Nanofolhas de dupla função de dissulfeto de titânio carregadas com resveratrol e direcionadas para mitocôndrias para quimioterapia de tumor de disparo fototérmico

Resumo

A administração de drogas anticâncer direcionadas a organelas subcelulares é uma estratégia promissora para maximizar os efeitos anticâncer e minimizar os efeitos adversos. Aqui, preparamos uma nanoplataforma de entrega de droga direcionada à mitocôndria com base em iodeto IR780 (IR780) e dissulfeto de titânio (TiS ₂ ) nanofolhas. Devido à grande área de superfície específica do TiS ₂ nanofolhas, a nanoplataforma poderia carregar altamente o resveratrol do medicamento anticâncer (RV). O nanocompósito conforme preparado (IR780-TiS ₂ / RV) foi utilizado para uma quimioterapia tumoral eficaz desencadeada por fototermia. IR780-TiS ₂ / RV apresentou estabilidade e biocompatibilidade satisfatórias, e a taxa de carregamento de RV e IR780 foi de cerca de 112% e 56%, respectivamente. Após a irradiação no infravermelho próximo (NIR), o calor gerado pelo IR780-TiS ₂ / RV pode desencadear a liberação do RV. Devido à conjugação com o IR780 específico da mitocôndria, IR780-TiS ₂ / RV pode ter como alvo e se acumular na mitocôndria e liberar RV quando desencadeada por NIR para diminuir o potencial da membrana mitocondrial, induzir rapidamente a suprarregulação de fatores apoptóticos intrínsecos chave, como citocromo c, e iniciar a cascata de caspases, alcançando assim o efeito quimioterápico. O IR780-TiS ₂ / O nanocompósito de RV demonstrou ter uma alta eficácia antitumoral in vitro e in vivo, bem como nenhuma toxicidade tecidual notável. Acreditamos que nosso estudo demonstra que o IR780-TiS ₂ disparado por NIR / A nanoplataforma de RV pode ser um agente quimioterápico promissor na prática clínica.

Introdução

O câncer continua sendo uma doença com risco de vida e é responsável por altas taxas de mortalidade em todo o mundo [1]. Cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapia hormonal ainda são os principais métodos terapêuticos utilizados na prática clínica [2, 3]. Destes métodos, a quimioterapia é uma opção de tratamento amplamente aceita por médicos e pacientes devido à sua eficácia relativamente alta [4, 5]. A quimioterapia está associada a alguns problemas graves, por exemplo, resistência aos medicamentos, recorrência do tumor e inespecificidade [5,6,7]. Portanto, o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos e estratégias para superar esses obstáculos é de grande urgência [8]. Nos últimos anos, carregar um medicamento anticâncer em um transportador funcionalizado que pode atingir simultaneamente uma entrega direcionada e uma liberação controlada do medicamento tornou-se uma abordagem popular para maximizar o efeito terapêutico e diminuir os efeitos colaterais [9,10,11] . Uma grande área específica que pode fornecer uma melhor proporção de carga de medicamento é essencial para um excelente carreador de medicamento [12].

Além disso, a fim de melhorar a especificidade do fármaco, o carreador é geralmente modificado com uma molécula de alvo celular, como ácido fólico alvo de superfície celular e glutationa [13,14,15,16,17]. Uma vez que muitos quimioterápicos atuam em organelas subcelulares específicas, o projeto de um sistema de entrega específico para organelas poderia aumentar notavelmente o efeito terapêutico e reduzir os efeitos adversos [18,19,20]. Consequentemente, a seleção do local-alvo dentro das células tumorais é vital para o sistema de distribuição de drogas. As mitocôndrias não são apenas uma “fábrica de energia” de células, mas também um alvo-chave de drogas quimioterápicas que têm como alvo a mitocôndria para iniciar a via apoptótica intrínseca [21,22,23]. Conseqüentemente, o desenvolvimento de um sistema de administração de drogas anticâncer direcionado à mitocôndria pode ser vital para uma quimioterapia contra o câncer mais eficaz. Até agora, vários tipos de sistemas de entrega de drogas foram projetados, como sílica mesoporosa, materiais à base de carbono e proteínas [17, 24,25,26]. Embora esses transportadores tenham sido relatados como eficientes para entrega de drogas e terapia tumoral, sistemas de entrega de drogas mais novos e altamente eficientes ainda são altamente desejados.

Neste estudo, construímos uma nanoplataforma de entrega de drogas direcionada a mitocôndrias e disparada por NIR com base em dissulfeto de titânio bidimensional (TiS ₂ ) nanofolhas para quimioterapia tumoral controlada e direcionada. TiS ₂ é um membro de dichalcogenetos de metais de transição, que possuem uma grande área específica [27,28,29]. Após a esfoliação por ultra-som assistido por proteína, a superfície do TiS ₂ nanofolhas são modificáveis por outras moléculas funcionais por meio de interações covalentes ou não covalentes. Além disso, a molécula específica da mitocôndria do tumor IR780 (iodeto IR-780) foi escolhida para modificar o TiS ₂ nanofolhas. IR780 dota as nanofolhas com a capacidade de direcionamento de mitocôndrias, que é através do transporte ativo mediado por polipeptídeo de transporte de ânion orgânico e o recurso de cátion lipofílico [30, 31]. Foi relatado que o IR780, como um cátion lipofílico, mostrou mais acúmulo nas mitocôndrias das células tumorais devido à alta magnitude do potencial de membrana mitocondrial nas células tumorais do que nas células normais [32, 33]. Além disso, o IR780 também é um agente fototérmico responsivo ao infravermelho próximo. A nanoplataforma conforme preparada, denominada IR780-TiS ₂ , foi confirmado como biocompatível e poderia carregar com eficácia o medicamento anticâncer resveratrol (RV) (IR780-TiS ₂ / RV) [24]. O IR780-TiS ₂ / RV possuía uma capacidade de direcionamento de mitocôndrias e um efeito fototérmico. O NIR foi aplicado como um estímulo externo para desencadear a liberação local do fármaco após a irradiação do NIR. Experimentos in vitro e in vivo mostraram que IR780-TiS ₂ / RV tem um efeito quimioterápico altamente eficiente. Um estudo posterior do mecanismo revelou que a morte celular induzida por IR780-TiS ₂ / RV foi através da via de apoptose intrínseca mediada por mitocôndrias. Este sistema de entrega de drogas direcionado à mitocôndria (Esquema 1) pode ser um agente quimioterápico potencial em futuras aplicações clínicas.

O esquema de preparação de IR780-TiS ₂ / RV, que foi usado como um sistema de entrega de drogas desencadeado por NIR para quimioterapia tumoral mediada pela via de apoptose intrínseca

Materiais e métodos

Materiais

A Sigma-Aldrich forneceu o iodeto IR-780 (IR780), TiS ₂ pó, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (St. Louis, MO, EUA). Albumina de soro bovino (BSA ≥ 98,0%) foi adquirida de BioSharp Co., Ltd. (Coréia). O Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foi adquirido da Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japão). Os reagentes de cultura de células, incluindo meio DMEM e soro fetal bovino (FBS), foram fornecidos pela Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os produtos químicos foram obtidos na Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Síntese de IR780-TiS ₂ / RV

A primeira etapa foi a preparação de TiS ₂ solúvel em água nanofolhas de acordo com o relatório anterior [34]. Em detalhe, 5 mg de TiS em massa ₂ foi misturado com 5 mL de água e agitado durante 20 min. O TiS ₂ suspensão de água foi então adicionada a 5 mg de BSA e foi processada sob ultra-som de banho de gelo dissociado usando uma sonicação de ponta de 500 W e 20 kHz (Sonics, VCX130, EUA) por 6 h. Posteriormente, a mistura preparada foi centrifugada a 12.000 rpm por 10 min, resultando em TiS ₂ nanofolhas no sobrenadante.

Em segundo lugar, TiS ₂ nanofolhas foram conjugadas com IR780. Trietilamina (TEA) foi aplicada como um agente de ligação de ácido. Cinco miligramas de IR780 foram dissolvidos em 2 mL de DMSO e agitados a 60 ° C durante 8 h com a adição de TEA. A suspensão da mistura foi dialisada em água destilada durante 2 dias e depois foi centrifugada a 9000 rpm durante 8 min para remover o produto agregado. O sobrenadante foi coletado, resultando em IR780-TiS ₂ .

Por fim, o RV foi carregado no IR780-TiS ₂ . IR780-TiS ₂ (1 mg / ml) foi misturado com RV (2 mg / ml, dissolvido em DMSO), que foi ligeiramente agitado durante a noite à temperatura ambiente. Posteriormente, o DMSO e o RV livre foram eliminados por diálise em água destilada durante a noite para fornecer IR780-TiS ₂ / RV. Com base na literatura, a taxa de carregamento RV detectada por um espectrofotômetro UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Japão) e calculada de acordo com a seguinte equação:
$$ \ mathrm {RV} \ \ mathrm {carregando} \ \ mathrm {proporção} \ \ left (\% \ right) =\ frac {A_a- {A} _b} {A_c} \ times 100 \% $$
onde A _a (mg), A _b (mg) e A _c (mg) representam o RV inicial não ligado e o IR780-TiS ₂ , respectivamente.

Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier TENSOR 27 Bruker (FTIR) (Bruker Optics Ltd., Coventry, Reino Unido) foi usado para detectar a estrutura química de TiS ₂ , IR780-TiS ₂ e R780-TiS ₂ / RV. A análise Brunauer-Emmett-Teller (BET) foi realizada para determinar a área de superfície específica das amostras, calculada a partir de N ₂ resultado de adsorção através de um analisador de área de superfície (Quantachrome ChemBET-3000) com base na equação BET.

Linha celular e cultura celular

As células CT26 de câncer de cólon de camundongo foram obtidas do Banco de Células da Academia Chinesa de Coleção de Culturas de Tipo (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio DMEM completo (10% FBS + 90% DMEM) em uma incubadora umidificada com 5% de CO ₂ a 37 ° C.

Localização in vitro de IR780-TiS ₂ / RV

FITC foi usado para rotular IR780-TiS ₂ / RV ou TiS ₂ / RV. Em resumo, FITC foi dissolvido em solução de etanol (2,0 mg / mL) e misturado com IR780-TiS ₂ / RV ou TiS ₂ / RV solução aquosa (1,0 mg / mL) sob agitação de 4 h em ambiente escuro à temperatura ambiente. A mistura foi dialisada em água destilada durante a noite para remover o FITC e etanol redundantes, resultando em IR780-TiS ₂ marcado com FITC / RV ou TiS ₂ / Solução RV. Para confirmar a co-localização mitocondrial de nanopartículas in vitro, as células tratadas com IR780-TiS marcado com FITC ₂ / RV ou TiS ₂ / RV por 5 he corado pelo corante específico para mitocôndrias MitoTracker. Posteriormente, a internalização celular de IR780-TiS ₂ / RV ou TiS ₂ / RV foi observada usando um CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Em resumo, as células CT26 foram incubadas com TiS ₂ marcado com FITC / RV e IR780-TiS ₂ / RV (com a mesma concentração de FITC) por 5 h. E então, as células foram tratadas com soluções MitoTracker Red FM (100 nM) a 37 ° C por 30 min. Após lavagem por PBS por três vezes, as células foram observadas por um CLSM. O software ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência das células.

Quimioterapia de tumor in vitro desencadeada por NIR e estudo de apoptose

4 × 10 ³ células / poço células CT26 em placas de cultura de 96 poços foram tratadas com RV livre, IR780-TiS ₂ , IR780-TiS ₂ / RV e TiS ₂ / RV com diferentes concentrações de RV por 5 he então foram irradiados com ou sem NIR por 3 min (808 nm, 0,3 W / cm ² ) Após mais 24 horas de incubação, a viabilidade das células tratadas foi analisada pelo ensaio CCK-8. As células tratadas também foram coradas por Rhodamine123 (Sigma) e analisadas por FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, EUA). A detecção de apoptose celular também foi realizada por análise de FCM usando o kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC / PI (Bender MedSystems, Viena, Áustria) como descrito anteriormente.

Western Blot

As células CT26 foram tratadas com PBS (controle), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV + NIR (RV equivalente, 30 μg / mL; IR780 equivalente, 0,5 μg / mL) para uma incubação de 5 h. Após mais uma incubação de 24 horas, as células foram coletadas respectivamente de Western blot, que foi baseado no protocolo relatado anteriormente [23]. Resumidamente, as células foram lisadas e inibidas por uma protease e Triton X-100. Eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida foi usada para recuperar e separar proteínas que foram então transferidas para uma membrana de PVDF e bloqueadas usando 5% de leite sem gordura. Posteriormente, os anticorpos primários diluídos foram incubados a 4 ° C por 12 h, incluindo citocromo c (1/1000, Boster, Wuhan, China), caspase-3 clivada (1/1000, CST), caspase-9 clivada (1 / 1000, CST) e actina (1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China) e depois incubado com um anticorpo secundário. Finalmente, o reagente ECL foi usado para detectar as proteínas.

Modelo Animal

Para estabelecer o modelo de tumor subcutâneo CT26, 1 × 10 ⁷ Células CT26 (100 μL, em PBS) foram injetadas por via subcutânea na parte de trás de camundongos nus Balb / c. Volume do tumor =comprimento × largura ² / 2. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê de Ética em Animais do hospital central de Zhumadian (Henan, China).

Biodistribuição In Vivo

Biodistribuição de IR780-TiS ₂ / RV nos camundongos nus portadores de tumor foi detectado 24 horas após a injeção intravenosa da cauda com IR780-TiS ₂ / RV (150 μL, 6 mg / kg). Os principais órgãos, incluindo coração, fígado, baço, pulmão, rim e tumor, foram pesados e digeridos por solução de água régia. O conteúdo do elemento Ti nesses tecidos foi quantificado por ICP-OES.

Quimioterapia de tumor in vivo NIR-Triggered

Camundongos portadores de tumor CT26 foram separados aleatoriamente em seis grupos ( n =6), incluindo solução salina, solução salina + NIR, RV, IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV + NIR (RV equivalente, 1 mg / kg; IR780 equivalente, 0,5 mg / kg). A condição de irradiação NIR é 808 nm, 0,3 W / cm ² e 3 min. Durante 30 dias de tratamento, os volumes do tumor e os pesos dos camundongos foram registrados a cada 3 dias. Após o tratamento, os órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim em vários grupos foram fixados e corados por H&E.

Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. t do aluno teste foi usado para examinar diferenças significativas entre dois grupos. P <0,05 foi considerado significativo e P <0,01 foi considerado muito significativo.

Resultados e discussão

Preparação e caracterização de IR780-TiS ₂ / RV

Para preparar IR780-TiS ₂ / RV, em primeiro lugar, TiS biocompatível ₂ nanofolhas foram preparadas através de albumina de soro bovino (BSA) e método de esfoliação assistida por ultrassom, conforme relatado anteriormente [34, 35]. A seguir, IR780-TiS ₂ foi sintetizado em uma reação de substituição entre um átomo de cloro de IR780 e grupos amino de BSA absorvido no TiS ₂ nanofolhas usando um agente de ligação de ácido TEA. Por fim, o IR780-TiS ₂ A nanoplataforma carregou o fármaco anticâncer RV por meio de absorção física. O diagrama esquemático de IR780-TiS ₂ / RV é mostrado no Esquema 1. Arquivo adicional 1:A Figura S1 mostra a imagem TEM do TiS esfoliado assistido por proteína ₂ , que era uma estrutura de nanosheet exibida. O padrão XRD do TiS ₂ nanofolhas também foram detectadas, o que indicou boa cristalinidade do TiS ₂ preparado nanofolhas, consistentes com as observações do TEM (arquivo adicional 1:Figura S2). Após a funcionalização, o IR780-TiS ₂ / RV nanocompósito tinha uma morfologia semelhante a um floco com um espaçamento de rede de 0,25 nm, conforme mostrado por microscopia eletrônica de transmissão (Figs. 1a, b) e um diâmetro médio de cerca de 123,6 nm e potencial zeta de - 37,2 mV, conforme detectado pelo Nanosizer (Malvern Instrumentos) (Fig. 1c, d). Após um armazenamento de 2 semanas em água, FBS ou solução salina, o tamanho médio do IR780-TiS ₂ / RV permaneceu constante em aproximadamente 123 nm (Fig. 1e) indicando a estabilidade de IR780-TiS ₂ / RV, possivelmente devido à adesão de BSA na superfície do TiS ₂ nanofolhas. A Figura 1f mostra os espectros de absorbância de IR780 livre, RV livre, TiS ₂ nanofolhas e IR780-TiS ₂ / RV. O espectro de absorção de IR780-TiS ₂ / RV mostrou os picos de IR780 livre e RV livre, indicando que ambos IR780 e RV foram conjugados com sucesso com o TiS ₂ nanofolhas. A taxa de carregamento RV de IR780-TiS ₂ era cerca de 112% ( W / W ), que foi alcançado por meio de interações não covalentes (por exemplo, π - π empilhamento e interações hidrofóbicas). Além disso, de acordo com o resultado do BET, as áreas de superfície foram calculadas em 15,2 m ² / ge 122,1 m ² / g para TiS em massa ₂ e TiS ₂ nanofolhas, respectivamente. O TiS esfoliado ₂ nanofolhas mostram uma área de superfície BET muito maior do que a do TiS em massa ₂ , que fornecem grande área ativa para carregamento de drogas. O carregamento foi provavelmente alto devido à grande área de superfície específica e à adesão BSA ao IR780-TiS ₂ nanofolhas [23]. Para confirmar ainda mais, RV e IR780 foram carregados no TiS ₂ nanofolhas, os espectros FTIR de TiS ₂ nanofolhas, IR780-TiS ₂ e IR780-TiS ₂ / RV foram medidos. No arquivo adicional 1:Figura S6, todos os picos característicos de TiS ₂ nanofolhas apareceram em espectros FTIR de IR780-TiS ₂ / RV. Além disso, três novos picos apareceram (~ 3191 cm ⁻¹ , ~ 1510 cm ⁻¹ , 1230 cm ⁻¹ ) no espectro de IR780-TiS ₂ / RV, indicando a existência de RV e IR780 [36, 37].

a A imagem TEM do IR780-TiS ₂ / RV. b A imagem TEM de alta resolução do IR780-TiS ₂ / RV. c A distribuição de tamanho e d distribuição de potencial zeta de IR780-TiS ₂ / RV. e A mudança de tamanho de partícula hidrodinâmica de IR780-TiS ₂ / RV em água, SFB e solução salina por 2 semanas. f O espectro de absorção de RV, IR780, TiS ₂ nanofolhas e IR780-TiS ₂ / RV

Após uma irradiação NIR de baixa potência de 3 minutos (808 nm, 0,3 W / cm ² ), o IR780-TiS ₂ / A temperatura da solução RV aumentou proporcionalmente à concentração de IR780-TiS ₂ / RV (0, 5, 10 μg / ml) e o IR780-TiS de 10 μg / ml ₂ / A solução RV atingiu a temperatura máxima de 47,6 ° C (Fig. 2a). Além disso, IR780-TiS ₂ / RV manteve seu efeito fototérmico inicial mesmo após cinco ciclos de irradiação NIR, enquanto o IR780 livre mostrou um efeito fototérmico diminuído (Fig. 2b). Estes resultados indicam o IR780-TiS ₂ / O nanocompósito de RV tem grande fotoestabilidade.

a O efeito fototérmico do IR780-TiS ₂ / RV sob a irradiação NIR (808 nm, 0,3 W / cm ² ) por 3 min. b Mudança de temperatura de IR780 e R780-TiS ₂ / RV após cinco ciclos de irradiações NIR (808 nm, 0,3 W / cm ² , 3 min). c O esquema da liberação do RV com disparo fototérmico. d Liberar cinética de RV de IR780-TiS ₂ / RV em tampão PBS (pH =7,4 e 6,5) com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W / cm ² ) ** P <0,01, em comparação com o grupo pH =7,4 e pH =6,5

Em seguida, a taxa de liberação de RV foi medida sob várias condições de irradiação de pH e NIR (Fig. 2c, d). Após 24 h, a taxa de liberação de RV foi de 8,56% em condições fisiológicas (pH 7,4), mas aumentou significativamente para 16,2% em pH 6,5, indicando que pode ser aumentada por condições fracamente ácidas. Além disso, a taxa de liberação de RV foi novamente aumentada significativamente para 44,8% em pH 6,5 e uma irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W / cm ² ) Estes resultados demonstram que a irradiação NIR pode ser um estímulo externo controlável para desencadear a liberação de RV de IR780-TiS ₂ / RV. Este efeito é provavelmente devido ao calor gerado pelo IR780-TiS ₂ sob irradiação NIR enfraquecendo as interações de adsorção não covalente entre RV e o IR780-TiS ₂ superfície [35]. Além disso, em ambiente ácido, o H + pode alterar a carga superficial do TiS ₂ que alteram o equilíbrio hidrofílico / hidrofóbico das nanopartículas [38, 39].

Localização in vitro de IR780-TiS ₂ / RV

Para investigar a captação celular e a distribuição intracelular de IR780-TiS2 / RV, o IR780-TiS ₂ / RV nanopartículas foram marcadas com FITC, e um CLSM foi usado para visualizar a fluorescência intracelular. Após uma incubação de 5 horas, TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV mostrou uma intensidade de fluorescência semelhante no citoplasma (Fig. 3a, b), indicando que ambos os nanocompósitos poderiam entrar nas células, provavelmente por endocitose. No entanto, o IR780-TiS ₂ / RV nanocompósito exibiu uma maior intensidade de fluorescência amarela e verde quando o sinal FITC foi mesclado com a marcação MitoTracker (Fig. 3a, c). Estes resultados indicam que IR780-TiS ₂ / RV pode ter como alvo as mitocôndrias com alta eficiência. Além disso, a distribuição de IR780-TiS ₂ / RV dentro do citoplasma foi posteriormente confirmado usando TEM, que mostrou nanopartículas retidas em algumas mitocôndrias (Fig. 3d). Juntos, esses resultados confirmam firmemente que IR780-TiS ₂ / RV atinge um bom direcionamento mitocondrial, o que promove ainda mais o acúmulo de droga mitocondrial, causando toxicidade celular imediata. O direcionamento da mitocôndria foi provavelmente mediado pelo transporte ativo mediado pelo polipeptídeo transportador de ânions orgânicos e pela característica catiônica lipofílica, que fez com que as nanopartículas se acumulassem altamente nas mitocôndrias das células tumorais [30,31,32,33].

a As imagens de fluorescência de células CT26 incubadas com TiS ₂ marcado com FITC / RV ou IR780-TiS ₂ / RV por 5 h. A fluorescência verde é o sinal FITC e a fluorescência vermelha é o sinal MitoTracker. b A análise de intensidade média de fluorescência (MFI) correspondente de TiS marcado com FITC ₂ / RV ou IR780-TiS ₂ / RV em células na Fig. 3a. c O coeficiente de colocalização correspondente de TiS ₂ marcado com FITC / RV ou IR780-TiS ₂ / RV e mitocôndrias em células na Fig. 3a. M significa mitocôndria . ** P <0,01, em comparação com TiS ₂ / Grupo RV sozinho

Quimioterapia de tumor in vitro desencadeada por NIR

Primeiro, o efeito fototérmico foi avaliado in vitro. Após uma incubação de 5 h, IR780-TiS ₂ / RV mostrou um aumento de temperatura de cerca de 17 ° C, enquanto TiS ₂ / RV apresentou aumento de temperatura de cerca de 10 ° C (Fig. 4a). O efeito fototérmico foi atribuído a IR780 e TiS ₂ nanofolhas. Demonstrando biocompatibilidade como uma nanoplataforma para carregamento de drogas, IR780-TiS ₂ não exibiu citotoxicidade pronunciada abaixo da concentração de 300 μg / ml (Fig. 4b). Além disso, RV com ou sem irradiação NIR teve um efeito similar de morte celular dependente da concentração (Fig. 4c). Na mesma concentração de RV, RV alcançou o melhor efeito de morte celular quando carregado por IR780-TiS ₂ e irradiado por NIR em comparação com todas as outras condições, ou seja, RV livre, IR780-TiS livre ₂ , e RV carregado por TiS ₂ (Fig. 4d). Curiosamente, o IR780-TiS ₂ descarregado plataforma não exibiu efeito anticâncer notável quando exposta à irradiação NIR em comparação com aquela sem irradiação NIR (Fig. 4d), indicando que o calor gerado por IR780-TiS ₂ após a irradiação NIR, o estímulo foi usado principalmente para desencadear a liberação do fármaco, que então matou as células. Estes resultados sugerem que IR780-TiS ₂ / RV pode liberar RV na mitocôndria quando desencadeada pela irradiação NIR e, assim, aumentar notavelmente a concentração local de RV dentro da mitocôndria e atingir um maior efeito inibidor do tumor.

a As curvas de mudança de temperatura de PBS (controle), TiS ₂ / RV ou IR780-TiS ₂ / Células tratadas com RV sob irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W / cm ² ) b Citotoxicidade in vitro contra células CT26 tratadas com diferentes concentrações de IR780-TiS ₂ . c Viabilidade celular de células tratadas com RV com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W / cm ² ) por 3 min. d Viabilidade celular de células tratadas com IR780-TiS ₂ , RV, TiS ₂ / RV ou IR780-TiS ₂ / RV com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W / cm ² ) por 3 min. ** P <0,01, em comparação com IR780-TiS ₂ / RV sem grupo NIR sozinho

O mecanismo de morte celular

Para ilustrar o mecanismo subjacente da quimioterapia desencadeada por NIR de IR780-TiS ₂ / RV, analisamos o tipo de morte celular, o potencial de membrana mitocondrial (Ψm) e os níveis de expressão das principais proteínas relacionadas à apoptose. Em primeiro lugar, o FCM foi usado para detectar o tipo de morte celular usando coloração com Anexina V-FITC / PI (Fig. 5a). Na mesma concentração de RV, RV livre, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV + NIR podem induzir apoptose, principalmente devido à presença de RV. Na verdade, foi relatado que o RV tem a capacidade de induzir apoptose. Destes tratamentos, IR780-TiS ₂ / RV + NIR apresentou a maior taxa de apoptose de 90,8%. As vias de sinalização de apoptose foram investigadas a seguir. Uma diminuição de Ψm foi relatada como o evento chave na via apoptótica mitocondrial (intrínseca) [40]. Na mesma concentração de RV, IR780-TiS ₂ / RV + NIR diminuiu Ψm em cerca de 85%, o que foi mais significativo do que uma diminuição de Ψm induzida por IR780-TiS ₂ , TiS ₂ / VD com ou sem NIR e VD livre (Fig. 5b). Este experimento indica que IR780-TiS ₂ / RV + NIR induziu morte celular que foi mediada pela via apoptótica mitocondrial (intrínseca) [41]. Em seguida, a expressão de proteínas críticas para a apoptose, especificamente citocromo c (citocromo c), caspase 9 e caspase 3, foi detectada por meio de um ensaio de Western blot. As células tratadas com IR780-TiS ₂ / RV + NIR expressou mais citocitose citosólica do que aqueles tratados com RV, IR780-TiS ₂ / RV ou IR780-TiS ₂ / RV (Fig. 5c). A translocação de cito c é o iniciador mais importante da cascata das caspases [42,43,44]. Consequentemente, a expressão da caspase 9 clivada e da caspase 3 clivada foi consideravelmente aumentada no IR780-TiS ₂ / RV + células tratadas com NIR. Juntos, esses dados sugerem claramente que a apoptose foi mediada pela via mitocondrial (intrínseca).

a Apoptose celular de células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV + NIR por FCM. b A mudança no potencial de membrana mitocondrial de células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV com ou sem irradiação NIR por FCM. c Expressão de proteínas relacionadas à apoptose em células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV + NIR. O citocromo c, a caspase-3 clivada e a caspase-9 clivada foram testados por Western blot. ** P <0,01, em comparação com IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV + NIR e IR780-TiS ₂ grupos

In Vivo Quimioterapia de tumor desencadeada por NIR

Para avaliar a eficácia da quimioterapia desencadeada por NIR in vivo, camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados com solução salina, solução salina + NIR, RV, IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV + NIR e IR780-TiS ₂ / RV + NIR. O tamanho do tumor no IR780-TiS ₂ O grupo / RV + NIR diminuiu significativamente, e o tumor quase desapareceu após 30 dias de tratamento, enquanto nos grupos restantes, o volume do tumor mostrou uma tendência de aumento (Fig. 6a). Durante o tratamento, não houve diferença significativa no peso corporal entre os grupos (Fig. 6b). Finalmente, a imagem de H&E não revelou toxicidade ou anormalidade nos tecidos perceptível em todos os grupos testados (Fig. 6c). Estes resultados demonstram que o IR780-TiS ₂ / O nanocompósito de RV tem uma excelente eficácia antitumoral desencadeada por NIR e uma baixa toxicidade sistêmica. Além disso, a biodistribuição do IR780-TiS ₂ / RV foi avaliada in vivo. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S4, as nanopartículas foram principalmente inseridas no sistema do fígado e talvez metabolizadas pelo sistema [45].

a O perfil de crescimento de tumores CT26 xenoenxertados após injeção intravenosa de solução salina (controle), RV, TiS ₂ / RV e IR780-TiS ₂ / RV com ou sem irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W / cm ² ) b Peso corporal de camundongos com tumor após vários tratamentos. c Imagens de H&E dos principais órgãos de todos os camundongos tratados após 30 dias de tratamento. ** P <0,01, em comparação com solução salina, solução salina + NIR, RV, TiS ₂ / RV + NIR e IR780-TiS ₂ / Grupos RV

Conclusão

Em resumo, desenvolvemos uma nanoplataforma direcionada para mitocôndrias e carregada com RV baseada em TiS ₂ nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.