Nanopartículas compostas à base de polidopamina com cascas de polímero redox-lábil para liberação controlada de drogas e terapia quimio-fototérmica aprimorada

Resumo

A terapia fototérmica (PTT) que utiliza phSUPPototérmico agentes de conversão (PTC) para remover tumor sob irradiação de luz NIR tem atraído cada vez mais atenção devido à sua excelente eficácia terapêutica e melhor seletividade ao alvo. Aqui, uma nova nanopartícula de núcleo-casca baseada em polidopamina revestida por camada de poli (ácido metacrílico) (PMAA) reticulada por dissulfeto reticulado (PMAA) foi sintetizada com sucesso por polimerização por precipitação. Para essas nanopartículas de compósito PDA @ PMAA, o núcleo de PDA exibe alta eficácia fototérmica, enquanto isso, a casca de PMAA redox-lábil serve como transportadores para encapsular drogas anticâncer e liberá-las seletivamente. Devido à característica da ligação dissulfeto, a camada de PMAA ocorre na degradação seletiva, bem como na liberação controlada da droga ao entrar nas células cancerosas. Além disso, as nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX demonstraram um efeito sinérgico, que mostra um efeito de inibição significativamente melhorado contra células cancerosas pela combinação de terapia fototérmica e quimioterapia tradicional com baixa dosagem de droga e irradiação de laser curta em um in vitro estudar.

Introdução

A terapia fototérmica (PTT), um tratamento local não invasivo do câncer, tem chamado grande atenção na terapia do câncer por sua alta seletividade e efeitos adversos mínimos [1]. No PTT, a exposição ao laser infravermelho próximo (NIR) administrado é absorvida pelos agentes de conversão fototérmica (PTC) e convertida em hipertermia local levando à ablação do tumor [2,3,4]. Uma variedade de nanomateriais revelou o efeito PTC, como nanoestruturas de ouro [5,6,7], nanomateriais à base de carbono [8,9,10,11,12], Fe ₃ O ₄ nanoclusters [13,14,15], nanocristais de CuS [16] e melanina natural [17], todos os quais exibem forte absorvância óptica na janela óptica do tecido NIR. Entre esses agentes de PTC, a polidopamina (PDA), um mimetizador das proteínas adesivas encontradas em mexilhões, apresenta forte absorção de NIR, alta eficiência de PTC (40%), excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade, que têm sido amplamente exploradas na aplicação de PTT [ 18, 19]. No entanto, o uso único de PTT mostra eficácia clínica limitada devido ao fornecimento insuficiente de calor na região-alvo sem danificar os tecidos normais circundantes [20]. Para resolver este problema, a terapia quimio-fototérmica com a combinação de hipertermia e agentes quimioterápicos tem sido explorada por muitos pesquisadores por seu efeito sinérgico resultante da promoção da entrega de drogas em tumores e aumento da toxicidade da droga por hipertermia [21, 22].

Para alcançar o efeito de tratamento otimizado, o trabalho atual é dedicado ao desenvolvimento de uma nova nanopartícula terapêutica com conversão fototérmica de alto desempenho, excelente capacidade de carga de droga e comportamento de liberação controlada de droga. Uma camada de polímero "inteligente" foi introduzida em nosso sistema, que reticulada por um ligante clivável, para permitir a degradabilidade e a liberação controlada de drogas de transportadores de uma forma acionada. A ligação dissulfeto, que pode ser clivada por tióis livres, é um candidato promissor como ligante clivável devido à sua resposta sensível ao estado redox, alta estabilidade na circulação sanguínea e boa biocompatibilidade [23]. Os portadores de drogas que incorporam ligações dissulfeto podem sofrer degradação seletiva ao entrar nas células tumorais, nas quais a concentração de glutationa redutora (GSH) (ca. 2-10 mM) é muito maior do que nos fluidos extracelulares [24,25,26]. Aqui, um novo tipo de nanopartículas compostas por esferas de PDA como o núcleo e poli (ácido metacrílico) reticulado por ligação dissulfeto (PMAA) conforme o invólucro foi preparado, denominado PDA @ PMAA, que mantém a eficácia PTC do núcleo de PDA e do propriedade redox-lábil da casca do polímero. A estrutura, propriedades e comportamentos de liberação de drogas de nanopartículas de compósito PDA @ PMAA foram estudados, e o efeito terapêutico quimiofototérmico foi posteriormente demonstrado através do ensaio de MTT.

Métodos / Experimental

Materiais

O cloridrato de dopamina (DA-HCl) e o cloreto de metacriloílo e a glutationa (GSH) foram obtidos na Aladdin Reagent Corporation, Shanghai, P.R. China. Ácido metacrílico (MAA) e N, N ’ -bis (acriloil) cistamina (BAC) foi adquirido a Sigma-Aldrich. 2,2-azobisisobutironitrila (AIBN) foi obtido de Sinopharm Chemical Reagent Company e recristalizado de etanol. Solução aquosa de amônia (NH ₃ • H ₂ O, 30%), acetonitrila e etanol anidro foram adquiridos de Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Company. A doxorrubicina (DOX) na forma de sal cloridrato foi obtida de Beijing Huafeng United Technology Company. Ensaio de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) e outros reagentes biológicos foram adquiridos da Invitrogen Corp. Calcein-AM foi adquirido da Bojin Biotech, Inc. (Xi'an) . Todos os reagentes químicos eram de grau analítico ou superior e usados sem purificação adicional, exceto como mencionado acima.

Caracterização

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram observadas em um microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2 20 TWIN (FEI, EUA). Os diâmetros hidrodinâmicos e potenciais zeta das partículas foram conduzidos por um analisador de tamanho de partícula de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Malvern Nano-ZS90) em um ângulo de espalhamento de 90 °. Os espectros de UV-vis foram realizados por um espectrofotômetro Perkin-Elmer Lambda 750 à temperatura ambiente. Os espectros de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) foram registrados usando placas pressionadas com KBr em uma espectroscopia Nicolet 6700 FTIR. Os efeitos de aquecimento NIR de nanopartículas de PDA e PDA @ PMAA foram caracterizados usando um laser NIR de onda contínua de 808 nm (Changchun New Industries Optoelectronics Technology, Changchun, China; tamanho do ponto:6 mm × 7 mm) com irradiação de laser em uma potência densidade de 5 W cm ⁻² por 300 s. As temperaturas de pré e pós-iluminação foram medidas por um termopar com uma precisão de 0,1 ^° C. As imagens celulares foram adquiridas com um microscópio de varredura a laser confocal (CLSM, Leica TCS SP8 STED 3X).

Nanopartículas compostas de PDA @ PMAA

A síntese das esferas de PDA foi realizada em uma solução mista de água desionizada (90 mL), etanol (40 mL) e NH ₃ • H ₂ O (3 mL), adicionando 0,5 g de cloridrato de dopamina. A solução foi agitada a 30 ^° C por 24 h, e o produto foi centrifugado e lavado. A concha de PMAA foi sintetizada por polimerização por destilação-precipitação, conforme nosso trabalho anterior. MAA (100 mg), BAC (10 mg) e AIBN (3 mg) foram dissolvidos em 25 mL de acetonitrila, seguido pela adição de 50 mg de esfera de PDA preparada. Em seguida, a mistura foi aquecida a 100 ^° C agitado durante 2 h, e o produto foi centrifugado e lavado. A razão de massa de PDA e MAA foi variada de 0,5 a 6 para ajustar a espessura da casca de PMAA, e os detalhes da receita foram listados na Tabela 1.

Efeitos fototérmicos de PDA @ PMAA

A dispersão aquosa de PDA @ PMAA (50 μg mL ⁻¹ ) colocado em placa de célula de 96 poços (100 μL por poço) foi iluminado por um laser NIR de 808 nm (5 W cm ⁻² ), e as temperaturas pré e pós-iluminação foram medidas.

Carregamento e liberação de drogas

O DOX foi escolhido como um fármaco modelo para investigar a carga de fármaco e o desempenho de liberação controlada de nanopartículas de PDA ou PDA @ PMAA. Etapas específicas referentes ao nosso trabalho anterior [27, 28]. Resumidamente, 10 mg de PDA ou PDA @ PMAA-1 nanopartículas foram dispersas em 1 mL de solução aquosa de DOX (1 mg mL ⁻¹ ), que foi previamente ajustado para pH 8,0. Após agitação suave durante 24 h à temperatura ambiente, a dispersão foi centrifugada para coletar as nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX (12.000 rpm, 10 min) e depois lavadas com água desionizada duas vezes para remover DOX descarregado. Os espectros de absorbância de UV do sobrenadante foram medidos e a intensidade a 480 nm foi usada para analisar o carregamento e a liberação de DOX. O conteúdo da carga do fármaco (LC) e a eficiência de encapsulação (EE) foram expressos de acordo com as seguintes fórmulas:LC (%) =(peso do fármaco carregado) / (peso total das nanopartículas); EE (%) =(peso do fármaco carregado) / (peso do fármaco inicialmente adicionado).

O estudo de liberação in vitro foi realizado a 37 ° C em tampão fosfato (pH 7,4 e 5,5) com ou sem GSH. Normalmente, nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX dispersas no tampão correspondente foram colocadas em um saco de diálise (peso molecular cut-off 14.000 Da) e, em seguida, imersas em 100 mL do meio de liberação. As amostras foram mantidas a 37 ^° C sob agitação contínua. Em pontos de tempo diferentes, 2 mL de tampão externo foram retirados para análise de espectros de UV-vis e reabastecidos com um volume igual de meio fresco. Todos os dados de liberação de DOX foram calculados em média em três medições, e o conteúdo de liberação foi calculado pela fórmula:Conteúdo de liberação (%) =(quantidade de droga no meio de liberação) / (quantidade de droga carregada em nanopartículas) × 100. A liberação de droga o comportamento de nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX com irradiação a laser em tampão de fosfato de pH 7,4 foi realizado seguindo um procedimento semelhante. A luz NIR foi aplicada por 5 min por hora.

Ensaio de células in vitro

Células HEK-293T (células renais embrionárias humanas, células normais) e células A549 (células epiteliais de adenocarcinoma pulmonar humano, células cancerosas) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino), penicilina (100 U mL ⁻¹ ) e estreptomicina (100 mg mL ⁻¹ ) em uma atmosfera umidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C.

Para observar a captação celular, células A549 (1 × 10 ⁴ células por poço) foram semeadas em placas de 6 poços em 1,5 mL de meio. O meio foi substituído pelo meio contendo nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX após 24 h. Após 1 h ou 4 h, DMEM e PBS frescos foram adicionados para lavar as nanopartículas livres não internalizadas pelas células antes da observação de fluorescência. A distribuição intracelular das nanopartículas foi observada por CLSM. A fluorescência foi fotografada em λ _EX (488 nm) para DOX, e a cor falsa foi definida artificialmente como vermelha.

A citotoxicidade de nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX e em branco contra células A549 foi avaliada pelo ensaio MTT padrão. As células (com densidade de 10 ⁴ células por poço) foram incubadas em placas de 96 poços durante 24 h para permitir a fixação das células. Em seguida, nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX e em branco e DOX livre em várias concentrações foram adicionadas às células, respectivamente. Para os grupos de laser NIR, o laser ( λ =808 nm) foi aplicado para irradiar as células a uma densidade de potência de 5 W cm ⁻² por 300 s após 1 h de incubação. Então, após um tempo de incubação de 24 h a 37 ^° C, 20 μL de solução de MTT (5 mg mL ⁻¹ em tampão de fosfato) foi substituído por DMEM fresco contendo MTT (5 mg mL ⁻¹ ), e as células foram incubadas por mais 4 h. Em seguida, o sobrenadante foi removido e 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados a cada poço para dissolver o formazan. A absorbância foi monitorada a 570 nm usando um espectrofotômetro após 10 min de incubação. Cada ponto de dados foi coletado pela média de cinco poços, e as células não tratadas foram usadas como controles. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada comparando a absorbância das células de controle com a das células tratadas. O mesmo processo de citotoxicidade de nanopartículas de compósito em branco contra células HEK-293T foi realizado conforme mencionado acima.

Para visualizar os efeitos antitumorais das nanopartículas de PDA @ PMAA e nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX com ou sem irradiação de laser NIR, as células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3 × 10 ⁴ células por poço. As células foram expostas às nanopartículas de PDA @ PMAA-1, nanopartículas de PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX ou DOX livre por 24 h a uma concentração de nanopartículas de 100 μg mL ⁻¹ ou concentração de DOX equivalente de 5 μg mL ⁻¹ . Para os grupos de laser NIR, o laser ( λ =808 nm) foi aplicado para irradiar as células a uma densidade de potência de 5 W cm ⁻² por 300 s após 1 h de incubação. Posteriormente, as células foram incubadas com Calceína-AM por 30 min, lavadas três vezes usando PBS e observadas usando CLSM em λ _EX (490 nm).

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de nanopartículas de PDA @ PMAA

A esfera PDA é preparada em condições básicas via método de oxidação em solução. O revestimento químico da esfera de PDA com uma camada de polímero reticulado por dissulfeto foi obtido através do método de polimerização por destilação-precipitação que usa MAA e BAC como monômero e reticulador, respectivamente (Fig. 1). Esta nanopartícula composta multifuncional oferece muitas vantagens sobre outras nanopartículas terapêuticas em três aspectos. Primeiro, o núcleo do PDA exibe excelente desempenho fototérmico sob irradiação NIR. Em segundo lugar, a incorporação da ligação dissulfeto oferece degradação seletiva das camadas do polímero, bem como liberação controlada do medicamento ao entrar nas células cancerosas. Terceiro, o invólucro PMAA fornece às nanopartículas uma excelente estabilidade coloidal. A espessura da camada de PMAA pode ser controlada ajustando a proporção de massa das esferas MAA e PDA. A Figura 2 mostra as imagens TEM das esferas de PDA obtidas e nanopartículas de PDA @ PMAA. É claro que as nanopartículas de PDA e PDA @ PMAA são monodispersas e de formato esférico. As esferas de PDA tinham um diâmetro médio de ~ 100 nm, e o tamanho das nanopartículas híbridas de PDA @ PMAA variou de 120 ± 5 a 200 ± 10 nm com a razão de massa de PDA para MAA variando de 0,5 a 6. O tamanho hidrodinâmico (D _h ) e a distribuição de tamanho das nanopartículas de PDA e PDA @ PMAA também foram caracterizadas por dispersão de luz dinâmica (DLS), como mostrado na Tabela 2. As nanopartículas de PDA @ PMAA tinham uma distribuição de tamanho estreita, normalmente com um valor de PI de 0,09-0,14. O D _h da série de nanopartículas de PDA @ PMAA variaram de 176 a 349 nm, variando a razão de massa de PDA para MAA, que estava de acordo com a tendência de crescimento de tamanho da observação de TEM. Notavelmente, o D _h de nanopartículas compostas eram maiores do que o tamanho determinado por TEM, sugerindo que as nanopartículas compostas são altamente inchadas em meio aquoso [29]. O potencial ζ das nanopartículas de PDA era - 26,8 mV por causa dos grupos catecol na superfície do PDA. O potencial ζ das nanopartículas de PDA @ PMAA mudou de -30,2 para 33,2, indicando que a existência de grupos carboxila vem do invólucro PMAA.

Ilustração esquemática da síntese, efeito fototérmico, carga de droga e liberação de droga responsiva a estímulos de nanopartículas de PDA @ PMAA

Imagens TEM de nanopartículas de PDA @ PMAA (barra de escala, 200 nm). a PDA. b [email protected]. c PDA @ PMAA-1. d PDA @ PMAA-2. e PDA @ PMAA-4. f PDA @ PMAA-6

Uma vez que o MAA é responsivo ao pH, pode-se inferir que as nanoesferas PDA @ PMAA também apresentam sensibilidade ao pH. Como mostrado na Fig. 3, as nanopartículas PDA @ PMAA-1 foram tomadas como um exemplo para investigar a dependência do pH do tamanho hidrodinâmico das nanopartículas revestidas com PMAA. Pode ser visto que em tampão de fosfato de pH 8,5, as nanopartículas de PDA @ PMAA-1 têm um diâmetro hidrodinâmico de cerca de 240 nm; enquanto em um ambiente ácido de pH 3,0, seu tamanho hidrodinâmico diminuiu bastante para ca. 150 nm. Como as cadeias de polímero de PMAA são altamente ionizadas em pH alto, e a forte repulsão eletrostática entre as cadeias de polímero resultou em um aumento do tamanho hidrodinâmico, enquanto em pH baixo, o baixo grau de ionização das cadeias de PMAA leva a um encolhimento de tamanho [30]. As nanopartículas de PDA @ PMAA responsivas ao pH exibem grande potencial na liberação controlada do fármaco em células tumorais (pH inferior a 6,5), uma vez que o colapso da camada de polímero esponjoso pode facilitar a liberação do fármaco. As estruturas químicas das nanopartículas de PDA @ PMAA foram caracterizadas por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Fig. 4). No espectro de nanopartículas de BAC e PDA @ PMAA, as bandas que aparecem em 1650 e 1550 cm ⁻¹ , que são atribuídos às bandas amidas I e II típicas do BAC, demonstraram que o reticulador BAC foi introduzido com sucesso na nanopartícula composta [25]. O pico em 1706 cm ⁻¹ , que pertence à vibração de alongamento dos grupos C =O em PMAA, pode ser claramente vista na nanopartícula de PDA @ PMAA diferente da nanopartícula de PDA, sugerindo o revestimento bem-sucedido da camada de PMAA.

Diâmetro hidrodinâmico de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 em tampão de fosfato em vários pH

Espectros de FTIR de reticuladores BAC, nanopartículas de PDA e nanopartículas de PDA @ PMAA (de cima para baixo)

Efeito fototérmico de nanopartículas de PDA @ PMAA

A intensidade de absorbância na região NIR é o principal fator que determina a capacidade PTC de um agente PTC. Para explorar a capacidade de absorção de luz das nanopartículas de PDA @ PMAA, seus espectros de UV-vis estão resumidos na Fig. 5a. Pode-se observar que cada amostra possui uma absorção óbvia na região NIR de 600 a 1000 nm. Comparado com o PDA @ PMAA, o PDA apresenta a maior absorção a 808 nm em uma concentração de massa equivalente. A absorbância das nanopartículas de PDA @ PMAA aumentou com a diminuição da espessura da casca do PMAA (de PDA @ PMAA-6 para [email protected]). A forte absorção óptica na região NIR nos encorajou a investigar mais a fundo o efeito fototérmico do PDA @ PMAA. Conforme mostrado na Fig. 5b, o efeito fototérmico da dispersão aquosa de PDA e PDA @ PMAA foi medido na concentração de 100 μg mL ⁻¹ irradiado com um laser de 808 nm a 5 W cm ⁻² por 300 s. Água pura foi usada como controle negativo. A temperatura da dispersão do PDA foi aumentada em 41 ^° C e superior a todas as amostras PDA @ PMAA, o que foi consistente com sua absorção máxima em 808 nm. O aumento da temperatura pelas dispersões PDA @ PMAA pode atingir de 17 a 33 ^° C com a diminuição da espessura da casca do PMAA (de PDA @ PMAA-6 para [email protected]), muito maior do que o causado pelo controle de água pura (alcance apenas 3,5 ^° C). Estudos anteriores sugeriram que a terapia térmica com uma temperatura acima de 55 ^° C apresentou grandes vantagens na termoablação de tumor sólido [31]. Comparando o aumento máximo de temperatura de uma série de nanopartículas de PDA @ PMAA, apenas [email protected] (58 ^° C) e PDA @ PMAA-1 (56 ^° C) pode atingir até 55 ^° C. Considerando que o invólucro PMAA deve ter uma certa espessura para garantir sua capacidade de carga de droga, PDA @ PMAA-1 foi escolhido como representativo nos seguintes experimentos.

a Espectros de UV-vis de dispersão aquosa de PDA e PDA @ PMAA a uma concentração de 100 μg mL ^-1 . b Efeito fototérmico da dispersão aquosa de PDA e PDA @ PMAA a uma concentração de 100 μg mL ⁻¹ foram medidos por irradiação de laser ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² )

Liberação de droga in vitro

A doxorrubicina (DOX) foi escolhida como um fármaco modelo para confirmar a capacidade potencial das nanopartículas de compósito PDA @ PMAA-1 de liberar o fármaco encapsulado sob condição redutiva. O carregamento de DOX em nanopartículas compostas foi realizado em um teor teórico de carregamento de droga de 9,1% em peso e uma concentração de polímero de 10 mg mL ⁻¹ , e o conteúdo final de carregamento de droga e eficiência de encapsulação foi de 5,1% e 53,7%, respectivamente. Isso indicou que o DOX pode ser carregado com eficiência na rede de polímero. Nanopartículas de PDA carregadas com DOX também foram preparadas para comparação, o conteúdo da carga DOX foi de 3,7%. A maior capacidade de carga de drogas das nanopartículas de PDA @ PMAA-1 pode ser atribuída à forte interação eletrostática entre o grupo amino das moléculas DOX e os grupos carboxila das cadeias de PMAA [25]. Em vista disso, a concha de PMAA carrega ligações dissulfeto cliváveis por redox, os medicamentos pré-carregados serão acionados para liberar medicamentos pré-carregados de forma eficiente em condições redutoras. Levando em consideração o microambiente tumoral levemente ácido e a enorme diferença na concentração de GSH entre o intracelular (1–10 mM) e o plasma (20–40 μM), os experimentos de liberação de drogas in vitro foram projetados e conduzidos usando tampões de fosfato de pH 7,4 e 5,5 com ou sem GSH 10 mM para imitar a célula tumoral e o ambiente da corrente sanguínea [23, 32, 33]. Conforme mostrado na Fig. 6, a quantidade de droga liberada é de apenas 10,8% ao longo de um período de 24 h, sugerindo que DOX foi mantida de forma estável nas nanopartículas de PDA @ PMAA-1 quando elas foram dispersas em condições fisiológicas. Na presença de GSH 10 mM, uma liberação notavelmente rápida de droga foi detectada, onde a liberação cumulativa de DOX foi de aproximadamente 72,8% em 24 h, devido à degradação de conchas de PMAA ligadas por dissulfeto em ambiente redutor. Ainda assim, a estrutura do núcleo do PDA mantém a integridade após a degradação responsiva a redox (Arquivo adicional 1:Figura S2). Além disso, uma liberação rápida (ca. 87% em 24 h) de DOX foi observada em tampões de fosfato de pH 5,5 com GSH 10 mM, devido aos grupos carboxila em PMAA serem protonados sob condições ácidas, o que causou ainda mais colapso do polímero redes. Esses perfis de liberação implicam no aspecto promissor das nanopartículas de PDA @ PMAA para liberação controlada de fármacos, visto que as nanopartículas exibem baixo vazamento de fármacos no plasma, porém, liberando fármacos rapidamente ao entrar nas células tumorais. Além disso, foi detectada uma liberação lenta da droga (ca. 13% em 24 h) para nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX com irradiação NIR em tampões de fosfato de pH 7,4, indicando que as nanopartículas de PDA @ PMAA mantêm a integridade estrutural após a irradiação. O comportamento de liberação de nanopartículas de PDA na presença de GSH 10 mM mostrou uma notável baixa liberação de drogas (ca. 30% em 24 h) em comparação com nanopartículas de PDA @ PMAA-1 (Arquivo adicional 1:Figura S1). A enorme diferença nos comportamentos de liberação de nanopartículas de PDA e PDA @ PMAA sugeriu que a introdução de uma concha de polímero degradável reticulada por ligação dissulfeto deu origem à liberação efetiva de drogas desencadeada por Redox.

Perfis de liberação DOX de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 a 37 ^° C em tampão fosfato 7,4 (○), em tampão fosfato 7,4 com irradiação a laser NIR (□, em tampão fosfato 7,4 com GSH 10 mM (círculo vermelho), ou em tampão fosfato 5,5 com GSH 10 mM (círculo verde)

Ensaios de células

A investigação da absorção celular e liberação de droga intracelular de nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX foi conduzida contra a linha de células A549. Como mostrado na Fig. 7, fluorescência vermelha para DOX pode ser observada no citoplasma da célula após 1 h de incubação, indicando uma rápida internalização de nanopartículas contra células tumorais. Após 4 h de incubação, forte fluorescência vermelha foi observada em todo o citoplasma e núcleo da célula. Ele sugeriu que mais nanopartículas foram endocitadas pelas células e liberaram DOX de forma eficiente por meio da degradação de cascas de polímero no ambiente redutor de células tumorais.

Imagens CLSM de células A549 cultivadas com nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX para ( a ) 1 he ( b ) 4 h. Em cada linha, imagens de microscopia de contraste de interferência diferencial, imagens de fluorescência e imagens de sobreposição foram mostradas da esquerda para a direita, respectivamente. (barra de escala, 50 μm)

Para avaliar a biocompatibilidade de PDA @ PMAA, uma célula normal típica (células HEK-293T) foi escolhida para o teste de viabilidade celular pelo ensaio MTT. Conforme mostrado na Fig. 8, nenhuma citotoxicidade óbvia de nanopartículas de PDA @ PMAA-1 em branco foi detectada em uma ampla faixa de concentração de 0,1–100 μg mL ⁻¹ , indicando a boa biocompatibilidade das nanopartículas de PDA @ PMAA-1 o que garante sua aplicação na área biomédica. Em seguida, a viabilidade celular contra células A549 (células tumorais) em função da concentração de incubação do branco ou nanopartículas PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX foi medida, e cada grupo foi subdividido em grupos com ou sem exposição a laser NIR (Fig. 9 ) Quase nenhum efeito sobre a viabilidade celular foi observado para o grupo PDA @ PMAA-1 em branco sem laser, indicando que as nanopartículas de compósito em branco não têm citotoxicidade. Após 5 W cm ⁻² Irradiação de laser NIR por 300 s, a viabilidade celular para o grupo PDA @ PMAA-1 em branco diminuiu obviamente, e ~ 54,3% das células foram mortas a uma concentração de 100 μg mL ⁻¹ . Os resultados implicaram que essas nanopartículas de PDA @ PMAA-1 foram citotóxicas contra células A549 por hipertermia induzida por irradiação NIR. Quanto aos grupos carregados com DOX, as nanopartículas de PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX mostram uma diminuição da viabilidade celular de uma maneira responsiva à dose, que tem eficácia semelhante ao DOX livre, indicando uma liberação completa de drogas de PMAA reticulado por ligação dissulfeto cartuchos. Para células tratadas por nanopartículas de PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX com exposição a laser NIR, a viabilidade celular mostra uma diminuição mais profunda em comparação com o grupo de não irradiação, especialmente em uma dose de droga elevada. Por exemplo, quando as células foram tratadas com 100 μg mL ⁻¹ PDA @ PMAA-1 carregado com DOX (contendo 5 μg mL ⁻¹ DOX), a viabilidade celular foi reduzida para cerca de 15,7%, o que era muito menor do que o tratamento fototérmico (~ 54,3%) ou quimioterapia (~ 38,1%) sozinho com a mesma dose de nanopartículas. Notavelmente, a inibição celular de 50% (IC ₅₀ ) o valor do PDA @ PMAA-1 carregado com DOX com uma exposição a laser NIR de curto prazo foi determinado para 2 μg mL ⁻¹ , que era muito menor do que o DOX livre (6,3 μg mL ⁻¹ ) Isso sugere que a terapia quimio-fototérmica de nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX demonstrou um efeito sinérgico, que pode ser atribuído à citotoxicidade aumentada de DOX em temperatura mais alta [34, 35]. Em contraste, o grupo DOX livre com laser NIR não mostra um efeito sinérgico semelhante, uma vez que não há hipertermia local causada pela irradiação do laser NIR. Imagens de fluorescência de células coradas com Calceína-AM (células verdes vivas) após o tratamento mostram que o número de células vivas tratadas por nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX após irradiação com laser NIR foi significativamente menor do que outros grupos, o que confirmou ainda mais o antitumor sinérgico efeito de nanopartículas de PDA @ PMAA carregadas com DOX com irradiação de luz NIR (Fig. 10). Beneficiando-se do efeito sinérgico positivo do tratamento quimiofototérmico combinado, permite uma dosagem mais baixa do fármaco citotóxico para atingir o mesmo efeito de eliminação do tumor, evitando assim os efeitos colaterais graves para os tecidos normais em altas dosagens do fármaco. Tomados em conjunto, os dados acima sugerem que essas nanopartículas de PDA @ PMAA podem liberar drogas com eficiência sob as condições de redução intracelular e exibir um efeito sinérgico de morte de células tumorais para terapia quimio-fototérmica combinada, o que demonstrou seu grande potencial para o tratamento do câncer.

Viabilidade celular de células HEK-293 expostas a nanopartículas de PDA @ PMAA-1 em branco por 24 h

Viabilidade celular de células A549 tratadas com DOX livre, nanopartículas de PDA @ PMAA-1 e nanopartículas de PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX em várias concentrações sem ou com irradiação de laser NIR ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) por 300 s

Imagens de fluorescência confocal de células A549 vivas tratadas com PBS, nanopartículas de PDA @ PMAA-1, nanopartículas de PDA @ PMAA-1 carregadas com DOX e DOX livre com ou sem irradiação de laser NIR ( λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) por 300 s. As células vivas foram coradas com Calcein-AM (verde). A barra de escala é 50 μm

Conclusão

As nanopartículas de compósito multifuncional core-shell PDA @ PMAA foram sintetizadas revestindo uma camada de PMAA reticulada por dissulfeto em nanopartículas de PDA por meio de polimerização por destilação-precipitação. As nanopartículas compostas exibiram um excelente efeito de conversão fototérmica e degradação redox-lábil da camada de PMAA. Para uma amostra típica de PDA @ PDA @ PMAA-1, a temperatura das dispersões de PDA @ PMAA foi aumentada em 31 ^° C na concentração de 100 μg mL ⁻¹ irradiado com um laser de 808 nm a 5 W cm ⁻² por 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

Disponibilidade de dados e materiais

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

Abreviações

AIBN:: 2,2-Azobisisobutyronitrile
BAC:: N,N' -bis(acryloyl)cystamine
DA-HCl:: Dopamine hydrochloride
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO:: Dimethyl sulfoxide
DOX:: Doxorrubicina
FBS:: Soro fetal bovino
FT-IR:: Transformada de Fourier Infra-vermelho
GSH:: Glutationa
MAA:: Methacrylic acid
NIR:: Próximo ao infravermelho
PDA:: Polydopamine
PMAA:: Poly(methacrylic acid)
PTC:: Photothermal conversion agents
PTT:: Terapia fototérmica
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão

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