Complementação de ELISA e uma superfície de eletrodo interdigitado na funcionalização de nanopartículas de ouro para detecção eficaz de defeitos de coagulação do sangue humano

Resumo

O desenvolvimento de um diagnóstico aprimorado usando biossensores é importante para o tratamento de pacientes antes que surjam complicações da doença. Melhorar os biossensores permitiria a detecção de vários biomarcadores de doenças de baixa abundância. A imobilização eficiente de sondas / receptores na superfície de detecção é uma das maneiras eficientes de aprimorar a detecção. Aqui, introduzimos a superfície de detecção pré-alcalina com funcionalização de amina para captura de nanopartículas de ouro (GNP) conjugada ao fator IX de coagulação do sangue humano (FIX) e demonstramos o excelente desempenho da estratégia. Escolhemos o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o eletrodo interdigitado (IDE), que são amplamente utilizados, para demonstrar nosso método. A quantidade ideal para silanização foi encontrada em 2,5%, e PNB de tamanho de 15 nm são ideais e caracterizados. O limite de detecção de FIX foi atingido com ELISA a 100 pM com os GNPs pré-misturados e FIX, que mostra melhora de 60 vezes na sensibilidade sem bioincrustação, em comparação com o ELISA convencional. Além disso, FIX foi detectado com maior especificidade em soro humano a uma diluição de 1:1280, que é equivalente a 120 pM de FIX. Estes resultados foram complementados pela análise em IDE, onde a detecção melhorada foi alcançada em 25 pM, e FIX foi detectado em soro humano na diluição de 1:640. Essas superfícies otimizadas são úteis para melhorar a detecção de diferentes doenças em várias superfícies de detecção.

Introdução

A melhoria de todos os aspectos da vanguarda da medicina é obrigatória para manter a vida humana saudável e estender a expectativa de vida. O diagnóstico de doenças é uma das principais áreas da área médica, que deve ser aprimorado ainda mais para facilitar a identificação de doenças e tratamentos. Por outro lado, doenças epidêmicas como gripe e dengue devem ser detectadas nos estágios iniciais para evitar a propagação [1,2,3]. Existem diferentes diagnósticos que demonstraram ser capazes de detecção genuína por meio de uma ampla gama de biomarcadores [4, 5]. Entre os sistemas de diagnóstico gerados anteriormente, o ensaio imunoenzimático (ELISA) é amplamente considerado como o “padrão ouro” para identificar as principais doenças virais e bacterianas e espécies moleculares [6, 7]. Diferentes estratégias foram desenvolvidas com ELISA com características atraentes, como facilidade de uso, precisão e limite de detecção inferior. Além disso, a detecção simultânea de várias doenças e o uso para triagem das principais doenças são comuns na prática [8,9,10]. ELISA é um imunoensaio usado para detectar o alvo de interesse usando o anticorpo apropriado em placas de 96 poços de poliestireno (PS). A sensibilidade e seletividade das moléculas alvo são altamente dependentes de vários fatores em ELISA, como a afinidade de ligação do alvo e do anticorpo, a interação de anticorpos primários e secundários e a imobilização de alvo eficiente na superfície de ELISA. Em particular, a imobilização do alvo na placa PS desempenha um papel crucial na limitação da detecção. O anticorpo ou a proteína podem adsorver fisicamente na superfície do PS pela interação de grupos hidrofóbicos com o anticorpo [11]. Existem algumas possibilidades, por exemplo, envolvendo uma ligação fraca do anticorpo (ou proteína) ou a instabilidade do anticorpo na placa de PS e a distribuição não uniforme do anticorpo (ou proteína) levando a defeitos na detecção. Foi comprovado que a orientação adequada do anticorpo na placa imobilizada melhora a detecção em mais de 64 vezes em comparação com as moléculas imobilizadas aleatoriamente [12, 13]. Encontrar o procedimento adequado para a imobilização eficiente de proteína ou anticorpo na placa de PS com uniformidade é, portanto, uma necessidade crucial. Diferentes pesquisadores estão utilizando a imobilização de proteínas em placas de PS ELISA por processos químicos ou físicos, como uma reação fotoquímica assistida por polivinilbenzil lactonolilamida e imobilização de proteínas na presença de detergente [14,15,16]. Dixit et al. [8] imobilizaram os anticorpos na placa de PS modificada com amina para melhorar o limite de detecção e demonstraram que a pré-mistura de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) e anticorpo antes da etapa de imobilização melhorou a sensibilidade em 54 vezes em comparação com o ELISA convencional e atingiu o limite de detecção de 10 pM [8, 17].

No presente trabalho, introduzimos um novo método de imobilização de proteínas em placas PS ELISA assistidas por nanopartículas de ouro (GNPs). GNPs são uma das ferramentas mais poderosas no campo de desenvolvimento de sensores. Eles oferecem propriedades positivas, como facilidade de dispersão em água, inércia biológica e boa compatibilidade com funcionalização de superfície, e podem ser ajustados para nanosizes uniformes [18,19,20,21,22,23]. Foi comprovado que os anticorpos conjugados com GNP melhoraram o limite de detecção com o vírus influenza e FIX no sensor do modo de guia de ondas [21,22,23]. GNPs são usados ​​em todos os tipos de sensores, incluindo sensor de modo de guia de onda, ressonância de plasmon de superfície e espectroscopia Raman para detecção de alto desempenho. Além disso, GNPs também têm sido usados ​​em ensaios colorimétricos, nos quais a conjugação de aptâmero ou anticorpo em superfícies de GNP foi seguida para detectar o analito a olho nu. Os pesquisadores também estão se concentrando no uso de GNPs em métodos ELISA para melhorar a detecção [24]. Anteriormente, o anti-IgG-HRP de camundongo conjugado com GNP melhorou a detecção de Pb (II) e atingiu o limite de detecção de 9 pg / mL [25]. Lakshmipriya et al. descobriram que a conjugação de anticorpos primários e secundários em GNPs melhorou a detecção da proteína ESAT-6, que está envolvida em causar tuberculose [9, 26]. Aqui, usamos GNPs para imobilizar a proteína na superfície PS ELISA com a modificação química assistida por APTES. Esta abordagem envolve duas etapas:funcionalização da superfície de PS com grupos amina usando APTES seguida pela imobilização da proteína conjugada com GNP na placa de PS modificada com amina. Os grupos amina do APTES podem ligar-se a grupos COOH na superfície PS ELISA. Por outro lado, proteínas conjugadas com GNP estabilizadas com íons cítricos aniônicos podem se ligar aos APTES catiônicos por interação eletrostática [11, 27, 28]. Os grupos amino-terminais nos APTES deslocam os grupos citrato nos GNPs e fixam-se quimicamente na placa PS [29]. Os grupos de amina carregados positivamente nos APTES também atraem os PNB carregados negativamente. Além disso, o tratamento com APTES muda o substrato de PS para torná-lo mais hidrofóbico [30].

Uma placa de ELISA quimicamente modificada e a conjugação de GNP foram usadas para detectar o fator IX (FIX) da cascata de coagulação do sangue humano. FIX é uma proteína importante no sistema de coagulação do sangue e concentrações mais baixas de FIX na corrente sanguínea levam à deficiência de coagulação. A imobilização aprimorada de FIX na placa de ELISA por meio de GNPs permite um caminho potencial para a detecção dos níveis mais baixos de FIX. A placa ELISA modificada com GNP mostrou uma melhora drástica na detecção de FIX. Além disso, também demonstramos a detecção de FIX em soro humano, e a estratégia atual pode ser usada com ELISA para detectar outros biomarcadores. Para complementar o estudo acima com o substrato ELISA, também aplicamos a estratégia acima em outra superfície de eletrodo interdigitado (IDE) amplamente usada em um sensor dielétrico eletroquímico para detectar FIX e FIX puros em uma amostra de soro diluído humano (Fig. 1a, b) .

a Representação esquemática do ELISA assistido por GNP. O GNP foi pré-misturado com proteína e imobilizado na superfície de ELISA modificada por APTES. Os anticorpos foram então adicionados. Finalmente, substrato para HRP foi usado para detectar o alvo. b Representação esquemática do IDE assistido pelo GNP

Materiais e métodos

Reagentes e biomoléculas

(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES) e soro humano foram adquiridos a Sigma-Aldrich (EUA). A proteína FIX e o anticorpo anti-FIX eram da Abcam (Malásia). A peroxidase de rábano conjugada com IgG anti-camundongo (imunoglobulina anti-camundongo HRP) foi adquirida na Thermo-Scientific (EUA). A placa ELISA foi adquirida a Becton Dickinson (França). O tampão de revestimento ELISA 5 × foi obtido da BioLegend (UK). A albumina sérica bovina (BSA) e o substrato HRP foram obtidos da Promega (EUA). Nanopartículas de ouro (GNPs) (10, 15 e 80 nm) foram obtidas na Nanocs (EUA). O leitor analítico de ELISA era da Fisher Scientific (Malásia).

Otimização com reagente de silano e GNPs

Para otimizar as concentrações adequadas de APTES e GNPs, foi realizado o processo de imobilização com diferentes combinações de APTES e GNPs na placa de ELISA. Inicialmente, a placa de ELISA foi hidroxilada com KOH a 1% por 1 h. Em seguida, 1,25, 2,5 e 5% de APTES foram ligados em poços separados da placa de ELISA à temperatura ambiente (TA) durante 5 h. Em seguida, os GNPs diluídos (em água destilada) nas concentrações de 25, 50 e 100% foram imobilizados nas superfícies modificadas com APTES. FIX, a 200 nM, foi então autorizado a ligar-se às superfícies do GNP. Os locais de ligação restantes foram então bloqueados usando BSA a 2%, então uma diluição 1:1000 de anticorpo FIX foi introduzida, seguida pela adição de uma diluição 1:1000 de anti-IgG-HRP de camundongo. Finalmente, o substrato foi adicionado para detectar a interação FIX. Os poços foram lavados 5 vezes entre cada etapa usando tampão de lavagem (tampão PBS contendo 0,05% de Tween 20, pH 7,4). Finalmente, a densidade óptica (DO) foi medida por leitor de ELISA a 405 nm. GNPs de tamanho de 15 nm foram usados ​​neste experimento.

Determinando o tamanho necessário dos GNPs

Depois de determinar a concentração adequada de APTES e diluição de GNP nas condições ideais, os GNPs de 10, 15 e 80 nm foram testados para imobilização de FIX para determinar o tamanho mais adequado. As mesmas condições experimentais foram usadas conforme indicado acima. APTES a 2,5% e uma diluição do GNP de 50% foram usados ​​para a imobilização do FIX.

Detecção específica e seletiva de FIX

Também confirmamos a ligação específica de proteína e anticorpo na placa de ELISA. Para isso, utilizamos três tipos diferentes de experimentos de controle. Imobilizamos a seguinte ordem de biomoléculas na placa de ELISA para servir como controles e condições específicas:controle 1 (C1), substrato FIX-BSA-anti-IgG de camundongo; controle 2 (C2), substrato de anticorpo FIX-BSA-FIX; controle 3 (C3), substrato de anticorpo BSA-FIX-IgG anti-camundongo, específico (S), substrato de anticorpo-IgG anti-camundongo FIX-BSA-FIX.

Detecção de FIX conjugado com GNP na placa de ELISA vs. ELISA convencional

O FIX foi detectado usando a placa ELISA modificada com GNP por dois métodos diferentes, como APTES-GNP-FIX e APTES-GNP pré-misturado com FIX, e esses métodos foram comparados com o ELISA convencional. As etapas a seguir constituem os procedimentos. ELISA convencional:(i) a proteína FIX foi diluída em tampão de revestimento 1 × com concentrações de 0 a 200 nM, (ii) bloqueada com BSA a 2%, (iii) foi adicionada diluição 1:1000 de anticorpo FIX, (iv) 1:Foi adicionada diluição 1000 de anti-IgG-HRP de rato, (v) substrato para HRP foi adicionado e medido a 405 nm.

APTES-GNP-FIX (método 1):(i) a placa de PS foi ativada por 1% de KOH, (ii) 2,5% de APTES foi adicionado à placa de ELISA em temperatura ambiente por 5 h, (iii) 25% dos 15 nm recebidos GNP foi adicionado e mantido a 4 ° C durante a noite, (iv) FIX com concentrações de 0 a 200 nM foi permitido ligar-se independentemente à superfície de GNP, (v) a superfície restante foi bloqueada por 2% de BSA, (vi) 1:Foi adicionada diluição de 1000 de anticorpo FIX, (vii) diluição de 1:1000 de IgG-HRP anti-rato, (vii) substrato para HRP foi adicionado e medido a 405 nm.

APTES-GNP pré-misturado FIX (método 2):(i) a placa PS foi ativada por 1% KOH, (ii) 2,5% APTES foi adicionado à temperatura ambiente por 5 h, (iii) pré-mistura de 25% de soluções de 15 nm de GNP com diferentes concentrações de FIX (incubados à temperatura ambiente por 30 min; 0 a 200 nM) foram imobilizados na superfície modificada por APTES, (iv) a superfície remanescente foi bloqueada por 2% de BSA, (v) diluição 1:1000 de anticorpo FIX foi adicionada, (vi) foi adicionada diluição 1:1000 de IgG-HRP anti-ratinho, (vii) substrato para HRP foi adicionado e medido a 405 nm.

Detecção de FIX em soro humano e após a adição de FIX

Para detectar FIX no soro humano, pré-misturamos o soro com GNPs em vez de FIX aqui. Diluições de soro de 20 a 1280 foram tituladas e misturadas com GNPs para avaliar a detecção de FIX. Outras condições experimentais e concentrações foram utilizadas, de forma semelhante aos experimentos anteriores.

A experimentação de spiking foi conduzida através do spiking de diferentes concentrações de FIX (0 a 8 nM) na diluição otimizada de soro humano e pré-mistura com GNPs antes da imobilização na placa de ELISA. Outras condições experimentais e concentrações foram usadas como nos experimentos anteriores.

Fabricação de superfície de eletrodo interdigitado

O processo de fabricação de superfície de eletrodo interdigitado (IDE) inclui limpeza de wafer, crescimento de camada de óxido, revestimento de rotação fotoresiste negativo, padronização de fotoresiste, deposição de metal de alumínio, remoção de fotoresiste e cubos de wafer. O processo foi iniciado na pastilha limpa com ácido de óxido tamponado seguido pela oxidação nas pastilhas de silício (310 nm) em alta temperatura (1000 ° C), então o processo de condicionamento foi realizado usando alumínio. Fotoresiste negativo foi depositado por centrifugador com velocidade de rotação de 2.000 rpm. A resistência foi desenvolvida por RD – 6 após a exposição à luz ultravioleta (240 s). Em seguida, o alumínio de 240 nm foi depositado por um evaporador térmico (Edwards Auto 306) a 3,0E-5 Torr. O fotorresiste foi removido com acetona até que o IDE sólido apareceu e, em seguida, dividido em cubos para criar um IDE único. Finalmente, a camada de óxido de zinco foi sobreposta no topo para a imobilização biomolecular final [31]. Antes de prosseguir com a fixação de óxido de zinco, a superfície de detecção foi inicialmente lavada com hidróxido de potássio 1 M (pH 9,0).

Detecção de FIX em uma superfície modificada por GNP

Após a otimização e confirmação da eficiência de detecção de FIX com substrato ELISA modificado com GNP, a mesma modificação de superfície foi realizada na superfície IDE para complementar a detecção acima. Inicialmente, a superfície de óxido de zinco IDE foi modificada com amina pela adição de APTES 2,5% diluído em etanol por 3 h em temperatura ambiente. Em seguida, a superfície foi lavada cinco vezes com etanol e adicionada a pré-mistura de GNPs (25%) e FIX. Em seguida, as superfícies restantes foram bloqueadas por etanolamina, e o anticorpo FIX foi adicionado em seguida para detectar FIX. As mudanças concomitantes no sinal atual foram notadas. Para verificar o limite de detecção, diferentes concentrações de FIX foram misturadas independentemente com GNPs, imobilizadas na superfície IDE modificada com amina e, em seguida, detectadas pelo anticorpo; o limite de detecção foi determinado pelo cálculo 3σ. A abundância de FIX no soro humano diluído misturado com GNPs foi imobilizada na superfície IDE modificada com amina e então detectada por seu anticorpo. A fabricação da superfície acima seguiu conforme declarado antes [31].

Resultados e discussão

Pré-tratamento em uma superfície PS ELISA

A imobilização eficaz de proteína ou anticorpo na superfície de poliestireno (PS) ELISA aparentemente melhora o limite de detecção da interação alvo-sonda. Diferentes métodos de imobilização têm sido usados ​​para ligação de proteínas ou anticorpos na placa de ELISA. Neste trabalho, introduzimos uma superfície de ELISA quimicamente modificada com GNPs para imobilização de proteínas ou anticorpos. Queríamos usar um dos fatores de coagulação importantes, como o fator IX (FIX), que foi amplamente relatado como importante [32,33,34,35,36]. A Figura 1 mostra a representação esquemática da imobilização da proteína na superfície de poliestireno ELISA. Primeiro, a superfície do ELISA foi ativada por KOH a 1%. Na ausência de pré-tratamento com KOH, o número de moléculas de APTES a serem ligadas na superfície de PS é mínimo. Isso ocorre devido à falta de grupos polares e aceitadores de ligações de hidrogênio, que facilitam a adsorção inicial de APTES em polímeros [11]. Após o tratamento com KOH, a superfície foi modificada com uma amina na concentração adequada de APTES para a captura dos GNPs.

Caracterização de PNB

Antes de prosseguir, caracterizamos os GNPs como recebidos (15 nm) por medidas ópticas, morfológicas e de distribuição de tamanho. A Figura 2a exibe a análise de espectrofotometria UV-Vis dos GNPs, que aparentemente exibiu os máximos de pico em 550 nm. As observações do microscópio eletrônico de transmissão mostram que o tamanho dos GNPs é de ~ 15 nm e a forma é boa (Fig. 2b e inserção). A análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier foi realizada a partir do número de onda de 500 até 4000 cm ^-1 (Fig. 2c). Um pico único aparente em 1650 cm ⁻¹ foi notada para o ouro junto com outro pico menor, enquanto a presença de picos para grupos amina representando a fixação de APTES. Suporte adicional foi fornecido pela distribuição de volume e análises de potencial zeta. Com base nesta análise, a distribuição do volume indica que existe uma ligeira variação na distribuição do tamanho (Fig. 2d) e que o potencial zeta foi de - 6,9, representando a estabilidade dos PNB utilizados neste estudo (Fig. 2e).

Caracterização de nanopartículas de ouro. Executado com o tamanho ideal de 15 nm. a Análise de espectrofotometria UV-Vis. Um único pico proeminente foi encontrado em 550 nm. b Observação por microscópio eletrônico de transmissão. A inserção da figura mostra a imagem ampliada. A barra de escala é mostrada. c Análise de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Posições de pico aparentes para ouro e NH ₂ são indicados. d Análise da distribuição do volume do PIB. A distribuição obtida é mostrada. e Análise do potencial Zeta. O valor encontrado foi de - 6,9

Preparação e otimização de superfície de amina para capturar GNPs

A quantidade de APTES influencia muito a imobilização de GNP ou anticorpo na superfície do PS. Em geral, as moléculas APTES altamente aglomeradas têm uma probabilidade de criar resultados falso-positivos. Como o APTES tem sido usado de 1 a 2% para imobilizar o anticorpo em várias superfícies de sensores, aqui, titulamos de 1,25 a 5% de APTES, preparado em etanol absoluto. Em seguida, nosso objetivo foi imobilizar GNPs nas superfícies modificadas por APTES. Existe a possibilidade de que números maiores de GNPs produzam o efeito de aglomeração, então GNPs com 25, 50 ou 100% de 15 nm foram testados na superfície modificada por APTES para otimizar a diluição adequada. Nessas superfícies modificadas, 250 nM do FIX foram detectados com o anticorpo FIX. Conforme mostrado na Fig. 2a eb, 1,25% APTES mostra menos absorbância óptica (OD) com todas as diluições de GNPs (25, 50 e 100%), enquanto 2,5 e 5% APTES mostraram maior absorbância com 50 e 100% de PNB. Ao mesmo tempo, a relação sinal-ruído foi melhorada com o aumento das concentrações de APTES e GNP (Fig. 3a, b). Os APTES a 5% com 50 e 100% de GNPs apresentaram ligação inespecífica e 50 e 100% de GNPs com APTES a 2,5% apresentaram absorbância semelhante. Com base nesses valores obtidos, escolhemos 2,5% de APTES e 25% de diluição de GNPs para experimentos posteriores.

Determinando os montantes de APTES e PNB. Três concentrações diferentes (1,25, 2,5 e 5%) de APTES foram usadas com três diluições de GNP (25, 50 e 100%). a Detecção visual de FIX após adicionar o substrato. Pistas de controle sem FIX foram incluídas. b Representação gráfica do nível ótimo de APTES. 2,5% APTES e 25% PNB foram considerados ótimos

Determinação do tamanho potencial do PNB

Após a otimização da diluição do APTES e do GNP, avaliamos a seguir o tamanho adequado dos GNPs. Uma vez que a área de superfície desempenha um papel crucial na imobilização de proteínas, aqui, tentamos imobilizar três tamanhos diferentes de GNPs, incluindo 10, 15 e 80 nm. Tamanhos diferentes de GNPs têm áreas de superfície diferentes e cargas diferentes para atrair a proteína, e a capacidade de ligação na superfície modificada por APTES também é diferente. Como mostrado na Fig. 4a, FIX 250 nM foi detectado com a superfície de ELISA modificada com GNPs de 10, 15 e 80 nm. Verificou-se que os GNPs de 15 e 80 nm mostram quase a mesma absorvância de 0,4 (OD) para a detecção de 250 nM de FIX, mas os GNPs de tamanho de 10 nm mostram apenas 0,34 OD. A partir dessa experiência, confirmamos que os GNPs de 15 ou 80 nm são adequados para outros experimentos e continuamos com os GNPs de 15 nm.

a Determinar o tamanho ideal do PNB. Entre 10, 15 e 80 nm, 15 e 80 nm mostraram resultados semelhantes. Quinze nanômetros foram usados ​​para determinar o limite de detecção com FIX. b Um experimento de controle para a detecção de FIX. Foram realizados três experimentos de controle diferentes (C1 - sem anticorpo FIX; C2 - sem IgG anti-camundongo; C3 - sem FIX). Nenhum sinal significativo foi encontrado em qualquer um dos experimentos de controle. As inserções da figura exibem os resultados visuais

Estratégias experimentais para confirmar a não incrustação e o alto desempenho

Antes de detectar o FIX na superfície ELISA modificada com GNP, realizamos três tipos diferentes de experimentos de controle, conforme explicado na seção “Materiais e Métodos”. Conforme mostrado na Fig. 4b, não pudemos observar absorbância significativa nos poços para os experimentos de controle 1, 2 e 3 (C1, C2 e C3). No experimento específico (S), o nível mais alto de absorbância está claramente associado a mudanças aparentes de cor. No caso de C1, não adicionamos anticorpo FIX, o que confirma que o anticorpo FIX interage especificamente com FIX (em S). Nenhum sinal observável foi encontrado na ausência de IgG anti-camundongo em C2, o que fornece ancoragem adicional para a interação adequada de FIX e anticorpo seguido por IgG anti-camundongo. Em C3, na ausência de FIX, não foi possível medir a absorbância significativa. A partir desses resultados, a interação adequada de FIX com seu anticorpo na superfície de ELISA foi confirmada sem ligação não específica.

ELISA assistido por GNP vs. ELISA convencional:determinação da sensibilidade

Após a realização dos experimentos de controle, detectamos FIX com superfícies modificadas com GNP e comparamos os resultados com o método ELISA convencional. Conduzimos três experimentos diferentes para a detecção de FIX. Primeiro, o GNP foi imobilizado em superfícies modificadas por APTES e, em seguida, o FIX foi fixado na superfície do GNP por meio de interação eletrostática. Devido à interação eletrostática, a maioria das proteínas tem a possibilidade de se ligar à superfície do GNP; dessa forma, poderíamos imobilizar o FIX na superfície do ELISA PS. A imobilização de proteínas também depende das cargas oriundas dos aminoácidos e do GNP. Gopinath et al. [37] provaram a forte ligação do FIX na superfície do GNP e também descobriram que é estável em condições de alto teor de sal. No segundo método, o GNP e a proteína foram primeiro pré-misturados antes de serem imobilizados na superfície de ELISA PS aminada. Esperava-se que mais proteínas pudessem se ligar dessa maneira, porque há uma possibilidade maior de que as moléculas de proteína sejam capazes de se ligar à superfície do GNP no estado de solução. A solução pré-misturada foi então imobilizada nas superfícies de amina modificada por APTES. Esses métodos foram comparados com o método ELISA convencional. Como mostrado na Fig. 5a, quando titulamos a concentração de FIX de 0 a 200 nM, o ELISA convencional (método 1) mostrou o limite de detecção de 6 nM. O método APTES-GNP-FIX (método 2) exibe o limite de detecção de 200 pM, que é mais de 30 vezes mais sensível do que o ELISA convencional. O aumento da sensibilidade é obtido por meio da orientação adequada de um grande número de antígenos imobilizados na placa ELISA PS e, por fim, mais anticorpos interagirão. Nesta pesquisa, nanopartículas de ouro foram utilizadas para imobilizar mais antígenos por meio da modificação da amina da placa de ELISA. No ELISA convencional, os antígenos são imobilizados diretamente na placa de ELISA, o que leva a um menor número de moléculas ligando-se à superfície e causa redução da sensibilidade em relação à estratégia atual mediada por nanopartículas de ouro. Além disso, a ressonância localizada de plasmon de superfície proporciona maior melhora da sensibilidade, conforme revelado nos estudos com GNPs. Quando pré-misturamos GNPs com FIX, como esperado, o limite de detecção foi muito melhorado e atingiu o nível de 100 pM, que é 60 vezes mais sensibilidade do que o ELISA convencional. Como mostrado na Fig. 5a, pode ser visto claramente que quando usamos GNPs para imobilização de proteínas, a absorbância máxima atingiu ~ 0,6 para proteínas pré-misturadas e imobilizadas diretamente nas superfícies de GNP, mas a absorbância encontrada com ELISA convencional foi de ~ 0,4 usando a concentração semelhante (200 nM) de FIX. Mesmo com outras concentrações, o método 3 apresentou uma diferença de absorbância maior em relação ao ELISA convencional, e esta também foi razoavelmente maior do que o método 2. No caso do ELISA convencional, a detecção visível foi encontrada a partir de 25 nM e de 3 nM no método 2. Com o método 3, pudemos ver visivelmente a mudança de cor de 200 pM de FIX devido à maior absorvância (Fig. 5a). A absorbância foi saturada em 25 nM no método 3. Uma vez que pudemos visualizar as mudanças de cor de 200 pM de FIX, avaliamos o limite de detecção e titulado usando as concentrações mais baixas de FIX. Ficou aparente que o limite de detecção atingiu 100 pM quando pré-misturamos os GNPs e o FIX (Fig. 5b).

a Comparando a sensibilidade de FIX no ELISA modificado com GNP com o ELISA convencional. O FIX foi titulado de 0,2 a 200 nM. O ELISA convencional exibe o limite de detecção de 6 nM. No ELISA modificado com GNP, o sinal foi observado até 200 pM. A inserção da figura exibe os resultados visuais. b Limite de detecção de FIX na placa ELISA modificada com GNP. O FIX foi titulado de 25 a 100 pM. O limite de detecção encontrado foi de 100 pM. As inserções da figura exibem os resultados visuais

Detecção de FIX em soro humano e aprimoramento por adição de FIX

Uma vez que foi descoberto que FIX desempenha um papel importante na cascata de coagulação [38, 39], após verificar o limite de detecção, também detectamos FIX no soro humano. Para esta análise, titulamos o soro humano na faixa de diluições entre 1:1280 e 1:20. O soro diluído foi pré-misturado com GNPs e imobilizado na superfície de ELISA modificada por APTES, como indicado acima. Era óbvio que o FIX foi detectado a partir da diluição de 1:640 de soro, que é equivalente a 125 pM de FIX (Fig. 6a). O soro humano saudável geralmente contém aproximadamente 87 nM de FIX, junto com outras proteínas importantes, como albumina e globulina. Com nossa estratégia, atingimos o limite de detecção específico de 125 pM no soro humano, o que é útil para identificar um defeito na coagulação do sangue. Por outro lado, quando adicionamos FIX de 1 a 8 nM na diluição de 1:640 de soro humano, ele exibiu aumentos na absorbância que aumentaram concomitantemente com as concentrações de FIX (Fig. 6b).

a Detecção de FIX em soro humano. O soro humano foi diluído de 1:20 a 1:1280. FIX foi detectado em soro humano diluído 1:640 (a figura interna indica a representação esquemática). b Acréscimo de FIX (0,125 a 8 nM) em diluição 1:640 de soro humano. Com incrementos na concentração de FIX, a absorbância foi aumentada. As inserções da figura exibem os resultados visuais

Detecção de GNP-FIX na superfície IDE:análise de complementação

Como foi descoberto que o FIX conjugado com GNP melhorou o limite de detecção, aplicamos uma estratégia semelhante usando o sensor eletroquímico com superfície IDE para complementar esses achados. Titulamos o FIX de 25 a 200 pM (misturado com GNPs), imobilizamos na superfície IDE modificada com amina e então o detectamos pelo anticorpo FIX. Conforme mostrado na Fig. 7a, com o aumento na concentração de FIX, o nível atual também aumentou concomitantemente a partir da linha de base. O nível de FIX estava saturado de 200 pM e o limite de detecção encontrado foi de 25 pM. Esta detecção é quatro vezes melhorada em comparação com ELISA (100 pM). Além disso, a detecção de FIX foi evidenciada no soro humano diluído (Fig. 7b). Para esta experiência, o soro humano foi diluído de 1:80 a 1:1280. Conforme mostrado na figura, a diluição de 1:1280 (curva vermelha) mostra uma diferença aparente da linha de base (curva preta) com a estimativa 3σ, indicando que a detecção evidente de FIX do soro humano com a diluição de 1:1280 corresponde com os resultados de ELISA (detectado em 1:640). A detecção do IDE com menor diluição mostra o incremento na sensibilidade.

a Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280

Conclusion

Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.

Disponibilidade de dados e materiais

All of the data are fully available without restriction.

Abreviações

APTES:

(3-aminopropil) trietoxissilano

BSA:

Albumina sérica bovina

COOH:

Carboxyl

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

Fc:

Fragment crystallizable

GNP:

Gold nanoparticle

HRP:

Peroxidase de rábano

IDE:

Interdigitated electrode

IgG:

Immunoglobulin

OD:

Densidade ótica

PEG:

Polietileno glicol

PS:

Poliestireno

PVLA:

Polyvinyl benzyl lactonoylamide

TMB:

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

Lipossomas PEGuilados Carregados com Bufalina:Eficácia Antitumoral, Toxicidade Aguda e Distribuição nos Tecidos Projeto de NiO Flakes @ CoMoO4 Nanosheets Arquitetura Core-Shell em Ni Foam para Supercapacitores de Alto Desempenho