Imageamento e Terapia por Ultrasom Direcionados de Tumores Ovariano Usando Nanopartículas Proteicas de Perfluoropentano Sensíveis a pH

Resumo

Neste estudo, desenvolvemos um agente terapêutico multifuncional de ultrassom (US) que encapsula perfluoropentano (PFP) em ferritina (FRT) e conjuga a molécula de direcionamento tumoral ácido fólico (FA) (FA-FRT-PFP). As FA-FRT-PFP preparadas tiveram diâmetro médio de partícula de 42,8 ± 2,5 nm, potencial zeta de − 41,1 ± 1,7 mV e mostram boa estabilidade em solução fisiológica e temperaturas. FRT é uma proteína de gaiola sensível a pH que, a pH 5,0, desmonta para formar poros que podem carregar PFP. O ajuste para pH neutro fecha os poros e encapsula o PFP dentro da FRT para formar nanopartículas. A pH 5,0, 3 min de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU, 2 W/cm²) aumentaram significativamente o sinal US de FA-FRT-PFP através do efeito de vaporização de gota acústica (ADV). Sob condições idênticas, 4 min de irradiação LIFU causaram a ruptura das bolhas geradas por FA-FRT-PFP. FA-FRT-PFP poderia ser eficientemente direcionado para células de câncer ovariano e aumentou significativamente o contraste US de FA-FRT-PFP após 3 min de irradiação LIFU. Após 4 min de irradiação LIFU, a viabilidade celular diminuiu significativamente devido à necrose, provavelmente devido à liberação mediada por FA-FRT-PFP de PFP no ambiente ácido dos lisossomos após entrar nas células tumorais. PFP é então transformado em bolhas que estouram sob irradiação LIFU, formando ondas de choque físicas que levam à destruição da estrutura celular e necrose, alcançando tratamento tumoral. Em conjunto, isso demonstra que FA-FRT-PFP é um agente teranóstico US novo e promissor para futura aplicação clínica.

Introdução

O câncer ovariano é um dos cânceres femininos mais letais globalmente [1-3]. O tratamento de câncer ovariano permanece clinicamente dependente de radioterapia, quimioterapia, cirurgia e outras terapias auxiliares [4-6]. No entanto, deficiências nessas estratégias continuam a dificultar melhorias nas taxas de sobrevivência dos pacientes. Para superar essas deficiências, métodos de diagnóstico mais eficazes e seguros são necessários. Nos últimos anos, a integração de imagem e terapêutica em uma única plataforma de tratamento emergiu como um tópico quente [7-9].

Tecnologia de ultrassom (US), devido às suas características não invasiva, não radiativa, baixo custo e específicas, é amplamente usada em diagnóstico clínico e tratamentos de tumor [10-12]. Nas últimas décadas, uma plataforma de resposta acústica (ARP) com capacidades de imagem e terapêutica US foi desenvolvida para diagnóstico e tratamento eficaz de tumores [13-16]. ARP inclui principalmente microbolhas ou nanobolhas (MB ou NB) e plataformas baseadas em nanopartículas (NP) [16, 17]. Entre estes ARPs, MB ou NB mostram boas capacidades de resposta acústica, mas devido ao seu grande tamanho, a penetração tecidual in vivo é fraca e a estabilidade da amostra é ruim. NP exibe maior permeabilidade tecidual e ciclo farmacocinético mais longo devido ao seu pequeno tamanho. No entanto, as capacidades de resposta acústica de NPs são limitadas. É, portanto, urgente projetar ARPs de pequeno tamanho, com alta estabilidade e forte responsividade.

Fluorocarbonetos líquidos sofrem transição de fase líquido-gás em resposta a estimulação externa [18, 19]. Natalya e colegas desenvolveram uma nanoemulsão contendo fluorocarboneto líquido que produziu efeitos de vaporização de gota acústica (ADV) sob ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) [20-22]. As emulsões formaram bolhas e simultaneamente desencadearam liberação de fármaco, permitindo assim tratamento tumoral. No entanto, uma camada de material selante envolta ao fluorocarboneto líquido levou a um aumento na intensidade e tempo do ultrassom necessário para tratamento tumoral, resultando em dano ao tecido saudável circundante. Uma otimização adicional do transportador de fluorocarboneto líquido é, portanto, necessária.

Neste estudo, desenvolvemos uma nanopartícula de ferritina (FRT) carregada com fluorocarboneto líquido perfluoropentano (PFP) que foi further combinada com a molécula alvo tumoral ácido fólico (FA) para formar FA-FRT-PFP. Ferritina é uma nanocage proteica endógena altamente biocompatível que exibe sensibilidade a pH [23-25]. A proteína pode desmontar em ambiente ácido e pode ser remontada em ambiente alcalino. Isso permite o carregamento e liberação controlados de ferritina em resposta a mudanças de pH [26-28]. PFP é um material de transformação de fase frequentemente usado que mostra temperatura de ebulição de 29 °C. A baixa temperatura de ebulição facilitou a fácil transformação de fase por LIFU, que foi mais segura que HIFU. O PFP foi carregado em ferritina e o resultado FA-FRT-PFP teve diâmetro de ~ 47,3 ± 2,8 nm com alta estabilidade em soluções fisiológicas e temperaturas. De acordo com os resultados, FA-FRT-PFP teve as seguintes vantagens: (1) PFP poderia ser facilmente carregado em FRT mudando o pH de ácido para neutro; (2) sob ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU, 2 W/cm², 3 min) e pH = 5,0, FA-FRT-PFP libera PFP e sofre mudanças de fase para melhorar sinais de imagem US através de vaporização de gota acústica (ADV); 3) Sob irradiação LIFU de longo prazo (4 min) e pH = 5,0, o PFP liberado de FA-FRT-PFP explodiu e produziu uma onda de choque física que poderia efetivamente destruir células tumorais através de necrose. Para nosso conhecimento, este é o primeiro exemplo de carregamento de PFP em FRT como teranóstico US de tumor. Esses resultados indicam que FA-FRT-PFP + LIFU é uma nova estratégia para diagnóstico e tratamento integrado de tumor.

Materiais e Métodos

Materiais

Gel de agarose, ferritina (FRT), ácido fólico (FA) e perfluoropentano (C₃F₈, PFP) foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, EUA). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA e NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH foram fornecidos pela Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) foram comprados da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). Kit de contagem celular-8 (CCK-8) foram obtidos da Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japão). Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), tampão fosfato salino (PBS), penicilina-estreptomicina, tripsina-EDTA e soro bovino fetal (FBS) foram comprados da Gibco (Grand Island, NY, EUA).

Cultura Celular

Linha de células de câncer ovariano humano SK-OV-3 foi fornecida pelo Instituto de Biologia Celular de Xangai, Academia Chinesa de Ciências. Células epiteliais ovarianas normais HUM-CELL-0088 foram obtidas da PriCells, Wuhan, China. As células foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% soro bovino fetal e 1% solução de penicilina-estreptomicina. As células foram mantidas em incubadora com atmosfera umidificada contendo 5% CO₂ a 37 °C.

Preparação de FA-FRT-PFP

Primeiramente, molécula alvo FA foi conjugada com FRT através de reação de esterificação [29]. Em resumo, NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (10 mg) e solução de FRT foram misturados com a presença de EDC (5 mg/mL) e NHS (20 mg/mL). Após 3 h de reação à temperatura ambiente com agitação leve, a mistura foi purificada através de diálise contra água destilada (corte MW = 1,2 kDa) por 24 h. A solução resultante foi nanopartículas FA-FRT. Em segundo lugar, o carregamento de PFP na cavidade de FRT foi preparado com o processo de desnaturalização e renaturalização de proteína [30]. Brevemente, FA-FRT foi diluído em 5 mL PBS para ser 2 mg/mL e ajustado a pH = 5,0 com 30 min de agitação leve à temperatura ambiente para garantir dissociação completa da FRT. Após isso, 500 μl PFP foi adicionado à solução em banho de gelo e submetido a sonicação pulsada com 5 s ligado e 5 s pausa por um total de 5 min a 80 W em banho de gelo. Após a sonicação, o valor de pH da mistura foi ajustado para neutro (pH = 7,4). Como PFP era estado oleoso e insolúvel em água, o excesso de PFP foi facilmente removido por separação líquida para ser FA-FRT-PFP. FRT-PFP foi preparado com método similar exceto por trocar NH₂-PEG₂₀₀₀-FA por NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH.

Caracterização de FA-FRT-PFP

Os tamanhos e potenciais zeta das nanopartículas foram testados por um Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). A morfologia de FA-FRT-PFP foi observada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Hitachi, Japão) e microscopia de fluorescência invertida (Olympus, Japão). A estrutura química das nanopartículas foi detectada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Alemanha). A captação celular de FA-FRT-PFP foi detectada por microscopia a laser de varredura confocal (LEXT OLS4100, Olympus, Japão). As células com dupla coloração FITC/PI foram analisadas por citometria de fluxo (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Desempenho de Geração de Gás Responsivo a pH e Ultrasom

FA-FRT-PFP em condições de pH = 5,0 e 7,5 foram irradiados com diferentes intensidades acústicas de LIFU (1,5 e 2,0 W/cm²) e por diferentes tempos totais (1, 2, 3 e 4 min) no modelo de gel de agarose, então imagens US foram observadas por equipamento US (Esaote Mylab 90, Itália) com frequência de 5-12 MHz e índice mecânico (MI) de 0,06. Após isso, a aparência de FA-FRT-PFP foi observada por microscopia óptica no tempo. A intensidade US da região de interesse na imagem US foi analisada por software ImageJ.

Captação Celular

Brevemente, 1 mg de FITC foi dissolvido em 1 mL de DMSO e então misturado com FRT-PFP e FA-FRT-PFP por 30 min com agitação leve. Em seguida, a solução mista foi dialisada durante a noite em água desionizada para remover FITC e DMSO livres para obter nanopartículas marcadas com FITC. Em seguida, células SK-OV-3 e células ovarianas normais (HUM-CELL-0088) foram cultivadas no meio por 24 h, e então FITC livre, FITC-marcado FRT-PFP e FA-FRT-PFP foram co-incubados com células SK-OV-3 por 5 h. Além disso, FITC-marcado FA-FRT-PFP foi incubado com células SK-OV-3 pré-tratadas com FA por 5 h. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com 4% paraformaldeído e coradas com 0,2 mg/mL de solução DAPI por 10 min. As células foram imageadas por microscopia a laser de varredura confocal para capturar imagens fluorescentes. O sinal de fluorescência foi quantificado por um citômetro de fluxo.

Imageamento por Ultrasom In Vitro

Células SK-OV-3 foram cultivadas por 24 h em meio livre de FA, e então PBS, FRT-PFP e FA-FRT-PFP, e FA-FRT-PFP + FA foram incubados com as células SK-OV-3 por 6 h. As células foram coletadas e misturadas com gel de agarose, e então, as células foram irradiadas com ou sem LIFU por 3 min (1 s ligado e 1 s pausa por um total de 3 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). Por fim, imagens US foram capturadas.

Eficácia Anticâncer In Vitro

Células SK-OV-3 foram semeadas em placa de 96 poços na densidade de 1 × 10⁴ células/poço, e permitidas a aderir por 24 h. Para a citotoxicidade de FA-FRT, várias concentrações (0, 20, 40, 100, 200 e 500 μg/mL) de FA-FRT foram cultivadas com células SK-OV-3. Após 24 h de tratamento, as células foram tratadas por meio DMEM contendo 10% CCK-8 por 20 min em uma incubadora. A absorbância das células no comprimento de onda de 450 nm foi detectada por um Leitor de Placas Multimodo (Thermo Scientific) para caracterizar a viabilidade celular. Além disso, as células SK-OV-3 e células ovarianas normais (HUM-CELL-0088) foram tratadas com PBS, FRT-PFP e FA-FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA por 3 h, e então foram irradiadas por LIFU (1 s com pausa de 1 s por um total de 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). As células tratadas foram incubadas por mais 21 h. Como controle, sem LIFU, as células foram tratadas com PBS, FRT-PFP e FA-FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA por 24 h. Após isso, a viabilidade das células tratadas foi detectada por ensaio CCK-8.

Análise de Morte Celular

Para avaliar o tipo de morte celular, células SK-OV-3 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5 × 10⁴ células/mL. Após 24 h, as células foram tratadas com PBS, FRT-PFP e FA-FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA por 3 h, então irradiadas com LIFU (1 s, pausa de 1 s por um total de 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). As células tratadas foram incubadas por mais 23 h. Como controle, células foram tratadas com PBS, FRT-PFP e FA-FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA por 24 h na ausência de LIFU. As tripsinizadas, centrifugadas a 1500×g por 3 min, lavadas 3 vezes com PBS gelado, e então ressuspensas em 200 mL de tampão de ligação. A seguir, 5 μL de anexina V-FITC e 10 μL de PI foram adicionados e incubados com as células por 15 min no escuro. As células coradas foram analisadas usando um citômetro de fluxo.

Western Blotting

O western blotting foi conduzido de acordo com literatura prévia. As células foram tratadas com 40 μg/mL de PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, e FA-FRT-PFP combinado com ou sem irradiação LIFU (2,0 W/cm², 4 min) e further 21 h incubação. E então as células tratadas foram lisadas em tampão RIPA (Sigma). Cinqüenta microgramas de cada proteína com tampão de amostra Laemmli foram fervidos por 5 min e submetidos a SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana PVDF (Bio-Rad Laboratories) usando Trans-Blot semi-seco (Bio-Rad Laboratories). Blots foram primeiro incubados em tampão de bloqueio TBS contendo 2% leite ou 2% BSA (para anticorpos fosfo-específicos) por 1 h à temperatura ambiente e então com os respectivos anticorpos primários diluídos em TBST (contendo 0,1% Tween20 e 2% BSA) durante a noite a 4 °C. Subsequentemente, blots foram lavados e incubados com anticorpos secundários apropriados (Santa Cruz) em TBST e detectados usando Substrato Quimiluminescente SuperSignal West Pico (Thermo).

Análise Estatística

Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Análises estatísticas foram realizadas usando teste t de Student. *P < 0,05, **P < 0,01 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados e Discussão

Preparação e Caracterização de FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP foi sintetizado e usado para terapia tumoral (Fig. 1). Gotas de transformação de fase foram carregadas em FRT através da desmontagem e remontagem reversível induzida por pH de FRT. O PFP com ADV induzido por LIFU foi entregue nas células e atuou como agente de imagem por ultrassom. A Figura 2a-c mostra imagens TEM de FRT, FRT-PFP e FA-FRT-PFP, que eram de morfologia esférica. Os tamanhos médios de partícula de FRT, FRT-PFP e FA-FRT-PFP foram 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm e 47,3 ± 2,8 nm, respectivamente, (Fig. 2d) demonstrando que o carregamento de PFP e conjugação de FA aumentaram o tamanho de FRT. O potencial zeta médio de FRT e FA-FRT-PFP foram − 43,2 ± 3,1 mV, − 46,9 ± 2,2 mV e − 41,5 ± 2,7 mV, respectivamente (Fig. 2e). Além disso, a conjugação de FA com FRT foi caracterizada por FT-IR como mostrado no Arquivo Adicional 1: Figura S1. O espectro FT-IR exibiu bandas de absorção em ~ 1110 cm⁻¹ que podem corresponder à vibração de ligação éter C-O-C de PEG; picos de absorção em ~ 1601 cm⁻¹ e ~ 1710 cm⁻¹ pertencem a vibrações de ligações C=O de PEG e FRT bem como de –COOH e –CONH₂ de FA e FRT; as bandas em ~ 2820 cm⁻¹, ~ 2920 cm⁻¹ e ~ 2950 cm⁻¹ correspondem a vibrações de estiramento C-H assimétricas e simétricas de –CH₂ de FA e PEG; picos de absorção em ~ 1440 cm⁻¹ estão associados com o anel fenil de FA. O resultado confirma a conjugação bem-sucedida de FA com FRT. Ao longo do período de armazenamento de 28 dias, o tamanho e PDI de FA-FRT-PFP em água, PBS, salina e FBS permaneceram sem mudança significativa (Fig. 3a, b), indicando que FA-FRT-PFP mostra excelente estabilidade. A Figura 3c mostra a mudança de tamanho de FA-FRT-PFP em várias temperaturas variando de 25 °C a 45 °C. O tamanho de FA-FRT-PFP foi quase inalterado quando a temperatura foi reduzida a 25-40 °C, indicando que FA-FRT-PFP mostra alta estabilidade abaixo de 40 °C. Quando a temperatura atingiu 45 °C, o tamanho de FA-FRT-PFP variou de 42,1 nm a 6 nm, provavelmente devido ao PFP em FA-FRT-PFP sofrer gasificação severa, levando à ruptura das nanopartículas. A temperatura de gasificação de FA-FRT-PFP aumentou de 29 °C (temperatura de gasificação de PFP sob pressão normal) para 45 °C, provavelmente devido à cobertura da casca de FRT [21, 31-33].

Representação esquemática da síntese de FA-FRT-PFP e sua aplicação em teranóstico tumoral

a–c Imagens TEM de FRT, FRT-PFP e FA-FRT-PFP. d, e Distribuição de tamanho e potencial zeta de FRT, FRT-PFP e FA-FRT-PFP

a, b Mudança de tamanho e PDI de FA-FRT-PFP em água, PBS, salina e FBS ao longo de 28 dias. c Mudança de tamanho de FA-FRT-PFP em várias temperaturas de 25 °C a 45 °C

Aprimoramento de US Responsivo a pH e LIFU

Experimentos fantasma US de FA-FRT-PFP foram realizados em diferentes valores de pH e intensidade de potência LIFU. Como mostrado na Fig. 4a, na ausência de irradiação LIFU (pré), o sinal US era fraco em todos os grupos. A pH 7,5 após 3 min de irradiação LIFU, FA-FRT-PFP mostrou baixo sinal US tanto a 1,5 quanto 2,0 W/cm², enquanto a pH = 5,0 sob a mesma irradiação LIFU, FA-FRT-PFP teve intensidade de sinal US mais forte. Isso demonstrou que FA-FRT-PFP mostrou efeitos ADV dependentes de tempo e intensidade acústica. Isso foi porque, a pH = 5,0, FA-FRT-PFP desmontou e liberou PFP tornando mais fácil sofrer transformação de fase. Interessantemente, quando o tempo de irradiação LIFU foi estendido para 4 min, FA-FRT-PFP a pH = 5,0 e 2,0 W/cm² de LIFU teve intensidade de sinal US mais fraca comparada àquela em tempo de irradiação menor, provavelmente devido ao LIFU nessa condição ser muito forte que induz ruptura das bolhas. Esses resultados demonstraram que FA-FRT-PFP poderia liberar PFP, gerando transformações de fase e explosão a 2,0 W/cm² de irradiação LIFU a pH = 5,0. Os resultados de intensidade US são mostrados na Fig. 4b, c. A Figura 4d-g mostra a morfologia de soluções FA-FRT-PFP após 3 min de irradiação LIFU (2,0 W/cm²) e a pH = 7,5 e 5,0. FA-FRT-PFP a pH = 5,0 e 2,0 W/cm² LIFU gerou grandes bolhas, further validando nossas descobertas.

a Imagens US de FA-FRT-PFP misturado com gel de agarose em diferentes valores de pH e irradiado por diferentes intensidades de potência LIFU. b, c Dados estatísticos correspondentes do sinal US em a. d–g Imagens de microscopia óptica de FA-FRT-PFP misturado com gel de agarose em diferentes valores de pH e irradiado por 2,0 W/cm² por 3 min

Captação Celular

A Figura 5 mostra a capacidade de captação celular de FA-FRT-PFP. Células tratadas com FITC livre mostraram fluorescência negligenciável, mas após marcação em FA-FRT-PFP, um forte sinal de fluorescência foi evidente, indicando que FA-FRT-PFP tem forte capacidade de captação celular. Células tratadas com FRT-PFP e FA-FRT-PFP pré-incubadas com FA mostraram fluorescência FITC mais fraca. Isso further demonstrou que FA melhora o direcionamento ativo de nanopartículas. Além disso, FA-FRT-PFP mostrou comportamento de captação comparável a FCM (Fig. 5c, d). As taxas de captação de FA-FRT-PFP foram 46,5 ± 2,8%, que foi significativamente maior que a de FITC livre (controle), FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA. Além disso, Arquivo Adicional 1: Figura S2 mostra a captação celular de nanopartículas em células ovarianas normais. Não há diferenças significativas entre FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e grupos FA-FRT-PFP na captação celular. Isso é provavelmente devido às células ovarianas normais (HUM-CELL-0088) terem baixa expressão de receptor FA comparado a células SK-OV-3.

Captação celular. a, b Imagens de fluorescência confocal de células tratadas com FITC livre e FITC-marcado FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e FA-FRT-PFP. Cores verde e azul representaram fluorescência FITC e DAPI, respectivamente. Barra de escala = 25 μm. c, d Sinal de fluorescência FITC e os dados estatísticos correspondentes dentro de células tratadas com FITC livre e FITC-marcado FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e FA-FRT-PFP

Imageamento por Ultrasom In Vitro

Para confirmação de que FA-FRT-PFP melhora imageamento por ultrassom por ADV in vitro, nanopartículas foram incubadas com as células por 5 h e irradiadas com ou sem LIFU (2,0 W/cm²). Como mostrado na Fig. 6a na ausência de irradiação LIFU, células em todos os grupos testados mostraram nenhum sinal US aprimorado enquanto após irradiação LIFU, células tratadas com FA-FRT-PFP mostraram altas intensidades US comparadas a controle FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA, respectivamente. Para imageamento por ultrassom, análise quantitativa dos valores de escala de cinza foi calculada usando software ImageJ. Os resultados foram consistentes com os dados de imageamento US (Fig. 6b) mostrando que a intensidade US de células tratadas com FA-FRT-PFP foram aprimoradas após irradiação por LIFU a 2,0 W/cm² por 3 min. FA-FRT-PFP entra nas células e no ambiente ácido dos lisossomos (pH = ~ 5,0) desmonta e libera PFP no citoplasma [34, 35]. Após irradiação LIFU, o PFP facilmente gerou transformações de fase de gotas para gás, que aprimorou a intensidade US.

Imageamento por ultrassom in vitro. a Imagens de ultrassom e os dados estatísticos correspondentes (b) de PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e células tratadas com FA-FRT-PFP com ou sem irradiação LIFU (2,0 W/cm², 3 min)

Eficácia Anticâncer In Vitro e Análise de Morte Celular

A Figura 7a mostra a citotoxicidade de FA-FRT-PFP em concentrações até 0,5 mg/mL. Na ausência de irradiação LIFU, FA-FRT-PFP não mostrou supressão óbvia de viabilidade em células SK-OV-3. Ensaios CCK-8 foram usados para analisar a eficácia anticâncer de FA-FRT-PFP combinado com LIFU. Como mostrado na Fig. 7b, na ausência de irradiação LIFU, FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e FA-FRT-PFP não exibiram citotoxicidade notável comparado a grupos controle. Quando combinado com 4 min de irradiação LIFU, FA-FRT-PFP mostrou citotoxicidade significativa que foi maior que a de FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, com taxas de inibição celular de pico se aproximando de 90% a 40 μg/mL. Isso pode ser devido a FA-FRT-PFP ser mais prontamente captado no citoplasma e então lisossomos comparado a FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. No ambiente ácido dos lisossomos, FA-FRT-PFP liberou PFP no citoplasma. Sob 4 min de irradiação LIFU, o PFP liberado gasificou, causando cavitação e ruptura, gerando uma série de forças de choque físicas que aumentaram significativamente os efeitos de morte dos tumores [36-38]. Além disso, Arquivo Adicional 1: Figura S3 mostra a citotoxicidade de nanopartículas em células ovarianas normais. Não há diferenças significativas entre FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e grupos FA-FRT-PFP em citotoxicidade quando combinados com LIFU. O resultado pode ser porque células HUM-CELL-0088 têm baixa expressão de receptor FA que não mostrou efeito de direcionamento FA.

Eficácia anticâncer in vitro. a Viabilidades celulares de células SK-OV-3 após 24 h incubação com diferentes concentrações de FA-FRT-PFP. b Viabilidades celulares de células SK-OV-3 tratadas com 40 μg/mL de PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e FA-FRT-PFP combinado com ou sem irradiação LIFU (2,0 W/cm², 4 min) e further 21 h incubação

Como mostrado na Fig. 8a, b, na ausência de irradiação LIFU, células mostraram morte celular mínima em todos os grupos. Após 4 min de irradiação LIFU, células tratadas com FA-FRT-PFP mostraram necrose significativa (~ 91,6%) comparada a outros grupos devido às ondas de choque físicas geradas por cavitação de PFP induzida por LIFP ou explosão de bolhas. Além disso, Arquivo Adicional 1: Figura S4 mostra o nível de expressão de proteína TNF das células. Sem LIFU, as células mal expressaram proteína TNF. Enquanto com LIFU, as células no grupo FA-FRT-PFP têm alto nível de expressão de TNF, comparado àquele em grupos FRT-PFP e FA-FRT-PFP + FA, indicando que a proteína TNF era uma proteína vital relacionada à morte induzida por FA-FRT-PFP + LIFU [39]. Baseado no excelente efeito de terapia anticâncer in vitro [40-42], FA-FRT-PFP é promissor para futura terapia anticâncer in vivo.

a Análise de citometria de fluxo e os dados estatísticos correspondentes de células SK-OV-3 tratadas com 40 μg/mL de PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA e FA-FRT-PFP combinado com ou sem irradiação LIFU (2,0 W/cm², 4 min) e further 23 h incubação

Conclusão

Em resumo, desenvolvemos com sucesso nanopartículas de transformação de fase baseadas em FRT e carregadas com PFP modificadas com molécula alvo FA (FA-FRT-PFP). Como um novo teranóstico US direcionado, FA-FRT-PFP teve múltiplas vantagens: (1) FA-FRT-PFP teve tamanho de partícula na nanoescala; (2) FRT foi usado como transportador, que poderia desmontar e remontar para carregar e liberar gotas PFP em condições ácidas e neutras, respectivamente; (3) sob 3 min de assistência LIFU e condições ácidas, FA-FRT-PFP liberou PFP e gerou transformações de fase através de ADV, que poderia aumentar significativamente seu contraste US; (4) sob 4 min de irradiação por LIFU e ambiente ácido, o PFP liberado poderia facilmente induzir um "efeito explosão" intracelular, resultando em características antitumoral físicas. Esses resultados demonstram que FA-FRT-PFP com assistência LIFU fornece uma nova estratégia para imageamento molecular por ultrassom e terapia tumoral.

Disponibilidade de Dados e Materiais

As conclusões feitas neste manuscrito são baseadas nos dados que são todos apresentados e mostrados neste artigo.

Abreviações

ADV:

Vaporização de gota acústica

ARP:

Plataforma de resposta acústica.

CCK-8:

Kit de contagem celular-8

EDC:

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

FA:

Ácido fólico

FBS:

Soro bovino fetal

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

FRT:

Ferritina

LIFU:

Ultrassom focalizado de baixa intensidade

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PFP:

Perfluoropentano

US:

Ultrassom