Nanoflocos de TiS2 Direcionados a Mitocôndrias Entregam Resveratrol para Quimioterapia de Tumor Desencadeada por Fototermia

Resumo

Uma entrega de fármacos anticancerígenos direcionada a organelas subcelulares é uma estratégia promissora para maximizar efeitos anticancerígenos e minimizar efeitos adversos. Aqui, preparamos uma nanoplataforma de entrega de fármaco direcionada a mitocôndrias baseada em iodeto de IR780 (IR780) e nanoflocos de dissulfeto de titânio (TiS₂). Devido à grande área superficial específica dos nanoflocos de TiS₂, a nanoplataforma pôde carregar altamente o fármaco anticancerígeno resveratrol (RV). O nanocomósito preparado (IR780-TiS₂/RV) foi usado para uma quimioterapia de tumor eficaz desencadeada por fototermia. IR780-TiS₂/RV mostrou estabilidade e biocompatibilidade satisfatórias, e a razão de carregamento de RV e IR780 foi de cerca de 112% e 56%, respectivamente. Sob irradiação de infravermelho próximo (NIR), o calor gerado por IR780-TiS₂/RV pôde desencadear a liberação de RV. Devido à conjugação com o IR780 específico de mitocôndrias, IR780-TiS₂/RV pôde alvejar e acumular em mitocôndrias e liberar RV quando desencadeado por NIR para diminuir o potencial de membrana mitocondrial, induzir rapidamente a upregulação de fatores apoptóticos intrínsecos chave como citocromo c, e iniciar a cascata de caspase, alcançando assim o efeito quimioterapêutico. O nanocomósito IR780-TiS₂/RV foi demonstrado ter alta eficácia anti-tumor in vitro e in vivo, bem como nenhuma toxicidade tecidual notável. Acreditamos que nosso estudo demonstra que a nanoplataforma IR780-TiS₂/RV desencadeada por NIR poderia ser um agente quimioterapêutico promissor na prática clínica.

Introdução

O câncer continua sendo uma doença ameaçadora à vida e responde por altas taxas de mortalidade mundial [1]. Cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapia hormonal ainda são os principais métodos terapêuticos usados na prática clínica [2, 3]. Destes métodos, a quimioterapia é uma opção de tratamento amplamente aceita por clínicos e pacientes devido à sua eficácia relativamente alta [4, 5]. A quimioterapia está associada a alguns problemas sérios, por exemplo, resistência a fármacos, recorrência tumoral e não-especificidade [5,6,7]. Portanto, desenvolver novos agentes e estratégias quimioterapêuticas para superar esses obstáculos é de grande urgência [8]. Nos últimos anos, carregar um fármaco anticancerígeno em um carreador funcionalizado que possa simultaneamente alcançar entrega direcionada e liberação controlada do fármaco tornou-se uma abordagem popular para maximizar o efeito terapêutico e diminuir efeitos colaterais [9,10,11]. Uma grande área específica que possa proporcionar melhor razão de carregamento de fármaco é essencial para um excelente carreador de fármaco [12].

Além disso, para melhorar a especificidade do fármaco, o carreador é geralmente modificado com uma molécula de direcionamento celular, como ácido fólico direcionado a receptor de superfície celular e glutationa [13,14,15,16,17]. Como muitos fármacos quimioterapêuticos atuam em organelas subcelulares específicas, projetar um sistema de entrega específico de organela poderia aumentar notavelmente o efeito terapêutico e reduzir efeitos adversos [18,19,20]. Consequentemente, a seleção do local alvo dentro das células tumorais é vital para o sistema de entrega de fármaco. Mitocôndrias não são apenas uma "fábrica de energia" das células, mas também um alvo chave de fármacos quimioterapêuticos que visam as mitocôndrias para iniciar a via apoptótica intrínseca [21,22,23]. Portanto, desenvolver um sistema de entrega de fármaco anticancerígeno direcionado a mitocôndrias poderia ser vital para quimioterapia de câncer mais eficaz. Até agora, vários tipos de sistemas de entrega de fármaco foram projetados, como sílica mesoporosa, materiais baseados em carbono e proteínas [17, 24,25,26]. Embora esses carreadores tenham sido relatados como eficientes para entrega de fármaco e terapia de tumor, novos sistemas de entrega de alta eficiência ainda são altamente desejados.

Neste estudo, construímos uma nanoplataforma de entrega de fármaco direcionada a mitocôndrias e desencadeada por NIR baseada em nanoflocos bidimensionais de dissulfeto de titânio (TiS₂) para quimioterapia de tumor controlada e direcionada. TiS₂ é um membro de dicalcogenetos de metais de transição, que têm grande área específica [27,28,29]. Após esfoliação por ultrassom assistido por proteína, a superfície de nanoflocos de TiS₂ é modificável por outras moléculas funcionais via interações covalentes ou não-covalentes. Além disso, a molécula específica de mitocôndrias tumorais IR780 (iodeto IR-780) foi escolhida para modificar os nanoflocos de TiS₂. IR780 confere aos nanoflocos capacidade de direcionamento a mitocôndrias, que ocorre através do transporte ativo mediado por polipeptídeo transportador de ânions orgânicos e da característica de cátion lipofílico [30, 31]. Foi relatado que IR780 como cátion lipofílico mostrou mais acúmulo nas mitocôndrias de células tumorais devido à alta magnitude do potencial de membrana mitocondrial em células tumorais que em células normais [32, 33]. Além disso, IR780 também é um agente fototérmico responsivo a infravermelho próximo. A nanoplataforma preparada, denominada IR780-TiS₂, foi confirmada como biocompatível e pôde carregar eficazmente o fármaco anticancerígeno resveratrol (RV) (IR780-TiS₂/RV) [24]. O IR780-TiS₂/RV possuía capacidade de direcionamento a mitocôndrias e efeito fototérmico. NIR foi aplicado como estímulo externo para desencadear a liberação local do fármaco sob irradiação NIR. Experimentos in vitro e in vivo mostraram que IR780-TiS₂/RV tem efeito quimioterapêutico altamente eficiente. Estudo adicional do mecanismo revelou que a morte celular induzida por IR780-TiS₂/RV foi via via apoptótica intrínseca mediada por mitocôndrias. Este sistema de entrega de fármaco direcionado a mitocôndrias (Esquema 1) poderia ser um agente quimioterapêutico potencial em futura aplicação clínica.

Esquema de preparação do IR780-TiS₂/RV, usado como sistema de entrega de fármaco desencadeado por NIR para quimioterapia de tumor mediada pela via apoptótica intrínseca

Materiais e Métodos

Materiais

Sigma-Aldrich forneceu iodeto IR-780 (IR780), pó de TiS₂, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (St. Louis, MO, EUA). Albumina sérica bovina (BSA ≥ 98,0%) foi adquirida da BioSharp Co., Ltd. (Coreia). Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) foi obtido da Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japão). Reagentes de cultura celular incluindo meio DMEM e soro fetal bovino (FBS) foram fornecidos pela Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich (Xangai, China).

Síntese de IR780-TiS₂/RV

A primeira etapa foi a preparação de nanoflocos de TiS₂ solúveis em água de acordo com relato anterior [34]. Em detalhe, 5 mg de TiS₂ bruto foi misturado com 5 mL de água e agitado por 20 min. A suspensão aquosa de TiS₂ foi então adicionada a 5 mg de BSA e processada sob dissociação ultrassônica em banho de gelo usando ponta de sonicação de 500 W e 20 kHz (Sonics, VCX130, EUA) por 6 h. Posteriormente, a mistura preparada foi centrifugada a 12.000 rpm por 10 min, resultando em nanoflocos de TiS₂ no sobrenadante.

Segundo, nanoflocos de TiS₂ foram conjugados com IR780. Trietilamina (TEA) foi aplicada como agente ligante de ácido. Cinco miligramas de IR780 foram dissolvidos em 2 mL de DMSO e agitados a 60 °C por 8 h com adição de TEA. A suspensão da mistura foi dialisada em água destilada por 2 dias e então centrifugada a 9000 rpm por 8 min para remover o produto agregado. O sobrenadante foi coletado, resultando em IR780-TiS₂.

Por fim, RV foi carregado em IR780-TiS₂. IR780-TiS₂ (1 mg/ml) foi misturado com RV (2 mg/ml, dissolvido em DMSO), que foi levemente agitado durante a noite à temperatura ambiente. Posteriormente, DMSO e RV livre foram eliminados via diálise em água destilada durante a noite para dar IR780-TiS₂/RV. Baseado na literatura, a razão de carregamento de RV detectada por espectrofotômetro UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Japão) e calculada de acordo com a seguinte equação:

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{loading}\ \mathrm{ratio}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

onde A_a (mg), A_b (mg), e A_c (mg) representam o RV inicial, RV não ligado, e o IR780-TiS₂, respectivamente.

Espectrômetro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) Bruker TENSOR 27 (Bruker Optics Ltd., Coventry, Reino Unido) foi usado para detectar a estrutura química de TiS₂, IR780-TiS₂ e R780-TiS₂/RV. Análise Brunauer-Emmett-Teller (BET) foi realizada para determinar a área superficial específica das amostras, calculada a partir do resultado de adsorção de N₂ via analisador de área superficial (Quantachrome ChemBET-3000) baseado na equação BET.

Linhagem Celular e Cultura Celular

Células de câncer de cólon de camundongo CT26 foram obtidas do Banco de Células de Coleção de Tipos de Cultura da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio DMEM completo (10% FBS + 90% DMEM) em incubadora umidificada com 5% CO₂ a 37 °C.

Localização In Vitro de IR780-TiS₂/RV

FITC foi usado para marcar IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV. Em resumo, FITC foi dissolvido em solução de etanol (2,0 mg/mL) e misturado com solução aquosa de IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV (1,0 mg/mL) sob agitação de 4 h em ambiente escuro à temperatura ambiente. A mistura foi dialisada em água destilada durante a noite para remover FITC e etanol redundantes, resultando em solução de IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV marcada com FITC. Para confirmar a co-localização mitocondrial de nanopartículas in vitro, as células tratadas com IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV marcados com FITC por 5 h e coradas por corante mitocondrial específico MitoTracker. Posteriormente, a internalização celular de IR780-TiS₂/RV ou TiS₂/RV foi observada usando um CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Em resumo, células CT26 foram incubadas com TiS₂/RV e IR780-TiS₂/RV marcados com FITC (com a mesma concentração de FITC) por 5 h. E então, as células foram tratadas com soluções MitoTracker Red FM (100 nM) a 37 °C por 30 min. Após lavagem com PBS por três vezes, as células foram observadas por um CLSM. Software ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência das células.

Estudo de Quimioterapia de Tumor Desencadeada por NIR In Vitro e Apoptose

4 × 10³ células/poço CT26 em placas de cultura de 96 poços foram tratadas com RV livre, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV e TiS₂/RV com diferentes concentrações de RV por 5 h e então irradiadas com ou sem NIR por 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). Após incubação adicional de 24 h, a viabilidade das células tratadas foi analisada por ensaio CCK-8. As células tratadas também foram coradas por Rodamina123 (Sigma) e analisadas por FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, EUA). Detecção de apoptose celular também foi realizada por análise de FCM usando kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems, Viena, Áustria) como descrito anteriormente.

Western Blot

Células CT26 foram tratadas com PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV + NIR (RV equivalente, 30 μg/mL; IR780 equivalente, 0,5 μg/mL) para incubação de 5 h. Após incubação adicional de 24 h, as células foram coletadas respectivamente para Western blot, baseado no protocolo relatado anteriormente [23]. Brevemente, as células foram lisadas e inibidas por protease e Triton X-100. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio foi usada para recuperar e separar proteínas que foram então transferidas para uma membrana PVDF e bloqueadas usando 5% leite desnatado. Posteriormente, anticorpos primários diluídos foram incubados a 4 °C por 12 h, incluindo citocromo c (1/1000, Boster, Wuhan, China), caspase-3 clivada (1/1000, CST), caspase-9 clivada (1/1000, CST), e actina (1/1000, Camundongo, Boster, Wuhan, China) e então incubados com anticorpo secundário. Finalmente, reagente ECL foi usado para detectar as proteínas.

Modelo Animal

Para estabelecer modelo de tumor subcutâneo CT26, 1 × 10⁷ células CT26 (100 μL, em PBS) foram injetadas subcutaneamente no dorso de camundongos nude Balb/c. Volume do tumor = comprimento × largura²/2. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Central de Zhumadian (Henan, China).

Biodistribuição In Vivo

Biodistribuição do IR780-TiS₂/RV em camundongos nude portadores de tumor foi detectada a 24 h pós-injeção intravenosa na cauda com IR780-TiS₂/RV (150 μL, 6 mg/kg). Os principais órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão, rim e tumor foram pesados e digeridos por solução de água régia. O conteúdo de elemento Ti nestes tecidos foi quantificado por ICP-OES.

Quimioterapia de Tumor Desencadeada por NIR In Vivo

Camundongos portadores de tumor CT26 foram aleatoriamente separados em seis grupos (n = 6), incluindo salina, salina +NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV + NIR (RV equivalente, 1 mg/kg; IR780 equivalente, 0,5 mg/kg). A condição de irradiação NIR é 808 nm, 0,3 W/cm², e 3 min. Durante 30 dias de tratamento, volumes de tumor e pesos dos camundongos foram registrados a cada 3 dias. Após o tratamento, os órgãos incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim em vários grupos foram fixados e corados por H&E.

Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. Teste t de Student foi usado para examinar diferenças significativas entre dois grupos. P < 0,05 foi considerado significativo e P < 0,01 foi considerado muito significativo.

Resultados e Discussão

Preparação e Caracterização de IR780-TiS₂/RV

Para preparar IR780-TiS₂/RV, primeiramente, nanoflocos de TiS₂ biocompatíveis foram preparados através de um método de esfoliação assistido por albumina sérica bovina (BSA) e ultrassom como relatado anteriormente [34, 35]. Em seguida, IR780-TiS₂ foi sintetizado em uma reação de substituição entre um átomo de cloro de IR780 e grupos amino de BSA absorvidos nos nanoflocos de TiS₂ usando um agente ligante de ácido TEA. Por fim, a nanoplataforma IR780-TiS₂ carregou o fármaco anticancerígeno RV via absorção física. O diagrama esquemático de IR780-TiS₂/RV é mostrado no Esquema 1. Arquivo Adicional 1: Figura S1 mostra a imagem de MET da TiS₂ esfoliada assistida por proteína, que exibia estrutura de nanofloco. O padrão de DRX dos nanoflocos de TiS₂ também foi detectado, indicando boa cristalinidade dos nanoflocos de TiS₂ preparados, consistente com observações de MET (Arquivo Adicional 1: Figura S2). Após funcionalização, o nanocomósito IR780-TiS₂/RV tinha morfologia em flocos com espaçamento de rede de 0,25 nm como mostrado por microscopia eletrônica de transmissão (Figs. 1a, b) e diâmetro médio de cerca de 123,6 nm e potencial zeta de −37,2 mV como detectado por Nanosizer (Malvern Instruments) (Fig. 1c, d). Após armazenamento de 2 semanas em água, FBS ou salina, o tamanho médio de IR780-TiS₂/RV permaneceu constante em aproximadamente 123 nm (Fig. 1e) indicando a estabilidade de IR780-TiS₂/RV, possivelmente devido à adesão de BSA na superfície dos nanoflocos de TiS₂. A Figura 1f mostra os espectros de absorbância de IR780 livre, RV livre, nanoflocos de TiS₂ e IR780-TiS₂/RV. O espectro de absorção de IR780-TiS₂/RV mostrou os picos de IR780 livre e RV livre, indicando que tanto IR780 quanto RV foram conjugados com sucesso com os nanoflocos de TiS₂. A razão de carregamento de RV de IR780-TiS₂ foi de cerca de 112% (W/W), alcançada através de interações não-covalentes (ex., empilhamento π–π e interações hidrofóbicas). Além disso, segundo o resultado BET, as áreas superficiais foram calculadas como 15,2 m²/g e 122,1 m²/g para TiS₂ bruto e nanoflocos de TiS₂, respectivamente. Os nanoflocos de TiS₂ esfoliados mostram área superficial BET muito maior que a do TiS₂ bruto, que fornece grande área ativa para carregamento de fármaco. O carregamento foi alto provavelmente devido à grande área superficial específica e à adesão de BSA aos nanoflocos IR780-TiS₂ [23]. Para confirmar ainda mais que RV e IR780 foram carregados nos nanoflocos de TiS₂, os espectros FTIR de nanoflocos de TiS₂, IR780-TiS₂ e IR780-TiS₂/RV foram medidos. No Arquivo Adicional 1: Figura S6, todos os picos característicos de nanoflocos de TiS₂ apareceram nos espectros FTIR de IR780-TiS₂/RV. Além disso, três novos picos apareceram (~3191 cm⁻¹, ~1510 cm⁻¹, 1230 cm⁻¹) no espectro de IR780-TiS₂/RV, indicando a existência de RV e IR780 [36, 37].

a Imagem de MET de IR780-TiS₂/RV. b Imagem de MET de alta resolução de IR780-TiS₂/RV. c Distribuição de tamanho e d distribuição de potencial zeta de IR780-TiS₂/RV. e Mudança de tamanho hidrodinâmico de partícula de IR780-TiS₂/RV em água, FBS e salina por 2 semanas. f Espectros de absorção de RV, IR780, nanoflocos de TiS₂ e IR780-TiS₂/RV

Após irradiação NIR de baixa potência por 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²), a temperatura da solução IR780-TiS₂/RV aumentou proporcionalmente à concentração de IR780-TiS₂/RV (0, 5, 10 μg/ml), e a solução de 10 μg/ml IR780-TiS₂/RV atingiu a temperatura mais alta de 47,6 °C (Fig. 2a). Adicionalmente, IR780-TiS₂/RV manteve seu efeito fototérmico inicial mesmo após cinco ciclos de irradiação NIR, enquanto IR780 livre mostrou efeito fototérmico diminuído (Fig. 2b). Estes resultados indicam que o nanocomósito IR780-TiS₂/RV tem grande fotostabilidade.

a Efeito fototérmico de IR780-TiS₂/RV sob irradiação NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) por 3 min. b Mudança de temperatura de IR780 e R780-TiS₂/RV após cinco ciclos de irradiações NIR (808 nm, 0,3 W/cm², 3 min). c Esquema de liberação de RV desencadeada por fototermia. d Cinética de liberação de RV de IR780-TiS₂/RV em tampão PBS (pH = 7,4 e 6,5) com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W/cm²). **P < 0,01, comparado com grupo pH = 7,4 e pH = 6,5

Em seguida, a razão de liberação de RV foi medida sob várias condições de pH e irradiação NIR (Fig. 2c, d). Após 24 h, a razão de liberação de RV foi 8,56% sob condições fisiológicas (pH 7,4), mas aumentou significativamente para 16,2% a pH 6,5, indicando que pode ser aumentada por condições fracamente ácidas. Além disso, a razão de liberação de RV aumentou novamente significativamente para 44,8% a pH 6,5 e irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). Estes resultados demonstram que a irradiação NIR pode ser um estímulo externo controlável para desencadear a liberação de RV de IR780-TiS₂/RV. Este efeito é provavelmente devido ao calor gerado por IR780-TiS₂ sob irradiação NIR enfraquecendo as interações de adsorção não-covalentes entre RV e a superfície de IR780-TiS₂ [35]. Adicionalmente, em ambiente ácido, o H+ poderia alterar a carga de superfície de TiS₂ que altera o equilíbrio hidrofílico/hidrofóbico das nanopartículas [38, 39].

Localização In Vitro de IR780-TiS₂/RV

Para investigar a captação celular e a distribuição intracelular de IR780-TiS₂/RV, as nanopartículas IR780-TiS₂/RV foram marcadas com FITC, e um CLSM foi usado para visualizar a fluorescência intracelular. Após incubação de 5 h, TiS₂/RV e IR780-TiS₂/RV mostraram intensidade de fluorescência similar no citoplasma (Fig. 3a, b), indicando que ambos nanocomósitos poderiam entrar nas células, provavelmente via endocitose. Contudo, o nanocomósito IR780-TiS₂/RV exibiu maior intensidade de fluorescência amarela e verde quando o sinal FITC foi fundido com marcação MitoTracker (Fig. 3a, c). Estes resultados indicam que IR780-TiS₂/RV pode alvejar mitocôndrias com alta eficiência. Adicionalmente, a distribuição de IR780-TiS₂/RV dentro do citoplasma foi confirmada usando MET, que mostrou nanopartículas retidas em algumas mitocôndrias (Fig. 3d). Juntos, estes resultados confirmam firmemente que IR780-TiS₂/RV alcança bom direcionamento mitocondrial, o que promove ainda mais acúmulo de fármaco mitocondrial, causando toxicidade celular imediata. O direcionamento mitocondrial foi provavelmente mediado tanto pelo transporte ativo mediado por polipeptídeo transportador de ânions orgânicos quanto pela característica de cátion lipofílico, que fez as nanopartículas acumular altamente nas mitocôndrias de células tumorais [30,31,32,33].

a Imagens de fluorescência de células CT26 incubadas com TiS₂/RV ou IR780-TiS₂/RV marcados com FITC por 5 h. Fluorescência verde é sinal FITC, e fluorescência vermelha é sinal MitoTracker. b Análise correspondente de intensidade média de fluorescência (MFI) de TiS₂/RV ou IR780-TiS₂/RV marcados com FITC em células na Fig. 3a. c Coeficiente de co-localização correspondente de TiS₂/RV ou IR780-TiS₂/RV marcados com FITC e mitocôndrias em células na Fig. 3a. M significa mitocôndrias. **P < 0,01, comparado com grupo TiS₂/RV sozinho

Quimioterapia de Tumor Desencadeada por NIR In Vitro

Primeiro, o efeito fototérmico foi avaliado in vitro. Após incubação de 5 h, IR780-TiS₂/RV mostrou aumento de temperatura de cerca de 17 °C, enquanto TiS₂/RV exibiu aumento de temperatura de cerca de 10 °C (Fig. 4a). O efeito fototérmico foi atribuído a IR780 e nanoflocos de TiS₂. Demonstrando biocompatibilidade como nanoplataforma para carregamento de fármaco, IR780-TiS₂ não exibiu citotoxicidade pronunciada abaixo da concentração de 300 μg/ml (Fig. 4b). Além disso, RV com ou sem irradiação NIR teve efeito de morte celular dependente de concentração similar (Fig. 4c). Na mesma concentração de RV, RV alcançou o melhor efeito de morte celular quando carregado por IR780-TiS₂ e irradiado por NIR comparado a todas as outras condições, i.e., RV livre, IR780-TiS₂ livre, e RV carregado por TiS₂ (Fig. 4d). Curiosamente, a plataforma IR780-TiS₂ não carregada não exibiu efeito anticancerígeno notável quando exposta a irradiação NIR comparado àquela sem irradiação NIR (Fig. 4d), indicando que o calor gerado por IR780-TiS₂ sob o estímulo de irradiação NIR foi principalmente usado para desencadear a liberação do fármaco que então matou as células. Estes resultados sugerem que IR780-TiS₂/RV pode liberar RV nas mitocôndrias quando desencadeado por irradiação NIR e, assim, aumentar notavelmente a concentração local de RV dentro das mitocôndrias e alcançar maior efeito inibidor de tumor.

a Curvas de mudança de temperatura de PBS (controle), TiS₂/RV, ou IR780-TiS₂/RV-tratadas sob irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). b Citotoxicidade in vitro contra células CT26 tratadas com diferentes concentrações de IR780-TiS₂. c Viabilidade celular de células tratadas com RV com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) por 3 min. d Viabilidade celular de células tratadas com IR780-TiS₂, RV, TiS₂/RV, ou IR780-TiS₂/RV com ou sem irradiação NIR (808 nm, 0,3 W/cm²) por 3 min. **P < 0,01, comparado com grupo IR780-TiS₂/RV sem NIR sozinho

Mecanismo de Morte Celular

Para ilustrar o mecanismo subjacente da quimioterapia desencadeada por NIR de IR780-TiS₂/RV, analisamos o tipo de morte celular, potencial de membrana mitocondrial (Ψm), e níveis de expressão de proteínas-chave relacionadas à apoptose. Primeiro, FCM foi usado para detectar o tipo de morte celular usando coloração Annexin V-FITC/PI (Fig. 5a). Na mesma concentração de RV, RV livre, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV + NIR poderiam todos induzir apoptose, principalmente devido à presença de RV. De fato, RV tem sido relatado como tendo capacidade de induzir apoptose. Destes tratamentos, IR780-TiS₂/RV + NIR mostrou a maior taxa de apoptose de 90,8%. Vias de sinalização apoptóticas foram investigadas a seguir. Uma diminuição de Ψm tem sido relatada como evento chave na via apoptótica mitocondrial (intrínseca) [40]. Na mesma concentração de RV, IR780-TiS₂/RV + NIR diminuiu Ψm em cerca de 85%, o que foi mais significativo que a diminuição de Ψm induzida por IR780-TiS₂, TiS₂/RV com ou sem NIR, e RV livre (Fig. 5b). Este experimento indica que IR780-TiS₂/RV + NIR induziu morte celular mediada via via apoptótica mitocondrial (intrínseca) [41]. Em seguida, a expressão de proteínas críticas para apoptose, especificamente citocromo c (cyto c), caspase 9, e caspase 3, foi detectada via ensaio de Western blot. Células tratadas com IR780-TiS₂/RV + NIR expressaram mais cyto c citosólico que aquelas tratadas com RV, IR780-TiS₂/RV, ou IR780-TiS₂/RV (Fig. 5c). A translocação de cyto c é o iniciador mais importante da cascata de caspase [42,43,44]. Consequentemente, a expressão de caspase 9 clivada e caspase 3 clivada foi consideravelmente aumentada nas células tratadas com IR780-TiS₂/RV + NIR. Juntos, estes dados sugerem claramente que a apoptose foi mediada pela via mitocondrial (intrínseca).

a Apoptose celular de células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV + NIR por FCM. b Mudança no potencial de membrana mitocondrial de células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV com ou sem irradiação NIR por FCM. c Expressão de proteínas relacionadas à apoptose em células CT26 tratadas com PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV + NIR. Citocromo c, caspase-3 clivada, e caspase-9 clivada foram testados por Western blot. **P < 0,01, comparado com grupos IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR, e IR780-TiS₂

Quimioterapia de Tumor Desencadeada por NIR In Vivo

Para avaliar a eficácia da quimioterapia desencadeada por NIR in vivo, camundongos portadores de tumor CT26 foram tratados com salina, salina + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR, e IR780-TiS₂/RV + NIR. O tamanho do tumor no grupo IR780-TiS₂/RV + NIR diminuiu significativamente, e o tumor quase desapareceu após 30 dias de tratamento, enquanto nos grupos restantes, o volume do tumor mostrou tendência de aumento (Fig. 6a). Durante o tratamento, não houve diferença significativa no peso corporal entre os grupos (Fig. 6b). Finalmente, imagem H&E revelou nenhuma toxicidade tecidual notável ou anormalidade em todos os grupos testados (Fig. 6c). Estes resultados demonstram que o nanocomósito IR780-TiS₂/RV tem eficácia anti-tumor NIR-desencadeada excepcional e baixa toxicidade sistêmica. Além disso, a biodistribuição do IR780-TiS₂/RV foi avaliada in vivo. Como mostrado no Arquivo Adicional 1: Figura S4, as nanopartículas entraram principalmente no sistema hepático e talvez metabolizadas pelo sistema [45].

a Perfil de crescimento de tumores xenotransplantados CT26 após injeção intravenosa de salina (controle), RV, TiS₂/RV, e IR780-TiS₂/RV com ou sem irradiação NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). b Peso corporal de camundongos portadores de tumor após vários tratamentos. c Imagens H&E de órgãos principais de todos camundongos tratados após 30 dias de tratamento. **P < 0,01, comparado com salina, salina + NIR, RV, TiS₂/RV + NIR, e grupos IR780-TiS₂/RV

Conclusão

Em resumo, desenvolvemos uma nanoplataforma direcionada a mitocôndrias e carregada com RV baseada em nanoflocos de TiS₂ para liberação de fármaco desencadeada por NIR e quimioterapia de tumor aprimorada. O IR780-TiS₂/RV preparado com morfologia em flocos mostrou boa estabilidade e biocompatibilidade. Devido à capacidade de direcionamento mitocondrial de IR780, IR780-TiS₂/RV pôde seletivamente acumular em mitocôndrias de células tumorais e onde pôde liberar RV quando desencadeado pela irradiação NIR. O RV liberado facilitou a diminuição do potencial de membrana mitocondrial, liberação de cyto c, e subsequentemente iniciou uma cascata de reações de caspase para promover apoptose de células tumorais via via de sinalização mitocondrial. Resultados in vitro e in vivo demonstraram que IR780-TiS₂/RV exibiu quimioterapia de tumor NIR-desencadeada eficaz sem toxicidade tecidual significativa. Estes resultados sugerem que IR780-TiS₂/RV poderia ser um agente quimioterapêutico promissor na prática clínica.

Disponibilidade de Dados e Materiais

As conclusões feitas neste manuscrito são baseadas nos dados que são todos apresentados e mostrados neste artigo.

Abreviações

IR780:

Iodeto IR-780

BET:

Brunauer-Emmett-Teller

BSA:

Albumina sérica bovina

CCK-8:

Kit de Contagem Celular-8

CLSM:

Microscopia confocal a laser

cyto c:

Citocromo c

DMEM:

Meio modificado de Dulbecco para Eagle

DMSO:

Dimetilsulfóxido

FBS:

Soro fetal bovino

FCM:

Citometria de fluxo

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

FTIR:

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

NIR:

Infravermelho próximo

PBS:

Salina fosfatada tamponada

RV:

Resveratrol

TEA:

Trietilamina

TiS₂:

Dissulfeto de titânio