O estudo da terapia de ultrassom focalizada de alta intensidade aprimorada por microbolhas sonodinâmicas N2O

Resumo

O ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU) é um método não invasivo representativo da terapia do câncer, mas sua baixa eficácia terapêutica e risco de danos ao tecido normal circundante impedem seu desenvolvimento clínico e aplicação. A terapia sonodinâmica (SDT) mata as células tumorais por meio de moléculas reativas de oxigênio produzidas por sonossensibilizadores durante o tratamento com ultrassom. SDT pode aumentar a eficácia do HIFU como microbolhas. Neste trabalho, desenvolvemos a nanoescala N ₂ O microbolhas (N ₂ O-mbs) por um método de oscilação mecânica aprimorado. Essas microbolhas apresentaram boa biocompatibilidade e ligação às células tumorais. A sonossensibilidade do N ₂ O-mbs foi detectado tanto extracelularmente quanto intracelularmente por meio da detecção da geração de espécies reativas de oxigênio. Os efeitos tóxicos dessas microbolhas sonodinâmicas em células tumorais e o efeito sinérgico no tratamento com HIFU foram avaliados. A apoptose significativa foi causada por espécies reativas de oxigênio produzidas por N ₂ O-mbs sob irradiação de ultrassom. N ₂ O-mbs combinado com HIFU aumentou a necrose de células tumorais e apoptose in vitro e o volume necrótico coagulativo e intensidade de eco na área alvo de fígado bovino ex vivo. Estas microbolhas sonodinâmicas também demonstraram inibir eficientemente o crescimento do tumor in vivo. N ₂ O-mbs tem um impacto significativo no tratamento e no efeito de ablação do HIFU devido às vantagens da microbolha e da sonossensibilidade extraordinária. Esta descoberta sugere que N ₂ O-mbs pode ser um novo agente auxiliar para ultrassom que pode ser usado para promover a ablação térmica de tumor HIFU.

Introdução

Os tumores malignos são uma das principais doenças que ameaçam a vida e a saúde humana [1]. O ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU) é uma nova técnica para a ablação local não invasiva de tumores. HIFU tem sido usado com sucesso no tratamento de tumores sólidos benignos e malignos no fígado, rim, pâncreas, próstata, mama, ossos e útero [2, 3]. No entanto, as limitações inerentes do HIFU, como a degradação da energia ultrassônica durante o tratamento, o enfraquecimento do acúmulo de energia na área-alvo e os danos ao tecido saudável não-alvo reduzem seu efeito terapêutico [4, 5]. O campo focal formado pela irradiação HIFU é pequeno, geralmente em magnitude milimétrica. Demora muito para remover tumores grandes. A extensão do tempo de irradiação do HIFU aumentará a temperatura corporal, chegando a atingir 39,2 ° C. Conforme a profundidade do tumor aumenta no corpo, a energia da ablação HIFU também precisa aumentar [6]. Isso aumenta o risco de danos físicos ao paciente e reduz a eficiência e a segurança do tratamento com HIFU. Portanto, os pesquisadores se comprometeram a encontrar maneiras de aumentar a eficiência terapêutica do HIFU nos últimos anos [7,8,9]. As microbolhas podem melhorar sinergicamente a eficácia terapêutica do HIFU [7, 10]. O gás na microbolha pertence ao material de alta impedância acústica. As microbolhas aumentam o espalhamento e reflexão da onda ultrassônica na área alvo quando o HIFU irradia a área do tecido tumoral [11,12]. As microbolhas aumentam a temperatura da área alvo do tumor e aumentam o efeito térmico do tratamento HIFU, aumentando o acúmulo de energia HIFU na área alvo [13]. Além disso, as microbolhas como um núcleo de cavitação exógena também reduzem o limiar de cavitação do tecido e aumentam o efeito de cavitação do HIFU conforme ele passa através da circulação sanguínea para o tecido tumoral [14]. Nos últimos anos, estudos indicaram que a terapia sonodinâmica (SDT) pode aumentar sinergicamente a eficácia do tratamento com HIFU [15, 16]. As interações entre os sonossensibilizadores e o ultrassom produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo oxigênio singlete e radicais hidroxila, que matam células tumorais e inibem o crescimento tumoral por apoptose e necrose [17]. SDT tem feito um grande progresso no tratamento de tumor não invasivo arquivado nos últimos anos. Permite a redução da dose do medicamento e do poder de irradiação HIFU em comparação com as monoterapias convencionais. A fim de aproveitar ao máximo as vantagens dos dois, este estudo combinou as microbolhas e o efeito sonodinâmico para melhorar ainda mais a eficácia do HIFU. Os sonossensibilizadores são uma parte importante do SDT [18, 19]. A maioria dos sonossensibilizadores tradicionais atualmente estudados são de fotossensibilizadores. N ₂ O é um fotossensibilizador [20, 21], que produz substâncias tóxicas sob condição de irradiação de luz ultravioleta. Neste estudo, a sonossensibilidade de N ₂ O também foi inicialmente explorado. Anteriormente, descobrimos que a aplicação de N ₂ O anestesia por inalação na operação HIFU agravou o grau de lesão do tecido, incluindo o aumento da espessura da congestão abdominal e da pele [22]. A utilização combinada de N ₂ O e HIFU tiveram um efeito sinérgico na lesão do tecido. Mas, que efeito biológico N ₂ O tem no tratamento HIFU não é claro. N ₂ O é um pequeno gás molecular relativamente estável, sem biotransformação e sem especificidade de tecido nas células. Pode ser amplamente utilizado em tecidos e não tem efeito tóxico no corpo [23, 24]. Portanto, é uma perspectiva atraente como sonossensibilizador. Neste estudo, microbolhas em nanoescala (N ₂ O-mbs) foram preparados usando N ₂ envolto em lipídios O e C ₃ F ₈ . A dosagem de N ₂ O foi reduzido e seu alcance de ação in vivo também foi efetivamente limitado à área do tecido tumoral. O efeito sonodinâmico de N ₂ O e seu efeito sinérgico na eficácia do HIFU foram examinados.

Materiais e métodos

Materiais

1,2-Dihexadecanoil-rac-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N - [metoxi (polietilenoglicol) -2000] (DSPE-mPEG2000) foram adquiridos na Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA). A glicerina e a agarose foram obtidas na Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). N ₂ O e C ₃ F ₈ foram adquiridos da Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4 ′, 6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI), 2 ′, 7′-diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA) , 3-amino, 4-aminometil-2 ', 7'-difluoresceína, diacetato (DAF-FM DA) e CCK-8 foram adquiridos na Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calceína-AM (CAM) e iodeto de propídio (PI) foram obtidos na Santa Cruz Biotechnology (TX, EUA). A anexina V-FITC / PI foi obtida da Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). O sensor de oxigênio singlet verde (SOSG) foi adquirido da Invitrogen (NY, EUA).

Preparação de N ₂ O-mbs e C ₃ F ₈ -mbs

N ₂ O-mbs foi preparado pelo filme rotativo combinado com o método de oscilação mecânica. Usamos DPPC e DSPE-PEG2000 como materiais de revestimento e N ₂ O como o núcleo. Resumidamente, 5 mg de DPPC, 2 mg de DSPE-PEG2000 e 10 mL de clorofórmio foram simultaneamente despejados em um frasco de fundo redondo, misturados e totalmente dissolvidos por ondas ultrassônicas. Em seguida, os filmes lipídicos foram formados em evaporador rotativo (60 min, 55 ° C, 100 r / min). Em seguida, 2 mL de glicerol a 10% foram adicionados para hidratar os filmes lipídicos e preparar uma suspensão. 500 μL dos quais foram adicionados a um tubo de cápsula. O tubo da cápsula foi tampado com uma tampa de borracha. O ar no tubo foi substituído por N ₂ O e C ₃ F ₈ por um dispositivo de deslocamento de gás. Em seguida, a suspensão foi mecanicamente oscilada por um misturador de cápsula de prata-mercúrio (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) por 150 s. Finalmente, a suspensão resultante foi submetida a centrifugação diferencial para obter o N ₂ alvo O-mbs, e foi centrifugado a 300 rpm por 5 min e, em seguida, centrifugado a 800 rpm por 5 min. N ₂ O-mbs foram ressuspensos em PBS e depois armazenados a 4 ° C para uso posterior.

O C ₃ F ₈ -mbs foram fabricados usando o mesmo método de oscilação mecânica, conforme descrito anteriormente [25]. Rotulado com DiI N ₂ O-mbs pode ser preparado adicionando DiI durante a formação do filme de rotação. Vale a pena mencionar que N ₂ O tem baixo peso molecular e é instável. O N ₂ O na microbolha transborda facilmente. Portanto, a meia-vida da microbolha é reduzida. C ₃ F ₈ é um gás macromolecular inerte amplamente utilizado no estudo de agentes de contraste de microbolhas ultrassônicas. C ₃ F ₈ pode aumentar a estabilidade das microbolhas. Portanto, neste estudo, N ₂ O e C ₃ F ₈ (2:1) foram misturados como o N ₂ O-mbs core para aumentar sua estabilidade.

Fabricação e detecção de desempenho de N ₂ O-mbs

A morfologia e distribuição de tamanho de N ₂ O-mbs foram observados sob microscopia óptica de campo claro. As concentrações de N ₂ O-mbs e C ₃ F ₈ -mbs foram calculados por globulímetro de acordo com as diretrizes de cálculo. O tamanho médio de partícula e o potencial zeta do N ₂ O-mbs foram determinados por um sistema de espalhamento de luz laser dinâmico (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). A estrutura e morfologia do N ₂ O-mbs foram caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tóquio, Japão). O N ₂ preparado O-mbs foram armazenados a 4 ° C. A fim de observar a estabilidade de N ₂ O-mbs, a morfologia e a concentração foram registradas no primeiro, segundo e terceiro dias. Ao mesmo tempo, o tamanho médio de partícula e o potencial zeta das microbolhas foram determinados.

Cultura de células e modelo animal

Células de câncer de mama humano (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) foram passadas no laboratório por menos de 3 meses após a ressuscitação. As células foram mantidas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ , usando DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 50 μg / L de estreptomicina e 50 μg / L de penicilina. Quando as células atingiram 80% de confluência, foram utilizadas para o experimento.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Animais da Universidade Médica de Chongqing. Um certo número de camundongos nus fêmeas (4-6 semanas de idade; peso de 15-20 g) foram adquiridos no Animal Experiment Center da Chongqing Medical University (Chongqing, China). Para o estabelecimento de tumor sólido, células MDA-MB-231 (1 × 10 ⁶ células / mL) suspensas em solução salina normal (100 μL) foram injetadas por via subcutânea no flanco direito posterior de cada camundongo. Todos os camundongos com tumor foram usados para experiências terapêuticas quando os volumes do tumor atingiram cerca de 150 mm ³ .

Avaliação da captação intracelular e biocompatibilidade de N ₂ O-mb

As células MDA-MB-231 na fase de crescimento foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 1 × 10 ⁵ células por frasco de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) por 24 h. Em seguida, 100 μL (1 × 10 ⁵ bolhas / mL) de N ₂ rotulado com DiI Adicionou-se solução de diluição de meio completo O-mbs para encher o prato confocal com meio. A placa foi selada com seladores de microplaca e armazenada invertida em uma incubadora, mantendo o N ₂ O-mbs em contato com as células. Após 2 h e 4 h de co-incubação, as células foram lavadas suavemente 3 vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min e coradas com DAPI por 20 min. Finalmente, o comportamento de segmentação de células de N ₂ O-mbs foi observado por CLSM (Nikon A1, Japão).

A citotoxicidade de N ₂ O-mbs foi avaliado por um ensaio CCK-8 padrão. As células MDA-MB-231 foram semeadas em uma placa de 96 poços (5 × 10 ⁴ células / poço) por 24 h. Em seguida, 100 μL de diferentes concentrações (1 × 10 ⁴ / mL, 1 × 10 ⁵ / mL e 1 × 10 ⁶ / mL) de N ₂ O-mb foram adicionados. Após 24 h de incubação, solução de CCK-8 (10 μL) foi adicionada a cada poço. Em seguida, as células MDA-MB-231 foram cultivadas a 37 ° C por mais 2 h. Finalmente, a absorbância de cada poço foi medida a 450 nm com um leitor de microplacas Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, EUA).

Dez ratos nus fêmeas saudáveis pesando aproximadamente 20 g foram divididos em dois grupos aleatoriamente. O N ₂ O-mbs ( n =5) o grupo recebeu injeção intravenosa de N ₂ O-mbs (200 μL, 1 × 10 ⁵ / mL) e o grupo de controle ( n =5) injetado com solução salina normal (200 μL). Após 21 dias, os principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) de todos os camundongos foram excisados e corados com hematoxilina-eosina (H&E).

Eficiência SDT in vitro de N ₂ O-mbs

O método para detecção de radicais de oxigênio foi baseado em um relatório anterior [26]. Resumidamente, 10 μL de SOSG (500 μM) foram misturados com 2 mL da solução de amostra. Os tratamentos foram agrupados da seguinte forma:grupo C (o grupo de controle em branco), foi adicionado PBS sozinho; N ₂ Grupo O-mbs, 100 μL de N ₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ / mL) em 2 mL de solução de PBS foi adicionado; C ₃ F ₈ grupo -mbs, 100 μL de C ₃ F ₈ -mbs (1 × 10 ⁵ / mL) em 2 mL de solução de PBS foi adicionado; Grupo LIFU, PBS foi irradiado por ultrassom (2 W / cm ² ; Instituto de Imagens de Ultrassom de Ciências Médicas de Chongqing, Chongqing, China) por 100 s; LIFU – N ₂ Grupo O-mbs, PBS com N ₂ adicionado O-mbs foi irradiado com ultrassom; LIFU – C ₃ F ₈ grupo -mbs, PBS com C ₃ adicionado F ₈ -mbs foi irradiado por ultrassom. Os parâmetros de tratamento do grupo experimental foram definidos como 2 W / cm ² e 100 s através da análise e comparação dos resultados experimentais e consulta da literatura [27, 28]. Os parâmetros de ultrassom empregados para fins de tratamento foram definidos da seguinte forma:frequência, 650 kHz; comprimento focal, 12,5 mm; modo de onda de pulso, ciclo de trabalho de 50%; e duração do pulso, 1 s. A geração de oxigênio singlete (¹ O ₂ ) foi determinada por espectrometria de fluorescência (Cary Eclipse, Agilent Technologies) medindo a intensidade de fluorescência ( λ excitação / λ emissão =504 nm / 525 nm). A seleção da intensidade e duração do ultrassom foi consistente com os experimentos com células in vitro.

Depois que a geração de espécies reativas extracelulares de oxigênio (ROS) foi detectada usando o ensaio SOSG, a produção de ROS intracelular foi detectada por um kit de ensaio ROS baseado em DCFH-DA. As células MDA-MB-231 foram semeadas a uma densidade de aproximadamente 1 × 10 ⁵ células por frasco CLSM. Em seguida, eles foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos:o grupo de controle (sem tratamento), o N ₂ Grupo somente O-mbs (100 μL, 1 × 10 ⁵ bolhas / mL), o C ₃ F ₈ -mbs apenas grupo (100 μL, 1 × 10 ⁵ bolhas / mL), o grupo somente LIFU (2 W / cm ² por 100 s), o LIFU – C ₃ F ₈ grupo -mbs, o LIFU – N ₂ Grupo O-mbs. Após incubação por 24 horas para permitir a fixação das células, cada grupo foi submetido à correspondente intervenção experimental descrita acima. Em seguida, a mesma quantidade de DCFH-DA (30 μM) foi adicionada à placa correspondente em cada grupo, e a placa foi incubada por 20 min no escuro. As células foram então lavadas suavemente 3 vezes com PBS para remover a sonda DCFH que não entrou na célula. Finalmente, a geração de ROS intracelulares foi determinada por CLSM. Para verificar ainda mais a eficiência SDT de N ₂ O-mbs, as células foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas por 24 h e distribuídas aleatoriamente em seis grupos, como descrito acima. Em seguida, os tratamentos correspondentes foram realizados em cada grupo. As células em cada grupo foram digeridas e preparadas em suspensões de células em concentrações apropriadas e colocadas em um prato CLSM. Finalmente, as células foram digitalizadas por CLSM após co-coloração com CAM e corantes PI para diferenciar células mortas (vermelhas) e vivas (verdes). A apoptose foi detectada por citometria de fluxo e coloração com Anexina V-FITC / PI. Após 1 h de tratamento, cada grupo de células foi centrifugado e as células foram coletadas. Após a co-coloração com Anexina V-FITC / PI, a detecção por citometria de fluxo (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) foi realizada.

Efeito sonodinâmico in vitro de N ₂ O-mbs melhora a eficácia do tratamento HIFU

Um sistema HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) composto de uma unidade de ultrassom diagnóstico, uma unidade de ultrassom terapêutico e um sistema de processamento central foi usado conforme descrito anteriormente [29]. Os parâmetros HIFU empregados para fins de tratamento foram definidos da seguinte forma:frequência de trabalho, 0,94 MHz; comprimento focal, 140 mm; diâmetro, 220 mm; e frequência do transdutor de diagnóstico em tempo real, 3,5 MH. Os transdutores integrados foram submersos em água desgaseificada. Para avaliar o efeito de aprimoramento de N ₂ O-mbs no tratamento com HIFU, as células MDA-MB-231 foram centrifugadas, 5 × 10 ⁵ / mL, e distribuídos em quatro grupos:o grupo de controle (sem tratamento), o grupo somente HIFU (125 W, 5 s), o HIFU – N ₂ Grupo O-mbs apenas, o HIFU – C ₃ F ₈ -mbs apenas grupo. Em seguida, os diferentes tratamentos respectivos foram realizados para cada grupo. As células tratadas foram centrifugadas e lavadas com PBS, duplamente coradas com Anexina V-FITC / PI e colhidas para citometria de fluxo. A sonda de óxido nítrico (NO) DAF-FM foi usada para detectar NO no sobrenadante de cada grupo de tratamento. Todos os experimentos foram realizados 3 vezes. TEM foi usado para identificar a morfologia ultraestrutural das células tratadas. Após cada tratamento, as células tratadas foram imediatamente fixadas com 2% OsO ₄ , desidratado em uma série graduada de álcool e totalmente incorporado em Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Cortes ultrafinos (100 nm) foram preparados, corados com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinados em microscópio eletrônico.

Efeito Sonodinâmico Ex Vivo e In Vivo de N ₂ O-mbs melhora a eficácia de ablação de HIFU

Tecidos frescos de fígado bovino foram adquiridos em matadouros locais e usados em até 12 horas após o abate. Fígado bovino ex vivo fresco com pouco tecido conjuntivo e menos vasos sanguíneos foi cortado em seções de 10 cm x 5 cm x 5 cm e desgaseificado por 1 h a 37 ° C. Os fígados bovinos foram divididos em três grupos:C ₃ F ₈ grupo -mbs, N ₂ Grupo O-mbs e grupo PBS. Primeiro, o fígado bovino recém-isolado foi colocado em um recipiente contendo água desarejada. Então, 200 μL (1 × 10 ⁵ bolhas / mL) de microbolhas em PBS foi injetado diretamente no fígado bovino da maneira mostrada na Fig. 6a. Sob a orientação de um transdutor de ultrassom diagnóstico, o ponto focal do HIFU foi posicionado no local da injeção. Em seguida, o transdutor terapêutico foi usado para realizar 5 s de ablação em diferentes potências (100 W, 125 W, 150 W) no local da injeção de fígado bovino. Finalmente, o volume necrótico coagulativo da área alvo no tecido hepático bovino foi calculado de acordo com o comprimento, largura e profundidade máximos (mm) medidos pela seguinte equação: V (mm ³ ) =π / 6 × comprimento × largura × profundidade. Além disso, o valor de cinza da área-alvo antes e depois da ablação HIFU em cada grupo foi registrado nas imagens de ultrassom de diagnóstico.

Vinte camundongos com tumor foram divididos aleatoriamente em quatro grupos ( n =5 por grupo), incluindo um grupo de controle (sem qualquer tratamento), um grupo HIFU – PBS, um HIFU – C ₃ F ₈ grupo -mbs e um HIFU – N ₂ Grupo O-mbs. A ablação do tumor com HIFU (125 W, 5 s) foi aplicada depois que os camundongos receberam uma injeção intravenosa de 200 μL de C ₃ F ₈ grupo -mbs, N ₂ O-mbs e PBS. O procedimento de ablação HIFU de tumores sólidos foi semelhante ao do fígado bovino isolado ex vivo. Primeiramente, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital a 1% (8 mL / kg). O local do tumor do camundongo foi inoculado em um recipiente contendo água desarejada. Sob a orientação de um transdutor de ultrassom diagnóstico, o ponto focal HIFU foi posicionado no tecido tumoral. Os pesos corporais dos camundongos e o volume do tumor foram registrados com um intervalo de 3 dias. Finalmente, todos os camundongos foram mortos 21 dias após o tratamento e os tecidos tumorais foram dissecados dos camundongos e, em seguida, enviados para H&E, coloração com antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), desoxinucleotidil transferase terminal rotulagem dUTP nick end (TUNEL).

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados e analisados com GraphPad Prism (versão 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Os dados são expressos como média ± DP. Cada experiência foi repetida pelo menos 3 vezes. As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni (comparando todos os grupos) ou pós-teste de Dunnett (comparando todos os grupos com um grupo de controle). Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de N ₂ O-mbs

A preparação de N ₂ O-mbs pelo método de oscilação mecânica modificado resulta em uma suspensão branca leitosa altamente estável (Fig. 1a). O N ₂ O-mbs não mudou significativamente no tamanho de partícula e morfologia após 72 h de armazenamento em temperatura ambiente. Sob o microscópio óptico, N ₂ O-mbs foram observados com tamanho uniforme, boa dispersão e alta estabilidade (Fig. 1b). A concentração de N ₂ O-mbs era 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ bolhas / mL. Conforme mostrado nas imagens TEM (Fig. 1c), o tamanho de N ₂ O-mbs foi distribuído uniformemente e o tamanho médio foi de aproximadamente 450 nm. O N ₂ Os resultados de dispersão de luz dinâmica O-mb revelaram diâmetros hidrodinâmicos de 458,1 ± 17,26 nm (índice de polidispersidade =0,368; Fig. 1d), o que foi consistente com os resultados de TEM. O potencial do N ₂ O-mbs era - 16,2 ± 0,35 mV (Fig. 1e) (Arquivo adicional 1:Figura S1).

a Fotografias de N ₂ O-mbs disperso em água desionizada; b imagem de N ₂ O-mbs sob microscopia óptica de campo claro; c imagem do microscópio eletrônico de transmissão de N ₂ O-mbs; d distribuição de tamanho de N ₂ O-mbs; e potencial zeta aparente de N ₂ O-mbs

Captação intracelular e biocompatibilidade de N ₂ O-mbs

A citotoxicidade de N ₂ O-mbs contra células in vitro foi investigado pelo método CCK-8. Definimos a viabilidade celular do grupo controle como 100%. Após 24 horas de incubação, os resultados de viabilidade celular não mostraram citotoxicidade significativa para as células MDA-MB-231. Mesmo com N ₂ alto Concentrações de O-mb, a viabilidade celular permaneceu maior do que 95% (Fig. 2a). A citotoxicidade de N ₂ O-mbs in vivo em camundongos nus saudáveis foi analisado. Conforme mostrado na Fig. 2b, a análise histopatológica dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) mostrou que N ₂ O-mbs não causou danos tóxicos significativos aos camundongos. Esses resultados indicaram que N ₂ O-mbs tem alta biocompatibilidade.

a A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio CCK-8; b Coloração H&E dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) em camundongos nus fêmeas saudáveis com ou sem receber o N ₂ O-mbs; c as imagens de a para d mostram células em campo claro, núcleos celulares corados por DAPI, N ₂ O-mbs corado por DiI e os resultados mesclados das três imagens de fluorescência; barra de escala =50 μm [ NS sem significância, em comparação com o grupo de controle (0 bolhas / mL)]

A captação intracelular de N ₂ O-mbs ao longo de tempos de incubação prolongados (2 h e 4 h) foi visualizado por CLSM. A incubação de células com N ₂ marcado com DiI O-mbs resultou no acúmulo de um grande número de N ₂ O-mbs na membrana da célula cancerosa e no citoplasma. Como mostrado na Fig. 2c, houve boa co-localização de fluorescente vermelha N ₂ O-mbs com as células fluorescentes azuis. Esta descoberta sugere que N ₂ O-mbs são eficientemente internalizados nas células cancerosas MDA-MB-231.

Efeito sonodinâmico de N ₂ O-mbs in vitro

SOSG é uma sonda de detecção de oxigênio singlete comumente usada que é altamente sensível e confiável para a detecção de geração de radicais livres de oxigênio. Para explorar o potencial de N ₂ O-mbs como um sonossensibilizador, SOSG foi usado para detectar a geração de ROS in vitro [30, 31]. SOSG combina com ¹ O ₂ para formar SOSG-EP, que se caracteriza por um aumento na intensidade de fluorescência. Como mostrado na Fig. 3a, após a irradiação ultrassônica da solução SOSG contendo N ₂ O-mbs, o valor da intensidade de fluorescência aumentou significativamente; em comparação com o resto dos grupos, a produção de radicais livres de oxigênio foi significativamente aumentada ( p <0,01).

a Espectro de fluorescência de SOSG com N ₂ O-mbs irradiado por LIFU; b a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio CCK8; c imagens confocais de geração de ROS intracelular (fluorescência verde indica coloração positiva para ROS corado com DCFH-DA); d o valor médio de intensidade de fluorescência (DCFH-DA) de cada grupo calculado pela Imagem J. (Os dados foram mostrados como média ± DP, n =5 por grupo, * p <0,05, em comparação com LIFU – C ₃ F ₈ -mbs group)

Além da detecção da geração de ROS em solução aquosa após irradiação ultrassônica de N ₂ O-mbs, um kit de ensaio DCFH-DA ROS foi usado para determinar a produção de ROS intracelular por N ₂ O-mbs. Conforme mostrado na Fig. 3b, o grupo de controle positivo demonstrou a intensidade de fluorescência mais forte. O próximo sinal de fluorescência verde mais forte apareceu apenas no LIFU – N ₂ Grupo O-mbs, revelando a produção consequente de ROS na presença simultânea de N ₂ O-mbs e irradiação LIFU. No entanto, nenhuma fluorescência óbvia foi detectada em qualquer um dos grupos restantes (Fig. 3c). A viabilidade celular do grupo controle foi definida como 100%. Os resultados do ensaio CCK-8 mostraram aproximadamente 46% de morte celular no LIFU – N ₂ Grupo O-mbs (Fig. 3d). A citotoxicidade de N ₂ O-mbs em combinação com LIFU foi avaliado pela observação CLSM da morte celular após o tratamento. CAM foi usado para corar células vivas com fluorescência verde. PI foi usado para corar células mortas com fluorescência vermelha. Conforme mostrado na Fig. 4a, havia muitas células mortas no LIFU – N ₂ Grupo O-mbs. Além disso, os resultados da citometria de fluxo mostraram que a taxa de apoptose do grupo de células MDA-MB-231 foi significativamente maior do que a de outros grupos ( p <0,05) após o N ₂ combinado O-mbs com tratamento LIFU (Fig. 4b). O combinado C ₃ F ₈ -mbs com o tratamento LIFU não causou morte celular óbvia ou apoptose. Os resultados indicaram ainda que extensa apoptose e necrose ocorreram em resposta ao SDT. Os resultados da citometria de fluxo foram consistentes com os do CLSM. Esses resultados indicam que N ₂ O-mbs combinados com LIFU induzem apoptose de células tumorais in vitro (Arquivo adicional 2:Figura S2; Arquivo adicional 3:Figura S3).

a Análise de citometria de fluxo de apoptose e necrose de células tumorais; b imagens confocais de células MDA-MB-231 co-coradas com CAM / PI após vários tratamentos. As barras de escala são 100 μm

Avaliação do efeito sinérgico de HIFU in vitro em células cancerosas

Os resultados da citometria de fluxo são mostrados na Fig. 5a. Ambos N ₂ O-mbs e C ₃ F ₈ -mbs aumentou a mortalidade das células MDA-MB-231 após a ablação com HIFU. Além disso, em comparação com HIFU-C ₃ F ₈ -mbs, N ₂ O-mbs aumentou significativamente a apoptose de MDA-MB-231 ( p <0,05; Fig. 5b). Os resultados do teste de NO mostraram que a intensidade de fluorescência do sobrenadante do HIFU – N ₂ O grupo O-mbs também foi significativamente maior do que os demais grupos ( p <0,05) (Fig. 5c). Alterações no citoplasma e organelas foram observadas por TEM (Fig. 5d). A célula do grupo controle (sem nenhum tratamento) apresentou morfologia celular completa. Grandes quantidades de substâncias vacuolares foram encontradas no citoplasma das células do grupo HIFU. Mas as células ainda têm membranas celulares completas e membranas nucleares. No entanto, tanto o HIFU – N ₂ Grupo O-mbs e o HIFU – C ₃ F ₈ O grupo -mbs mostrou uma perda de integridade da membrana celular e desintegração completa da estrutura celular. Vale ressaltar que as observações do TEM foram apenas o momento do processo de morte celular e apoptose após o tratamento em cada grupo. N ₂ O-mbs como microbolhas exógenas têm um efeito obviamente sinérgico no tratamento HIFU. No HIFU – N ₂ Grupo O-mbs, o efeito sonodinâmico de N ₂ O-mbs pode promover mais apoptose celular. Os resultados foram validados na detecção de citometria de fluxo e no experimento in vivo (Arquivo adicional 4:Figura S4; Arquivo adicional 5:Figura S5)

a Resultados do ensaio de ligação de Anexina V-FITC / PI; b a taxa média de apoptose celular em cada grupo; c análise quantitativa da geração de NO de N ₂ O-mbs irradiado por HIFU; d imagem de microscopia eletrônica de transmissão de células. As barras de escala são 100 μm. (Os dados foram apresentados como média ± DP, n =5 por grupo, * p <0,05, em comparação com o controle, HIFU , HIFU – C ₃ F ₈ grupos -mbs)

N ₂ O-mbs como sinergista para terapia HIFU

Após a ablação HIFU do fígado bovino isolado, uma região necrótica coagulativa cinza-branca apareceu na área-alvo (Fig. 6b). The average echo intensity changes in the target area before and after HIFU are shown in Fig. 6c. Compared with those of the PBS group, the target echo intensity values of the C₃ F₈ -mbs group and the N₂ O-mbs group were significantly increased after HIFU treatment (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

a Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

a Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Discussão

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. O N ₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ and O₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:
$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$
The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N ₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N ₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Conclusion

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Disponibilidade de dados e materiais

As conclusões feitas neste manuscrito são baseadas nos dados que são apresentados e mostrados neste artigo.

Abreviações

N₂ O-mbs:: N ₂ O microbubbles
C₃ F₈ -mbs:: C₃ F₈ microbubbles
HIFU:: high-intensity focused ultrasound
LIFU:: low-intensity focused ultrasound
SOSG:: singlet oxygen sensor green
SDT:: sonodynamic therapy
DPPC:: 1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine
DSPE-mPEG2000:: 1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000
DAPI:: 4′,6-diamidino-2-phenylindole
DiI:: 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
DCFH-DA:: 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate
DAF-FM:: 3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate
CAM:: Calcein-AM
CCK-8:: Cell Counting Kit-8
CLSM:: confocal laser scanning microscopy
TEM:: transmission electron microscope
DMEM:: Meio Eagle modificado por Dulbecco
FBS:: fetal bovine serum
PBS:: phosphate-buffered saline
DI:: água desionizada
ROI:: regions of interest
ROS:: reactive oxygen species
NO:: óxido nítrico