Melhoria da Terapia HIFU contra Câncer Usando Microbolhas Sonodinâmicas de N₂O

Introdução

Tumores malignos são uma das principais doenças que ameaçam a vida e saúde humana [1]. Ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU) é uma nova técnica para ablação local não invasiva de tumores. HIFU tem sido usado com sucesso no tratamento de tumores sólidos benignos e malignos no fígado, rim, pâncreas, próstata, mama, osso e útero [2, 3]. No entanto, as limitações inerentes do HIFU, como decaimento de energia ultrassônica durante tratamento, enfraquecimento de acumulação de energia na área alvo e dano a tecido saudável não-alvo reduzem seu efeito terapêutico [4, 5]. O campo focal formado por irradiação HIFU é pequeno, geralmente em magnitude de milímetros. Leva longo tempo para ablar tumores grandes. A extensão do tempo de irradiação HIFU aumentará a temperatura corporal, mesmo alcançando 39,2 °C. À medida que a profundidade do tumor aumenta no corpo, a energia de ablação HIFU também precisa aumentar [6]. Estes aumentam o risco de dano físico ao paciente e reduzem a eficiência e segurança do tratamento HIFU. Portanto, pesquisadores têm se comprometido a encontrar maneiras de aumentar a eficiência terapêutica do HIFU nos últimos anos [7-9]. Microbolhas poderiam melhorar sinergicamente a eficácia terapêutica do HIFU [7, 10]. O gás na microbolha pertence ao material de alta impedância acústica. As microbolhas aumentam a dispersão e reflexão da onda ultrassônica na área alvo quando HIFU irradia a área de tecido tumoral [11, 12]. Microbolhas aumentam a temperatura da área alvo tumoral e aumentam o efeito térmico do tratamento HIFU aumentando a acumulação de energia HIFU na área alvo [13]. Além disso, microbolhas como núcleo de cavitação exógeno também reduzem o limiar de cavitação do tecido e aumentam o efeito de cavitação do HIFU ao passar pela circulação sanguínea no tecido tumoral [14]. Nos últimos anos, estudos indicaram que terapia sonodinâmica (SDT) pode aumentar sinergicamente a eficácia do tratamento HIFU [15, 16]. As interações entre sonossensibilizadores e ultrassom produzem espécies reativas de oxigênio (EROs), incluindo oxigênio singlete e radicais hidroxila, que matam células tumorais e inibem crescimento tumoral via apoptose e necrose [17]. SDT fez grande progresso no campo de tratamento de tumor não invasivo nos últimos anos. Permite redução de dose de fármaco e potência de irradiação HIFU comparado às monoterapias convencionais. Para fazer pleno uso das vantagens dos dois, este estudo combinou microbolhas e efeito sonodinâmico para melhorar ainda mais a eficácia do HIFU. Sonossensibilizadores são parte importante da SDT [18, 19]. A maioria dos sonossensibilizadores tradicionais atualmente estudados são de fotossensibilizadores. N₂O é um fotossensibilizador [20, 21], que produz substâncias tóxicas sob condição de irradiação de luz ultravioleta. Neste estudo, a sonossensibilidade do N₂O também foi explorada inicialmente. Nós anteriormente descobrimos que aplicação de anestesia inalatória de N₂O em operação HIFU agravou grau de lesão tecidual, incluindo aumento de espessura de congestão abdominal e cutânea [22]. A utilização combinada de N₂O e HIFU jogou efeito sinérgico na lesão tecidual. Mas, qual efeito biológico N₂O tem no tratamento HIFU é incerto. N₂O é gás molecular pequeno relativamente estável sem biotransformação e sem especificidade tecidual em células. Pode ser amplamente usado em tecido e não tem efeito tóxico no corpo [23, 24]. Então, é uma perspectiva atraente como sonossensibilizador. Neste estudo, microbolhas nanoscópicas (N₂O-mbs) foram preparadas usando N₂O envoltório por lipídeo e C₃F₈. A dosagem de N₂O foi reduzida e sua faixa de ação in vivo também foi efetivamente limitada à área de tecido tumoral. O efeito sonodinâmico de N₂O e seu efeito sinérgico na eficácia do HIFU foram examinados.

Materiais e Métodos

Materiais

1,2-Dihexadecanoil-rac-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietileno glicol)-2000] (DSPE-mPEG2000) foram comprados da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA). Glicerina e agarose foram obtidos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). N₂O e C₃F₈ foram comprados da Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4′,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI), 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), 3-amino,4-aminometil-2′,7′-difluoresceína, diacetato (DAF-FM DA) e CCK-8 foram comprados da Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calceína-AM (CAM) e iodeto de propídeo (PI) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (TX, EUA). Annexin V-FITC/PI foram obtidos da Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Sensor verde de oxigênio singlete (SOSG) foi comprado da Invitrogen (NY, EUA).

Preparação de N₂O-mbs e C₃F₈-mbs

N₂O-mbs foram preparadas pelo método de filme rotativo combinado com oscilação mecânica. Usamos DPPC e DSPE-PEG2000 como materiais de casca e N₂O como núcleo. Brevemente, 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 e 10 mL clorofórmio foram simultaneamente despejados em balão de fundo redondo, misturados e totalmente dissolvidos por ondas ultrassônicas. Então, os filmes lipídicos foram formados por evaporador rotativo (60 min, 55 °C, 100 r/min). Em seguida, 2 mL de glicerina 10% foi adicionado para hidratar os filmes lipídicos e preparar suspensão. 500 μL do qual foi adicionado a um tubo de cápsula. O tubo de cápsula foi tampado com tampa de borracha. O ar no tubo foi substituído por N₂O e C₃F₈ por dispositivo de deslocamento de gás. Então, a suspensão foi oscilada mecanicamente por misturador de cápsula prata-mercúrio (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) por 150 s. Finalmente, a suspensão resultante foi submetida a centrifugação diferencial para obter N₂O-mbs alvo, e foi centrifugada a 300 rpm por 5 min, e então centrifugada a 800 rpm por 5 min. N₂O-mbs foram ressuspensas em PBS e então armazenadas a 4 °C para uso posterior.

C₃F₈-mbs foram fabricadas usando o mesmo método de oscilação mecânica, como descrito anteriormente [25]. N₂O-mbs marcadas com DiI podem ser preparadas adicionando DiI durante formação de filme rotativo. Vale mencionar que N₂O tem baixo peso molecular e é instável. O N₂O na microbolha facilmente transborda. Portanto, a meia-vida da microbolha é reduzida. C₃F₈ é gás inerte macromolecular amplamente usado no estudo de agentes de contraste microbolha ultrassônicos. C₃F₈ pode aumentar a estabilidade das microbolhas. Portanto, neste estudo, N₂O e C₃F₈ (2:1) foram misturados como núcleo das N₂O-mbs para aumentar sua estabilidade.

Fabricação e Detecção de Desempenho de N₂O-mbs

A morfologia e distribuição de tamanho de N₂O-mbs foram observadas sob microscopia óptica de campo claro. As concentrações de N₂O-mbs e C₃F₈-mbs foram calculadas por globulímetro de acordo com diretrizes de cálculo. O tamanho médio de partícula e potencial zeta das N₂O-mbs foram determinados por sistema de espalhamento de luz a laser dinâmico (Malvern Instruments, Malvern, UK). A estrutura e morfologia das N₂O-mbs foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japão). As N₂O-mbs preparadas foram armazenadas a 4 °C. Para observar a estabilidade das N₂O-mbs, a morfologia e concentração foram registradas no primeiro, segundo e terceiro dias. Ao mesmo tempo, o tamanho médio de partícula e potencial zeta das microbolhas foram determinados.

Cultura Celular e Modelo Animal

Células de câncer de mama humano (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) foram passadas no laboratório por menos de 3 meses após ressuscitação. As células foram mantidas em incubadora a 37 °C com 5% CO₂, usando DMEM contendo 10% soro fetal bovino, 50 μg/L estreptomicina e 50 μg/L penicilina. Quando as células atingiram 80% de confluência, foram usadas para experimento.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Chongqing. Um certo número de camundongos fêmeas nu (4-6 semanas de idade; peso 15-20 g) foram comprados do Centro de Experimentação Animal da Universidade Médica de Chongqing (Chongqing, China). Para estabelecimento de tumor sólido, células MDA-MB-231 (1 × 10⁶ células/mL) suspensas em salina normal (100 μL) foram injetadas subcutaneamente no flanco dorsal direito de cada camundongo. Todos os camundongos portadores de tumor foram usados para experimentos terapêuticos quando os volumes tumorais atingiram cerca de 150 mm³.

Captação Intracelular e Avaliação de Biocompatibilidade de N₂O-mb

Células MDA-MB-231 em fase de crescimento foram semeadas a densidade de aproximadamente 1 × 10⁵ células por frasco de microscopia a laser de varredura confocal (CLSM) por 24 h. Em seguida, 100 μL (1 × 10⁵ bolhas/mL) de solução de diluição de meio completo de N₂O-mbs marcadas com DiI foi adicionada para encher o prato confocal com meio. O prato foi selado com seladores de microplaca e armazenado invertido em incubadora, mantendo N₂O-mbs em contato com as células. Após 2 h e 4 h de co-incubação, as células foram lavadas suavemente 3 vezes com PBS, fixadas com 4% paraformaldeído (PFA) por 20 min e coradas com DAPI por 20 min. Finalmente, o comportamento de direcionamento celular de N₂O-mbs foi observado por CLSM (Nikon A1, Japão).

A citotoxicidade de N₂O-mbs foi avaliada por ensaio CCK-8 padrão. Células MDA-MB-231 foram semeadas em placa de 96 poços (5 × 10⁴ células/poço) por 24 h. Em seguida, 100 μL de diferentes concentrações (1 × 10⁴/mL, 1 × 10⁵/mL, e 1 × 10⁶/mL) de N₂O-mb foram adicionados. Após 24 h de incubação, solução CCK-8 (10 μL) foi adicionada a cada poço. Então, as células MDA-MB-231 foram cultivadas a 37 °C por mais 2 h. Finalmente, a absorbância de cada poço foi medida a 450 nm com leitor de microplacas Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, EUA).

Dez camundongos fêmeas nu saudáveis pesando aproximadamente 20 g foram divididos em dois grupos aleatoriamente. O grupo N₂O-mbs (n = 5) foi injetado intravenosamente com N₂O-mbs (200 μL, 1 × 10⁵/mL) e o grupo controle (n = 5) injetado com salina normal (200 μL). Após 21 dias, os órgãos principais (coração, fígado, baço, pulmão e rim) de todos os camundongos foram removidos e corados com hematoxilina-eosina (H&E).

Eficiência SDT In Vitro de N₂O-mbs

O método para detecção de radicais de oxigênio foi baseado em relatório prévio [26]. Brevemente, 10 μL de SOSG (500 μM) foi misturado com 2 mL da solução da amostra. Os tratamentos foram agrupados como segue: grupo C (grupo controle em branco), apenas PBS foi adicionado; grupo N₂O-mbs, 100 μL de N₂O-mbs (1 × 10⁵/mL) em 2 mL de solução PBS foi adicionado; grupo C₃F₈-mbs, 100 μL de C₃F₈-mbs (1 × 10⁵/mL) em 2 mL de solução PBS foi adicionado; grupo LIFU, PBS foi irradiado por ultrassom (2 W/cm²; Instituto de Imagem Ultrassônica de Ciências Médicas de Chongqing, Chongqing, China) por 100 s; grupo LIFU-N₂O-mbs, PBS com N₂O-mbs adicionados foi irradiado por ultrassom; grupo LIFU-C₃F₈-mbs, PBS com C₃F₈-mbs adicionados foi irradiado por ultrassom. Os parâmetros de tratamento do grupo experimental foram definidos como 2 W/cm² e 100 s através da análise e comparação dos resultados experimentais e consulta da literatura [27, 28]. Os parâmetros de ultrassom empregados para propósitos de tratamento foram definidos como segue: frequência, 650 kHz; distância focal, 12,5 mm; modo onda pulsada, ciclo de trabalho 50%; e duração do pulso, 1 s. A geração de oxigênio singlete (¹O₂) foi determinada por espectrometria de fluorescência (Cary Eclipse, Agilent Technologies) medindo intensidade de fluorescência (λ excitação/λ emissão = 504 nm/525 nm). A seleção da intensidade e duração do ultrassom foi consistente com experimentos in vitro com células.

Após a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) extracelulares ser detectada usando ensaio SOSG, a produção de EROs intracelulares foi detectada por kit de ensaio ROS baseado em DCFH-DA. Células MDA-MB-231 foram semeadas a densidade de aproximadamente 1 × 10⁵ células por frasco CLSM. Então, foram distribuídas aleatoriamente em seis grupos: grupo controle (sem tratamento), grupo apenas N₂O-mbs (100 μL, 1 × 10⁵ bolhas/mL), grupo apenas C₃F₈-mbs (100 μL, 1 × 10⁵ bolhas/mL), grupo apenas LIFU (2 W/cm² por 100 s), grupo LIFU-C₃F₈-mbs, grupo LIFU-N₂O-mbs. Após incubação por 24 h para permitir adesão celular, cada grupo foi submetido à intervenção experimental correspondente descrita acima. Então, a mesma quantidade de DCFH-DA (30 μM) foi adicionada ao prato correspondente em cada grupo, e o prato foi incubado por 20 min no escuro. As células foram então lavadas suavemente 3 vezes com PBS para remover sonda DCFH que não entrou na célula. Finalmente, a geração de EROs intracelulares foi determinada por CLSM. Para verificar ainda mais a eficiência SDT de N₂O-mbs, células foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas por 24 h e distribuídas aleatoriamente em seis grupos, como descrito acima. Então, os tratamentos correspondentes foram realizados em cada grupo. As células em cada grupo foram digeridas e preparadas em suspensões celulares em concentrações apropriadas e colocadas em prato CLSM. Finalmente, as células foram escaneadas por CLSM após co-coloração com corantes CAM e PI para diferenciar células mortas (vermelho) e vivas (verde). Apoptose foi detectada por citometria de fluxo e coloração Annexin V-FITC/PI. Após 1 h de tratamento, cada grupo de células foi centrifugado, e as células foram coletadas. Seguindo co-coloração Annexin V-FITC/PI, detecção por citometria de fluxo (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) foi realizada.

Avaliação In Vitro do Efeito Sinérgico de N₂O-mbs no Tratamento HIFU em Células Cancerígenas

Um sistema HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) composto por unidade de ultrassom diagnóstico, unidade de ultrassom terapêutico e sistema de processamento central foi usado como descrito anteriormente [29]. Os parâmetros HIFU empregados para propósitos de tratamento foram definidos como segue: frequência de trabalho, 0,94 MHz; distância focal, 140 mm; diâmetro, 220 mm; e frequência de transdutor diagnóstico em tempo real, 3,5 MHz. Os transdutores integrados foram submersos em água desgasificada. Para avaliar o efeito de realce de N₂O-mbs no tratamento HIFU, células MDA-MB-231 foram centrifugadas, 5 × 10⁵/mL, e distribuídas em quatro grupos: grupo controle (sem tratamento), grupo apenas HIFU (125 W, 5 s), grupo apenas HIFU-N₂O-mbs, grupo apenas HIFU-C₃F₈-mbs. Em seguida, os diferentes tratamentos respectivos foram realizados para cada grupo. As células tratadas foram centrifugadas e lavadas com PBS, duplamente coradas com Annexin V-FITC/PI e colhidas para citometria de fluxo. A sonda de óxido nítrico (NO) DAF-FM foi usada para detectar NO no sobrenadante de cada grupo de tratamento. Todos os experimentos foram realizados 3 vezes. TEM foi usado para identificar a morfologia ultraestrutural das células tratadas. Após cada tratamento, as células tratadas foram imediatamente fixadas com 2% OsO₄, desidratadas em série graduada de álcool, e planamente incluídas em Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Seções ultrafinas (100 nm) foram preparadas, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo, e examinadas sob microscópio eletrônico.

Efeito Sonodinâmico Ex Vivo e In Vivo de N₂O-mbs Aumenta Eficácia de Ablação HIFU

Tecidos de fígado bovino frescos foram comprados de abatedouro local e usados dentro de 12 h após abate. Fígado bovino fresco ex vivo com pouco tecido conjuntivo e menos vasos sanguíneos foi fatiado em seção de 10 cm × 5 cm × 5 cm e desgasificado por 1 h a 37 °C. Os fígados bovinos foram divididos em três grupos: grupo C₃F₈-mbs, grupo N₂O-mbs e grupo PBS. Primeiro, fígado bovino recém-isolado foi colocado em recipiente contendo água desaerada. Então, 200 μL (1 × 10⁵ bolhas/mL) de microbolhas em PBS foi injetado diretamente no fígado bovino da maneira mostrada na Fig. 6a. Sob orientação de transdutor de ultrassom diagnóstico, o ponto focal HIFU foi posicionado no local de injeção. Então, o transdutor terapêutico foi usado para realizar 5 s de ablação em diferentes potências (100 W, 125 W, 150 W) no local de injeção do fígado bovino. Finalmente, o volume necrótico coagulativo da área alvo no tecido de fígado bovino foi calculado de acordo com o comprimento, largura e profundidade máximos medidos (mm) pela seguinte equação: V (mm³) = π/6 × comprimento × largura × profundidade. Além disso, o valor de cinza da área alvo antes e após ablação HIFU em cada grupo foi registrado nas imagens de ultrassom diagnóstico.

Vinte camundongos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 5 por grupo), incluindo grupo controle (sem qualquer tratamento), grupo HIFU-PBS, grupo HIFU-C₃F₈-mbs, e grupo HIFU-N₂O-mbs. Ablação HIFU (125 W, 5 s) de tumor foi aplicada após os camundongos receberem injeção intravenosa de 200 μL de grupo C₃F₈-mbs, N₂O-mbs e PBS. O procedimento de ablação HIFU de tumores sólidos foi similar ao de fígado bovino isolado ex vivo. Primeiro, camundongos foram anestesiados com 1% pentobarbital (8 mL/kg). O local do tumor do camundongo foi inoculado em recipiente contendo água desaerada. Sob orientação de transdutor de ultrassom diagnóstico, o ponto focal HIFU foi posicionado no tecido tumoral. Os pesos corporais dos camundongos e o volume do tumor foram registrados com intervalo de 3 dias. Finalmente, todos os camundongos foram sacrificados 21 dias após tratamento e tecidos tumorais dissecados dos camundongos e então enviados para H&E, coloração de antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), marcação terminal deoxynucleotidil transferase dUTP nick end labeling (TUNEL).