo soro fisiológico em t = 175 s (p < 0,05). Dados apresentados como média ± EP (n = 3)

Terapia Fototérmica e Inibição de Checkpoint

Os resultados da combinação de terapia fototérmica com inibição de checkpoint usando anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 são mostrados na Fig. 2. Enquanto a terapia fototérmica por si só prontamente erradicou neoplasia primária de câncer de mama, a incapacidade da luz laser NIR de penetrar além de alguns mm limitou o tratamento de metástase de câncer de mama. Para superar as deficiências do tratamento antineoplásico fototérmico NIR localizado, exploramos a combinação desta modalidade terapêutica única com inibição de checkpoint sistêmica (Fig. 2). Enquanto a terapia fototérmica se destacou na destruição de tumores EMT6 primários (Fig. 2a), este tratamento falhou em erradicar metástase e apenas aumentou modestamente a sobrevivência de camundongos portadores de tumores ortotópicos EMT6 (Fig. 2b). Em contraste, inibição de checkpoint com anti-CTLA-4 aumentou a sobrevivência geral mas apenas atrasou temporariamente o crescimento do tumor primário. Embora nenhuma terapia por si só tenha produzido aumentos na sobrevivência geral, a combinação de ambas terapia fototérmica aumentada por SWCNT-ANXA5 e inibição de checkpoint anti-CTLA-4 melhorou a sobrevivência geral, levando a 55% de sobrevivência aos 100 dias pós-inoculação do tumor.

Resultados de terapia fototérmica (PTT) combinatória e inibição de checkpoint (anti-CTLA-4) em tumores EMT6. Camundongos com tumores ortotópicos singênicos bem desenvolvidos (d ≥ 5 mm) foram administrados dose sistêmica i.v. de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. a Volumes de tumor foram então monitorados após irradiação (seta) com luz laser NIR por 175 s a densidade de potência de 1 W/cm² no dia 12 após inoculação. Além de PTT, grupos selecionados receberam anti-CTLA-4 (100 µg) nos dias 8, 11 e 16. Camundongos no grupo controle foram injetados i.v. com soro fisiológico. Volume de tumor mostrado como média ± EP (n = 7). Significância comparada ao controle indicada por * (p < 0,05). b A combinação de terapia fototérmica e inibição de checkpoint imune aumentou significativamente a sobrevivência comparada a controles (p < 0,05, n = 7). c, d Apenas quando camundongos receberam terapia fototérmica em conjunto com inibição de checkpoint anti-CTLA-4 foram observados aumentos significativos nos números relativos de esplenócitos CD4⁺ e CD8⁺ 2 semanas após PTT. Esplenócitos mostrados como média ± EP (n = 3). Significância indicada por *** (p < 0,005)

Análise citométrica de células efetoras esplênicas após tratamento revelou um mecanismo putativo de sobrevivência melhorada em camundongos recebendo terapia fototérmica combinatória e inibição de checkpoint. Camundongos foram inoculados com EMT6 e tratados como descrito anteriormente. Duas semanas após tratamento, camundongos foram sacrificados e tanto as porcentagens quanto o número relativo de múltiplos tipos de efetores imunes foram quantificados. Populações de células T auxiliares, células T citotóxicas, neutrófilos, monócitos de células supressoras derivadas de mieloides (MDSC), células T reguladoras FoxP3, e macrófagos foram avaliadas (Arquivo Adicional 1: Figura S3). Análise destas populações revelou diferenças significativas entre populações de tratamento e controles apenas em camundongos que receberam a combinação de ambas terapia fototérmica e inibição de checkpoint anti-CTLA-4 juntas. Naqueles animais que receberam esta combinação, observamos um aumento nos números relativos de células T auxiliares (CD4⁺) e células T citotóxicas (CD8⁺), (Fig. 2c, d). Aumentos nas contagens de células CD4⁺ e CD8⁺ correlacionaram-se com aumentos grosseiros nos tamanhos de baço observados após necropsia.

Além da análise citométrica de células efetoras esplênicas, a concentração sérica de citocinas foi determinada 7 dias após PTT para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade antitumoral. Os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IFN-γ, e TNF-α são apresentados na Fig. 3. Nem tratamento SWCNT nem anti-CTLA-4 por si só aumentaram significativamente os níveis de citocinas comparados ao grupo controle não tratado. No entanto, tratamento PTT por si só foi capaz de aumentar TNF-α significativamente. A adição adicional de anti-CTLA-4 ao tratamento PTT aumentou significativamente os níveis de TNF-α, IL-6, e IFN-γ.

Concentração sérica de citocinas. Quantificação dos níveis de citocinas séricas em soro de camundongo 7 dias após PTT mostrou aumento significativo de níveis de IL-6, IFN-γ, e TNF-α em camundongos após PTT em conjunto com inibição de checkpoint (anti-CTLA-4). Os resultados são mostrados para controle não tratado, tratamento apenas SWCNT, tratamento apenas anti-CTLA-4, tratamento PTT, e tratamento PTT + anti-CTLA-4. Dados apresentados como média ± EP (n = 4–5). Significância estatística analisada para grupos tratados comparados ao grupo controle não tratado por ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett. Significância estatística indicada por * (p < 0,05) e **** (p < 0,0001)

Biodistribuição e Toxicidade de SWCNT-ANXA5

A biodistribuição de SWCNT-ANXA5 após administração para aprimoramento de terapia fototérmica em vários órgãos foi monitorada com quantificação fluorescente de SWCNT em lisados de tecido ex situ comparados a padrões (Arquivo Adicional 1: Figura S4). Biodistribuição em órgãos alvo foi seguida por um período de 4 meses após injeção i.v. de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 em camundongos saudáveis (Fig. 4a, b). Em contraste, a acumulação de SWCNT-ANXA5 em camundongos portadores de tumores EMT6 após administração, conforme o protocolo de injeção previamente descrito, foi determinada a 3 h após administração. (O momento em que a terapia fototérmica foi realizada no estudo de tratamento.) Durante o período de 4 meses precedendo a colheita de órgãos, camundongos foram monitorados para efeitos colaterais físicos e comportamento anormal. Nenhum efeito colateral foi observado em quaisquer camundongos injetados com SWCNT-ANXA5 durante este período. Nenhuma toxicidade histopatológica foi observada durante exame de seções FFPE coradas com hematoxilina e eosina de órgãos alvo na conclusão do estudo (Arquivo Adicional 1: Figura S5).

Biodistribuição de SWCNT-ANXA5 medida como % da dose injetada (a) e concentração tecidual em g/L (b). O conjugado SWCNT-ANXA5 foi injetado i.v. em camundongos Balb/cJ a dose de 1,2 mg/kg. A concentração de SWCNT foi medida em vários órgãos de camundongos sem tumores após 1, 2, 3, e 4 meses (da esquerda para direita). Para camundongos com tumores, a concentração de SWCNTs foi medida no momento como seria imediatamente antes do tratamento de terapia fototérmica. Dados mostrados como média ± EP (n = 3)

Discussão

Os dados apresentados aqui fornecem suporte para a eficácia da combinação de terapia fototérmica direcionada e inibição de checkpoint imune para tratamento de câncer de mama metastático. Este fenômeno é conhecido como "efeito abscopal", que descreve a capacidade de radiação localizada de iniciar uma resposta antitumoral que suprime crescimento de tumores distantes ao alvo primário. Já nos anos 1950, pesquisadores observaram que irradiação localizada de tumor teve efeito significativo em tumores distantes. Estudos estabeleceram que a natureza sistêmica do efeito abscopal é devida à resposta imune do hospedeiro. Enquanto γ-irradiação tem sido o foco principal da maioria das pesquisas abscopais, um corpo crescente de trabalho demonstra que terapia fototérmica pode induzir um efeito abscopal também. Numerosos estudos demonstraram que ablação térmica em combinação com inibidor de checkpoint anti-CTLA-4 produz uma resposta imune aumentada. Observamos uma resposta abscopal similar após ablação fototérmica direcionada e bloqueio anti-CTLA-4 no modelo EMT6 de câncer de mama.

O efeito abscopal é ilustrado pelos dados na Fig. 2a, b. Tumores ortotópicos EMT6 crescem rapidamente e metastatizaram no momento em que são tratados por terapia fototérmica. Esta é a razão pela qual camundongos com tumores tratados apenas com terapia fototérmica tiveram apenas um ligeiro aumento na sobrevivência comparados aos camundongos controle não tratados, mesmo que o tumor primário tenha sido completamente abladado. A administração de anti-CTLA-4 por si só atrasou o crescimento do tumor comparado ao controle e aumentou o tempo de sobrevivência para 68 dias mas não levou à cura. Um resultado similar de crescimento atrasado de tumor EMT6 foi observado por Jure-Kunkel et al. quando anti-CTLA-4 foi administrado. Para a combinação de terapia fototérmica e anti-CTLA-4, 55% dos camundongos tratados sobreviveram aos 100 dias após inoculação do tumor e são provavelmente curados.

Insight no mecanismo de imunidade antitumoral foi avaliado usando citometria de fluxo para quantificar as populações de células efetoras imunes no baço. Comparado a qualquer terapia fototérmica ou anti-CTLA-4 por si só, a terapia combinatória resultou em aumento de sete vezes nas células T auxiliares CD4⁺ e aumento de três vezes nas células T citolíticas CD8⁺, ambos estes resultados sendo altamente estatisticamente significativos (p < 0,005). Estes resultados fornecem mais evidência de uma potencial resposta abscopal pela combinação de fototerapia e terapia de co-estimulação de células T com inibição de checkpoint imune.

Aumentos nas contagens de células CD4⁺ e CD8⁺ correlacionaram-se com aumentos nos tamanhos de baço observados durante necropsia. Aumento do tamanho do baço indica resposta imune aumentada. O baço é composto de múltiplos tipos de células, os mais comuns dos quais são das linhagens CD4⁺, CD8⁺, e células B. Embora não explorado neste corpo de trabalho, esperaríamos que contagens de células B aumentassem junto com contagens de células T CD4⁺ e CD8⁺. Células T auxiliares CD4⁺ auxiliam na imunidade humoral facilitando outras células imunes por estimulação de citocinas e interações diretas célula-célula. Células T citolíticas CD8⁺ matam diretamente células tumorais. Aumentos nas contagens de células CD4⁺ e CD8⁺ são indicativos de uma resposta imune abscopal sistêmica.

A presença de uma resposta imune abscopal sistêmica após o tratamento combinatório é ainda apoiada por aumentos nos níveis de citocinas pró-inflamatórias séricas de camundongo (Fig. 3). TNF-α ativa macrófagos associados a tumor para apresentar efeitos antitumorais. IFN-γ desempenha papel importante na vigilância tumoral. IL-6 promove proliferação de macrófagos e linfócitos. O aumento significativo nestas moléculas efetoras no soro de camundongo 7 dias após tratamento PTT combinado com anti-CTLA-4 apoia ainda a existência de uma resposta imune antitumoral.

Na conclusão da irradiação de camundongos que receberam SWCNT, a temperatura máxima média do tumor foi 54 °C; esta temperatura foi suficiente para ablar completamente o tumor (Fig. 1). Isso está dentro da faixa de 45–60 °C na qual inativação enzimática e lesão mitocondrial ocorre. A temperatura dos tumores no grupo controle salino permaneceu abaixo de 40 °C, uma temperatura que fornece benefício terapêutico mínimo.

Observamos a maioria da acumulação de SWCNT-ANXA5 baseada na concentração foi primariamente no fígado, coração, baço, rins, pulmões, e tumor (Fig. 4a). Em camundongos com tumores EMT6, observamos que a concentração de SWCNT-ANXA5 foi similar àquela no fígado e rins (Fig. 4a, b). Quantidades traço de SWCNT-ANXA5 foram detectadas no cérebro, intestinos grosso e delgado. É importante notar que a biodistribuição de SWCNT com base em % de dose injetada (ID) não correlaciona bem com a concentração absoluta de SWCNT dentro de um tecido alvo. Isso é primariamente devido às diferenças entre pesos de órgãos. Por exemplo, um dado % ID dentro de um órgão corresponderá a uma concentração maior dentro de órgãos menores, e concentrações menores dentro de órgãos maiores. Comparando amostras com base na concentração de SWCNT revela que a maior concentração está dentro do rim, seguida de perto pelo fígado e baço (Fig. 4a).

Há alguma evidência de degradação de SWCNTs nos vários órgãos ao longo do período do estudo de biodistribuição (Fig. 4a, b). Degradação de SWCNTs em órgãos é esperada baseada em achado anterior que nanotubos de carbono de parede múltipla são degradados em macrófagos. Os SWCNTs usados em nosso estudo têm diâmetro médio de 0,8 nm e comprimento médio de 1500 µm. Este tamanho não é predito para ser citotóxico baseado em estudo de Zhu et al., que classificou o potencial para dano de bicamada lipídica por toxicidade de nanotubos de carbono baseado em comprimento e diâmetro. De acordo com esta classificação, os SWCNTs que usamos estão na categoria "biologicamente macia", minimizando citotoxicidade, o que é consistente com nossas observações nos estudos em camundongos onde não observamos quaisquer efeitos colaterais ou toxicidade histopatológica como resultado da administração do conjugado SWCNT-ANXA5.

Conclusões

Aqui, demonstramos uma nova modalidade de tratamento combinatório onde obtemos uma taxa de sobrevivência relativamente alta em camundongos com câncer de mama metastático agressivo usando terapia fototérmica com bioconjugado SWCNT-ANXA5 combinada com inibição de checkpoint baseada em anti-CTLA-4. O uso da proteína de direcionamento vascular tumoral ANXA5 minimizou a quantidade de SWCNT entregue sistematicamente necessária para erradicar tumores primários em uma dose baixa única. Curiosamente, notamos um aumento na sobrevivência de camundongos com câncer metastático tratados com terapia combinatória, mesmo que apenas o tumor primário foi irradiado. Um estudo mecanístico quantificando os números de importantes células efetoras antitumoriais esplênicas revelou que apenas a combinação de ambas modalidades de tratamento aumentou o número de células T auxiliares CD4⁺ e citotóxicas CD8⁺. Hipotetizamos que este aumento em células T reflete uma resposta abscopal, onde células efetoras antitumorais suprimiram metástase tumoral. Embora SWCNTs ainda fossem encontrados presentes em órgãos 4 meses após administração, nenhum efeito colateral ou toxicidade tecidual aparente foi observado durante o curso dos experimentos.