Desenvolvimento de Sensor Preciso de pH Lisosomal Usando Nanopartículas de SiO₂ Autodecomponíveis

Resumo

O pH ácido dos lisossomos está intimamente relacionado à autofagia; assim, o conhecimento preciso das mudanças de pH dos lisossomos fornecerá mais informações sobre o processo e status da autofagia. Até agora, porém, apenas mudanças de pH em uma faixa relativamente ampla podiam ser indicadas; a detecção exata do pH lisosomal nunca foi alcançada. Em nosso estudo, estabelecemos um indicador de pH endo/lisossomal baseado no sistema de nanopartículas de SiO₂ autodecomponíveis com parâmetros de síntese específicos. O azul de metileno (AM) concentrado no centro das nanopartículas estruturais centrais-ocas apresentou liberação sensível como função de valores de pH de 4,0–4,8, que é exatamente a faixa de pH dos lisossomos. A correlação linear dos valores de densidade óptica (DO) e valores de pH foi construída, a qual foi usada para detecção de pH de lisossomos em 6 diferentes linhagens celulares. Além disso, por este sistema, conseguimos detectar precisamente as mudanças médias de pH dos lisossomos antes e depois da endocitose de NPs de silício mesoporoso preto (BPSi), esclarecendo o mecanismo de terminação da autofagia após endocitose de BPSi. Assim, o indicador de pH luminal baseado em nanopartículas autodecomponíveis pode fornecer nova metodologia e estratégia para melhor conhecer o pH lisossomal, indicando mais detalhes sobre o processo de autofagia ou outros importantes sinais sobre metabolismo.

Introdução

Lisossomos servem como destino final para macromoléculas, onde estas são degradadas por enzimas hidrolíticas ativadas por baixo pH. O pH ácido dos lisossomos mantido pela ATPase vacuolar tipo H⁺ (v-ATPase) que bombeia prótons do citoplasma para o lúmen lisossomal mantém a atividade de ~ 60 tipos de enzimas hidrolíticas. Além disso, relatórios recentes da literatura revelaram que o pH ácido dos lisossomos está intimamente relacionado à autofagia, de modo que o conhecimento preciso das mudanças de pH lisossomal fornecerá mais informações sobre o processo e status da autofagia. Baseado em nossos estudos e revisão da literatura, a endocitose de nanopartículas com carga positiva de amina provavelmente aumentará a mudança de pH em endolisossomos, como nanopartículas decoradas com PEG contendo aminas primárias e secundárias ou alguma decoração hidrofílica na superfície da partícula.

O aumento de pH induzido pela endocitose de nanopartículas de amina aumentará dramaticamente a localização nuclear do fator de transcrição EB (TFEB), resultando não apenas na regulação transcripcional ascendente da via, mas também causando disfunção lisossomal, resultando finalmente em bloqueio do fluxo autofágico. Como TFEB regula a autofagia, consequentemente, sua superexpressão leva a aumento significativo na produção de autofagossomos em células cultivadas.

Assim, para prever o processo de autofagia e os detalhes da autofagia, a medição precisa do pH lisossomal e sua mudança são cruciais. Até agora, das revisões da literatura de indicação de valor de pH endo/lisossomal e produtos comerciais para detectar valores de pH endo/lisossomal, apenas mudanças de pH em faixa relativamente ampla podiam ser indicadas, e a detecção exata do pH lisossomal nunca chegou. Assim, para conhecer os detalhes íntimos da autofagia, o estabelecimento de um método preciso de detecção de mudança de pH luminal é uma abordagem importante.

Baseado em nossas experiências prévias com nanopartículas de SiO₂ autodecomponíveis, neste estudo estabelecemos um indicador preciso de pH que poderia realizar detecção de mudanças de pH luminal. Nanopartículas de SiO₂ têm boas vantagens em tamanho ajustável e biocompatibilidade. Ao definir parâmetros de síntese específicos, o indicador de pH de SiO₂ autodecomponível estabelecido poderia liberar sensivelmente a carga azul de metileno (AM) em pH 4,0–4,8, que é exatamente a faixa de pH dos lisossomos. Além disso, a liberação de AM apresentou correlação linear com as mudanças de valor de pH (esquema 1). Então, testamos a viabilidade do indicador de pH em nível celular introduzindo 6 diferentes linhagens celulares, conseguindo determinar as mudanças médias de pH dos lisossomos antes e depois da endocitose de NPs de silício mesoporoso preto (BPSi), esclarecendo o mecanismo de terminação da autofagia após endocitose de BPSi. Assim, o indicador de pH luminal baseado em nanopartículas autodecomponíveis pode fornecer nova metodologia e estratégia para melhor conhecer o pH lisossomal, indicando mais detalhes sobre o processo de autofagia ou outros importantes sinais sobre metabolismo.

Materiais e Métodos

Seção de Materiais

Siliceto de sódio (NaSi) e wafers de Si (diâmetro 20 cm, p+ (100), 0,01–0,02 Ω cm) foram fornecidos pela SiGNa Chemistry Inc. e Ocmetic Inc., respectivamente. Brometo de amônio (NH₄Br, 99%), brometo de sódio (NaBr, 99%), tolueno (anidro, 99,8%), ácido clorídrico (HCl, 37%), AM, e ortossilicato de tetraetila (TEOS) foram comprados da Sigma-Aldrich. Metoxi-PEG-silano 0,5 kDa e 2 kDa foram comprados da Fluorochem Ltd. e Laysan Bio Inc. separadamente. Meio RPMI 1640 foi fornecido pela Life Technologies. Soro bovino fetal (SFB) foi comprado da TianHang biological technology. Bicarbonato de sódio, sulfato de estreptomicina, penicilina G, HEPES, Solução de Lisozima, CellLight Early-endosomes-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Kit Pierce® BCA Protein Assay, quimioluminescência aprimorada, conjugado pHrodo™ Red Transferrin, Solução de Imagem de Células Vivas, e reagente Trizol foram comprados da Thermo Fisher Scientific. Etanol e água-amônia foram fornecidos pela Sinopharm. Kit BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis foi comprado da Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. Lisado RIPA foi comprado da Heart Biological Technology Co., Ltd. Anticorpos P62, TFEB e β-actina foram comprados do Proteintech Group, Inc. Anticorpo LC 3B foi fornecido pela Abcam. 2-(4-Piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol (PDMPO) foi fornecido pela Yeasen Biotech Co., Ltd.

Objetivo, Desenho e Configuração do Estudo

O objetivo deste estudo é (1) explorar a influência de nanopartículas BPSi na autofagia em células HepG2, (2) descobrir o mecanismo subjacente das mudanças de valor de pH lisossomal afetando a autofagia, (3) estabelecer um indicador preciso de pH lisossomal que possa medir o pH dos lisossomos precisamente, e finalmente, (4) indicar a influência da flutuação de pH na autofagia. Para realizar o propósito do estudo acima, empregamos experimento de sequenciamento de transcriptoma para explorar mudanças de genes transcriptômicos em células HepG2 após alimentação com nanopartículas BPSi e verificamos por experimentos RT-qPCR e Western. Corantes fluorescentes como PDMPO foram usados para medir a mudança de pH lisossomal em células HepG2 após alimentação com BPSi. Para medir o pH dos lisossomos precisamente, desenvolvemos nanopartículas MB@SiO₂ com 10 parâmetros e testamos as caracterizações destes 10 tipos de nanopartículas através de experimentos como DLS e HR-TEM. A eficiência de carregamento de AM e estudo de cinética de liberação de 10 sistemas de nanopartículas autodecomponíveis em série foram testados em diferentes soluções de pH e células HepG2. Para verificar a localização intracelular da nanopartícula após entrar na célula, fizemos experimento de TEM celular e microscopia confocal de célula viva. Finalmente, medimos as mudanças de pH lisossomal em 6 tipos de células após alimentação com BPSi para verificar a universalidade das nanopartículas MB@SiO₂ para medir mudanças de pH lisossomal.

Síntese de Nanopartículas BPSi

As nanopartículas BPSi foram preparadas pelo nosso método prévio e fornecidas pelo nosso colaborador (Wujun Xu, Departamento de Física Aplicada, Universidade do Leste da Finlândia). A preparação de BPSi, NaSi, sal de amônio e NaBr (NaSi: NH₄Br: NaBr de 1:4:4, p/p/p) foi moída em uma caixa de luvas com atmosfera de Ar. Permitiu-se reagir em forno tubular sob atmosfera de N₂ a 240 °C por 5 h (Eq. 1). Após resfriar à temperatura ambiente, os micropartículas obtidas foram purificadas por enxágue com soluções de 0,5 M HCl e 1,0 M HF separadamente. Os micropartículas foram moídos em etanol a 1000 rpm por 15 min, e as nanopartículas BPSi com diâmetro desejado foram coletadas via ajuste da velocidade de centrifugação.

Através do experimento de Espalhamento Dinâmico de Luz, a distribuição de diâmetro e carga de superfície da nanopartícula foram estudadas. Todas as NPs foram dispersas no meio após esterilização por ultrassom leve (5 s para dispersá-las uniformemente na solução, limpador ultrassônico SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) imediatamente antes de sua introdução às células.

Estabelecimento do Sistema de 10 Séries de Nanopartículas Autodecomponíveis

As 10 séries de nanopartículas autodecomponíveis foram sintetizadas pelas metodologias que relatamos antes, com parâmetros modificados. Em um procedimento típico, certa quantidade de AM foi primeiramente adicionada a uma mistura de etanol (75 mL) com solução de água-amônia (25%, 3,4 mL), após o que certa quantidade de TEOS foi adicionada. As NPs MB@SiO₂ de séries autodecomponíveis foram obtidas após agitação por 24 h e lavadas 3 vezes antes de serem secas. As quantidades de AM e TEOS adicionadas nos protocolos foram descritas na Tabela 1. O significado de 1,0/100 nos NPs_1,0/100 representou o inventário de AM e TEOS quando sintetizamos as nanopartículas, com 1,0 mg de AM e 100 μL de TEOS. E os significados de 1,5/100 nos NPs_1,5/100 e outros são consistentes com o de 1,0/100.

Cultura Celular

Para testar a eficiência e universalidade do indicador de pH baseado em nanopartículas autodecomponíveis, tentamos testá-lo em linhagens específicas de células cancerígenas derivadas de tumores. Assim, selecionamos linhagens de células de câncer de fígado, pulmão, cólon e melanocitoma como objetos de pesquisa. As linhagens de células de câncer de cólon humano HCT116, HCT8 e HCT15; células de câncer de fígado humano HepG-2; células de câncer de pulmão humano A549; e células de melanoma de camundongo B16 foram mantidas em meio RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado com 10% SFB inativado por calor, 2,0 g/L bicarbonato de sódio, 0,1 g/L sulfato de estreptomicina, 0,06 g/L penicilina G e 5,958 g/L HEPES. As células foram mantidas em incubadora padrão de cultura celular a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% CO₂.

Caracterizações dos 10 Sistemas de Nanopartículas Autodecomponíveis em Série

A morfologia de todas as nanopartículas em série foi caracterizada por HR-TEM com modo STEM, e mapeamento de Si foi estudado por mapeamento de elementos EDS. Análise de distribuição de tamanho de nanopartícula foi realizada pelo software ImageJ calculando os diâmetros das nanopartículas em imagens STEM selecionadas aleatoriamente. O potencial zeta das nanopartículas e o índice de polidispersidade (PDI) foram medidos pelo estudo de espalhamento dinâmico de luz (DLS), em tampões de série com valores de pH específicos. Dados foram analisados pelo SPSS15.0 e resultados estatísticos apresentados como média ± DP.

Estudo de Eficiência de Carregamento de AM e Cinética de Liberação dos 10 Sistemas de Nanopartículas Autodecomponíveis em Série

Para estudar a eficiência de carregamento de AM e cinética de liberação, a curva padrão de AM em concentrações em série foi primeiro estabelecida. A absorção de AM foi realizada por espectro UV-Vis com absorbância a 660 nm, que é o λmax do monômero AM. A eficiência de carregamento de AM foi calculada pela equação abaixo: eficiência de carregamento de AM (%) = quantidade de AM encapsulado / (quantidade total de AM inserida).

A liberação de AM das 10 séries de nanopartículas foi estudada em água pura e tampões de pH com diferentes valores de pH (pH 4,0, pH 6,86 e pH 9,18) e Solução de Lisozima (Thermo Scientific™ #90082). Além disso, a cinética de liberação de AM após duração específica em diferentes tampões de pH também foi investigada. Os valores de DO a 660 nm e as porcentagens de liberação de AM como função do tempo foram então estudados.

Em mais detalhes, os estudos de liberação de AM foram realizados pelos protocolos abaixo: dissolveram-se 10 séries de nanopartículas em 15 mL de tampão padrão de pH 4,0, 6,86 e 9,18 com solução de lisossomo, respectivamente; e realizou-se a liberação de AM em misturador Hula a 37 °C. Durante os seguintes 15 dias, 1 mL de cada amostra foi coletado, então centrifugado a 12000 rpm por 10 min. O sobrenadante e o precipitado foram medidos para seus espectros de absorção a 200–800 nm.

Além disso, a liberação de AM em tampões de pH precisos com solução de lisozima na faixa de pH de 4,1 a 5,5 também foi investigada com os mesmos protocolos acima. Durações de tempo específicas (6 h, 12 h e 24 h) foram colocadas como pontos de observação. As absorções a 660 nm foram registradas em cada amostra. A relação linear da absorção de cada solução de pH e a soma dos quadrados dos resíduos foram contadas em cada ponto de tempo, respectivamente.

Para detectar os perfis de liberação de AM em células, células HepG-2 foram cultivadas em frasco de cultura de 75 cm² e alimentadas com NPs (300 μg/mL) quando as células proliferaram a 70% do frasco. A cada 30 min depois, as células foram coletadas. As células foram repetidamente congeladas e descongeladas para liberar o AM nas células completamente. Os lisados celulares foram centrifugados a 12000 r/min por 10 min. O sobrenadante foi obtido e mediu-se sua absorbância a 660 nm para calcular a quantidade total de AM liberado. Neste estudo, células HepG2 foram escolhidas como objetos de pesquisa, devido à sua rápida proliferação celular que poderia minimizar a variância entre todos os 10 grupos testados.

Colocalização Celular das 10 Séries de Nanopartículas e Desempenho de Liberação em 6 Diferentes Linhagens Celulares

TEM celular foi empregado para estudar a colocalização da nanopartícula nos endolisossomos seguindo protocolos padrão de TEM celular. Células foram semeadas na intensidade de 1 × 10⁶ células/frasco e incubadas por 24 h, permitindo a adesão celular. Dez séries de nanopartículas em meio com a mesma concentração (100 μg/mL) foram incubadas com as células por mais 12 e 24 h, respectivamente. As células foram então lavadas por PBS 3 vezes para remover nanopartículas em excesso, então fixadas em solução de glutaraldeído 2,5% por mais de 1 dia. Células fixadas foram então lavadas e coradas por tetróxido de ósmio, 1% em água deionizada por 1 h, seguido de lavagem com PBS 3 vezes e água DI 2 vezes. Protocolo clássico de TEM celular foi realizado a seguir, e seções com espessura de 90 nm foram coletadas para observação de TEM. Liberação de AM como função de valores de pH foi estudada em 6 linhagens celulares com NPs_6/100 e NPs_7,5/80. Também, os valores de DO da liberação de AM e porcentagens de liberação de AM foram registrados para análise de dados.

Investigação da Captação Intracelular de Nanopartículas MB@SiO₂

Microscopia confocal de célula viva foi usada para avaliar a captação celular e destino intracelular das nanopartículas MB@SiO₂. Endossomos precoces de células HepG-2 foram corados (CellLight Early-endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, com excitação/emissão ~ 488/510 nm) por 16 h. E então células foram incubadas com NPs_6/100 (excitação/emissão de AM: 640/650–700 nm) na concentração de nanopartícula de 100 μg/mL em intervalos de tempo específicos (2 h, 2,5 h, 3 h, 5 h e 6 h). Antes de tirar as imagens, lisotracker foi corado com LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, excitação/emissão: 577/590 nm) por 40 min. Após isso, removeu-se a solução de corante e lavou-se as células 2–3 vezes em PBS. Imagens foram tiradas usando Microscópio Confocal Nikon A1R.

Sequenciamento de Transcriptoma para Avaliar Mudança de Expressão Gênica após Alimentação com BPSi

Extração total de RNA do grupo controle e grupo tratado com BPSi foi realizada usando reagente Trizol seguindo procedimentos operacionais padrão. A qualidade da amostra inicial de RNA total para o experimento de sequenciamento foi detectada usando espectrofotômetro NanoDrop ND-2000. RNA total que passou no controle de qualidade foi usado em experimentos de sequenciamento subsequentes. Uma comparação da expressão gênica foi realizada por sequenciamento de próxima geração. Todos os programas de sequenciamento foram realizados pela BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, China) usando plataforma BGISEQ-500. Dados brutos obtidos por sequenciamento são realizados controle de qualidade para determinar se os dados de sequenciamento são adequados para análise subsequente. Se passou, realiza-se análise quantitativa de genes baseada em níveis de expressão gênica e realiza-se análise de enriquecimento significativo de funções de ontologia gênica (GO) nos genes diferencialmente expressos entre as amostras selecionadas.

Ensaio de Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (RT-qPCR) para Confirmar Ativação da Rede Gênica TFEB-CLEAR

RNA total foi extraído das células HepG-2 cultivadas dos grupos controle e tratado com BPSi usando reagente Trizol e transcrito reversamente para cDNA usando Kit BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) com primers aleatórios. cDNA foi usado para amplificar rede gênica TFEB-CLEAR por PCR quantitativo com sistema Applied Biosystems™ 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) com actina como controle de referência. Primers usados para RT-PCR quantitativo foram listados na Tabela S4.

Ensaio de Western Blot para Confirmar que Autofagia é Ativada após Alimentação com BPSi

Proteínas celulares do grupo controle e diferentes grupos tratados com concentrações de BPSi foram extraídas por lisado RIPA (Heart Biological Technology Co., Ltd.). Inibidor de protease foi adicionado ao lisado RIPA e pré-resfriado em gelo. Lavaram-se as células 3 vezes por PBS pré-resfriado. Descartou-se o líquido completamente e colocou-se o prato em gelo por 2 min. Quatrocentos microlitros de lisado RIPA foram adicionados à superfície de todo o prato, pipetados várias vezes com pipeta, e incubados em gelo por 30 min, durante os quais o prato foi agitado várias vezes para lisar completamente as células. O fluido celular lisado foi transferido para tubos Eppendorf de 1 ml e centrifugado a 13.000 rpm por 10 min, 4 °C. O sobrenadante obtido foi fervido em água por 10 min e colocado a –20 °C para uso posterior. Concentração de proteína foi quantificada usando Kit Pierce® BCA Protein Assay (Thermo scientific).

Extratos celulares contendo 25 μg de proteína total foram submetidos diretamente a SDS-PAGE e transferidos. As membranas foram bloqueadas com 5% leite desnatado e sondadas com anticorpos primários que reconhecem P62 (Proteintech #18420–1-AP), TFEB (Proteintech #13372–1-AP), LC 3B (Abcam #ab192890) e β-actina (Proteintech #20536–1-AP). Anticorpos secundários foram escolhidos de acordo com a espécie de origem dos anticorpos primários e detectados por quimioluminescência aprimorada (Pierce) ou usando Sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS + Gel Imaging (Bio-Rad, EUA). A intensidade de banda normalizada de P62, TFEB e LC 3B relativa a β-actina foi quantificada por densitometria usando software ImageJ nos grupos BPSi, e os dados são média ± DP de três experimentos independentes.

Medição de pH Celular por PDMPO e Conjugado pHrodo™ Red Transferrin por Microscopia Confocal

Estudo PDMPO

1 × 10⁵ células HepG-2 foram cultivadas em placas confocais estéreis durante a noite e as nanopartículas BPSi foram alimentadas com concentração de 100 μg/mL. No dia seguinte, antes da imunofluorescência, lâminas foram lavadas três vezes com fosfato salino tamponado (PBS) 0,01 M, pH 7,4, então adicionou-se 1 μM corante PDMPO (Ex/Em = 329/440). Após lavagem com PBS três vezes, células foram incubadas com meio de cultura RPMI-1640 fresco e observadas sob microscópio de fluorescência (Nikon A1R, Japão) com câmera CCD e tiraram fotos dentro de 5 min, e a razão de intensidade de fluorescência azul e verde nos lisossomos foi então calculada de acordo com o procedimento de Chen et al.

Estudo do Conjugado pHrodo™ Red Transferrin

Células HepG-2 foram semeadas em placas confocais da mesma forma para adesão celular por 24 h, então mantiveram placas em gelo por 10 min. Lavaram-se as células com Solução de Imagem de Células Vivas fria contendo 20 mM glicose e 1% BSA. Adicionou-se conjugado pHrodo™ Red Transferrin (Ex/Em = 560/585 nm) a 25 μg/mL em Solução de Imagem de Células Vivas e incubou-se a 37 °C por 20 min, então lavou-se as células em Solução de Imagem de Células Vivas. A observação também foi realizada por microscopia confocal. A análise quantitativa da intensidade das imagens de microscopia foi realizada pelo software ImageJ.

Detecção de pH Lisossomal Celular

As células A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116 e B16 foram cultivadas em frasco de cultura de 75 cm² e alimentadas com NPs quando as células proliferaram a 70% do frasco, e 6 h depois, as células foram coletadas. As células foram repetidamente congeladas e descongeladas para liberar o AM nas células completamente. Os lisados celulares foram centrifugados a 12000 r/min por 10 min. O sobrenadante foi obtido e mediu-se sua absorbância a 660 nm para calcular a quantidade total de AM liberado. A absorbância dos NPs_6,0/100 em pH padrão foi comparada para obter o valor de pH de cada célula.

Análise Estatística

Análise estatística foi feita com software SPSS15.0 usando análise de variância (ANOVA) de duas vias para grupos independentes e usando método Tukey HSD para teste de comparações múltiplas. Significância estatística baseou-se em valor de P < 0,05.

Resultados e Discussão

Primeiramente detectamos expressão gênica diferencial quando células alimentadas com nanopartículas de sílica porosa preta duplamente funcionalizadas com PEG (NPs BPSi) (oferecidas pelo nosso laboratório colaborador). A mudança do potencial zeta de −18,5 para +2,8 mV também indicou que a PEGilação dupla na superfície foi bem-sucedida (Fig. S1a). O diâmetro médio das nanopartículas BPSi foi 156 nm (Fig. S1b). Baseado no mapa de calor de cluster de expressão gênica diferencial (Fig. S2), selecionamos expressões gênicas diferenciais com mais de 2 vezes para investigação adicional. GO e KEGG foram introduzidos para analisar genes diferenciais. Dos mapas de bolhas de enriquecimento GO (Fig. 1a), genes metabólicos e associados a lisossomos incluindo montagem de fagolisossomo, fagocitose e processo metabólico de xenobióticos foram selecionados para análise adicional. Notavelmente, expressões gênicas associadas a TFEB-CLEAR foram significativamente aumentadas. Resultados de RT-PCR (Fig. 1b) também verificaram resultados de sequenciamento gênico, genes na via TFEB-CLEAR (expressão lisossomal coordenada e regulação) aumentaram significativamente, como CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2 e TPP1. Estes genes foram marcados na via lisossomal, como mostrado na Fig. S3. Sua expressão é maior que a do grupo controle e tem significância estatística (P_{BPSi VS Controle} < 0,05). E TFEB regula positivamente a expressão de genes lisossomais, controla a população de lisossomos e promove degradação celular de substratos lisossomais.

Adicionalmente, TFEB regula autofagia, e sua superexpressão leva a aumento significativo na produção de autofagossomos em células cultivadas devido ao fato de que a principal função do gene TFEB é induzir a biossíntese de lisossomo e promover a ocorrência de autofagia. Análise de Western blot também foi empregada para testificar se a autofagia aconteceu quando células alimentadas com NPs BPSi. O propósito do teste Western foi confirmar ainda que a expressão de TFEB aumentou e a ocorrência de autofagia celular após alimentação com BPSi. As proteínas LC3B e P62 são ambos marcadores de autofagia. Quando autofagia ocorre, a expressão da proteína 1A/1B-light chain 3B associada a microtúbulos (LC3B) II/I aumenta. p62 é um receptor para vesículas que serão degradadas por autofagia e também receptor para agregados de proteínas ubiquitinadas a serem eliminados, e sua expressão diminui quando autofagia ocorre. Então medimos a expressão destas proteínas no experimento Western.

Dos resultados de Western blot mostrados na Fig. 1c, d, proteínas TFEB (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000008), LC3B II/I (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000297) e p62 (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000016) todas aumentaram significativamente. Como a superexpressão das proteínas TFEB e LC3B II/I indicando ativação de autofagia, suspeitamos que a endocitose de BPSi promove a ocorrência de autofagia. Porém, a proteína p62 deveria ser regulada negativamente durante o processo de autofagia, devido à natureza de proteína transportadora que trouxe endossomos a lisossomos e finalmente degradados. Em nosso estudo, a significativa superexpressão de p62 indicou terminação da degradação durante o processo de fusão endo-lisossomo, o que provavelmente causado por aumento de pH em vesículas endolisossomais. Assim, a endocitose de BPSi pode primeiro induzir ocorrência de autofagia, então inibir o processo de autofagia aumentando valores de pH endolisossomais, devido à sua alcalinidade de amida.

Para testificar as características de aumento de pH em endolisossomos por endocitose de BPSi, dois sondas fluorescentes de pH comerciais foram empregadas em nosso estudo, pHrodo™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher #P35376) e RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red como indicador comercial de pH intracelular geralmente apresenta fluorescência fraca em pH neutro mas fluorescência crescente à medida que pH cai. Supunha-se quantificar pH citosólico celular na faixa de 9–4 com pKa ~ 6,5 com excitação/emissão de 560/585 nm. Podemos obter conclusão de análise qualitativa de determinações de 6 linhagens celulares que a endocitose de NPs BPSi tem capacidade de aumentar valores de pH em endolisossomos, devido ao enfraquecimento de sinais fluorescentes vermelhos (Fig. S4 e S5). Porém, após repetir os experimentos várias vezes seguindo protocolos de operação do produto, dificilmente analisamos quantitativamente o valor exato de pH que diminuiu entre diferentes linhagens celulares antes ou depois de alimentar com NPs BPSi devido a não ter correlação entre intensidade e valores de pH estabelecida.

PDMPO foi então empregado como melhor solução para indicar mudanças de valor de pH após endocitose de BPSi, que introduz técnicas de imagem de razão em medição quantitativa de pH. PDMPO [2-(4-piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol] é caracterizado como sonda de pH ácidotrópica de dupla-excitação e dupla-emissão. Emite fluorescência verde intensa em pH mais baixo e dá fluorescência azul intensa em pH mais alto. Esta fluorescência única dependente de pH torna PDMPO uma sonda de pH ideal para organelas ácidas com pKa = 4,47. PDMPO marca seletivamente organelas ácidas (como lisossomos) de células vivas e os dois picos de emissão distintos podem ser usados para monitorar flutuações de pH de células vivas em medições de razão. Porém, ainda falhamos em medir valores de pH em 6 linhagens celulares antes e depois de alimentação com BPSi. Como resultados mostrados na Fig. S6, nenhuma diferença significativa foi observada em todas as 6 linhagens celulares antes e depois de alimentação com BPSi. Embora uma correlação tenha sido estabelecida entre Razão Azul/Verde e valores de pH (Fig. S7), correlação não linear de pH 4–5 faz o método PDMPO falhar em análise quantitativa de endolisossomos antes e depois de alimentação com BPSi.

Dos dados de dois indicadores de pH comerciais acima, primeiramente demonstramos nossa suspeita que nanopartículas decoradas com PEG com amida na cadeia PEG poderiam fazer pH endolisossomal aumentar devido à natureza alcalina da amida. Porém, sem análise quantitativa de mudanças precisas de pH (faixa 0,1 pH), ainda não podemos estabelecer correlações entre status de autofagia e valores de pH endolisossomais, falhando assim na predição de autofagia.

Baseado em nosso estudo prévio sobre nanopartículas autodecomponíveis, mantivemos a mesma concentração de hidróxido de amônio em etanol 75%, mas ajustamos concentrações de AM e TEOS. Duas séries de quantidade de TEOS foram definidas como 100 μL e 80 μL, para obter diferentes espessuras de casca e tamanho de poro. Dez séries de quantidade de AM foram definidas para obter diferentes tamanhos da estrutura central-oca e eficiências de carregamento de AM.

As quantidades de AM e TEOS adicionadas nos protocolos foram descritas na Tabela 1 abaixo.

Como mostrado na Fig. 2a, b, o tamanho da nanopartícula aumentou com o aumento da quantidade de AM, em ambas as concentrações de TEOS (100 μL e 80 μL). Na mesma concentração de AM, o tamanho da partícula aumentou com o aumento da quantidade de TEOS. Além disso, com o aumento da quantidade de TEOS, a espessura da casca cresceu, o que foi provado pelo mapeamento de elementos (mostrado como Fig. 2c). O índice de polidispersidade (PDI) e carga de superfície das nanopartículas são mostrados na Fig. S8 e Tabela S1. Estudos de morfologia predisseram que com o aumento da quantidade de AM, a eficiência de carregamento crescerá, levando a perfil de liberação mais rápido, enquanto com o aumento da quantidade de TEOS, a liberação desacelerará. E precisamos descobrir a concentração apropriada de AM e TEOS, com a qual poderíamos obter sistemas de nanopartículas otimizados, que poderíamos fazer o perfil de liberação de AM linearmente correlacionado com mudanças de pH.

A eficiência de carregamento de AM foi determinada por espectro UV-Vis. A curva padrão (Fig. S9) de AM foi primeiramente traçada usando concentrações em série de solução de AM (de 6,25 a 46,88 μg/mL), com equação como y = 67,63x + 0,10919, R² = 0,9987. Como calculado com a equação acima, obtemos eficiência de carregamento de AM de 10 nanopartículas autodecomponíveis com parâmetros específicos, dados detalhados mostrados na Fig. S10.

Antes do estudo dos perfis de liberação de AM em diferentes soluções de pH, os perfis de liberação em água pura foram estudados. Como mostrado nas Fig. S11 e S12, todas as nanopartículas com quantidade de TEOS de 80 μL apresentaram liberação de AM aumentada junto com aumento da duração, refletida pela absorção UV-Vis. Além disso, com o aumento da quantidade de AM encapsulado, a tendência de crescimento de liberação de AM torna-se mais significativa. Também, a velocidade de liberação cresce mais rápido. Porém, como a quantidade de TEOS aumenta para 100 μL, a superfície da partícula tornou-se mais densa e a liberação torna-se mais lenta quando quantidade de AM abaixo de 3,0 mg; quase nenhuma tendência de aumento pôde ser observada na liberação de AM em água durante 14 dias de liberação. Desde que a quantidade de AM aumenta para acima de 4,0 mg, uma tendência de aumento óbvia de liberação de AM pôde ser observada. Uma coisa a notar é que o parâmetro de nanopartícula de ambos NPs_7,5/80 e NPs_6,0/100 apresentou crescimento sólido conforme o tempo prolonga, quase mostrou tendência de aumento linear durante os primeiros 7 dias, e então atingiu o platô.

Então, focamos no comportamento de liberação de AM em diferentes tampões de pH para descobrir se nanopartículas autodecomponíveis com parâmetros específicos poderiam ter liberação de AM linearmente dependente de pH.

Primeiramente, realizamos experimentos de liberação de AM em solução tampão pH 4,0. Da Fig. S13, pudemos facilmente concluir que com a mesma quantidade de TEOS de 100 μL, a velocidade de liberação de AM apresentou tendência similar observada nos 5 sistemas de nanopartículas de TEOS a 80 μL (Fig. S14), a correlação positiva central com a quantidade de AM encapsulado.

AM concentrado difunde para solução circundante via difusão devido a diferença de concentração. O maior gradiente de concentração faz liberação de AM mais rápida. Comparado com liberação de AM em água pura, descobrimos que ambiente ácido acelerou a liberação de AM (Fig. S13 e S14 comparado com Fig. S11 e S12), indicando que a liberação de AM não é apenas impulsionada por difusão; porém, em soluções ácidas, repulsão eletrostática também é uma força motriz importante devido à natureza de carga positiva de AM. Então calculamos a porcentagem de liberação de cada parâmetro de nanopartícula de acordo com eficiência de carregamento de AM, curva padrão de AM e razão de diluição nas medições. A porcentagem de liberação refletiu a velocidade de liberação de AM em solução ácida pH 4,0, e os resultados (Fig. 3) mostraram que apenas a porcentagem de liberação de NPs_7,5/80 apresentou liberação linear em solução pH 4,0. Outros sistemas de nanopartículas com parâmetros específicos de AM e TEOS mostraram tendências de liberação similares, e a porcentagem de liberação não teve crescimento linear. Uma exceção é NPs_6/100, e a liberação de AM atingiu o platô em apenas 72 h; assim, foi difícil dizer se a liberação de AM poderia crescer linearmente antes dessa duração neste estágio.

Enquanto isso, testamos os perfis de liberação de AM em tampões quase neutros e alcalinos (pH 6,86 e pH 9,18). Os resultados em ambas Fig. S15, S16, Fig. S17 e S18 demonstraram que a liberação de AM desacelerou com aumento do pH da solução para 6,86; além disso, com o aumento da concentração central de AM, a porcentagem de liberação de AM diminuiu. A pH 9,18, todas as nanopartículas com 10 parâmetros específicos apresentaram liberação de AM muito lenta (Fig. S19 e S20); não importa em absorção UV-Vis ou porcentagem de liberação, a tendência foi similar à do tampão pH 6,86, mas com porcentagem de liberação ainda menor. Então, ficou claro que as nanopartículas autodecomponíveis só apresentaram crescimento linear de liberação de AM em soluções ácidas. Pensamos de volta ao pH endolisossomal, de 4 a 5, que é exatamente a faixa de pH de crescimento linear de AM como função do tempo em parâmetro específico de AM/TEOS. Assim, ficamos mais confiantes que o sistema de nanopartículas autodecomponíveis pode ser uma ferramenta de medição precisa para determinação quantitativa do pH médio endolisossomal, então fornecer evidência sobre o valor exato de pH do status de autofagia.

A pré-condição de usar nanopartículas autodecomponíveis específicas como indicador de pH endolisossomal é que as nanopartículas permaneçam estáveis no endolisossomo durante todo o processo de medição. Em segundo lugar, a liberação de AM no endolisossomo deve ocorrer suavemente quando a medição realizada.

A colocalização da nanopartícula nos endolisossomos por estudo de TEM celular e a liberação de AM em 6 diferentes linhagens celulares foram estudadas. Dos resultados de TEM celular, todas as 10 séries de nanopartículas permaneceram nos endolisossomos sem escapar, após incubação de 24 h com células HepG-2 (Fig. 4). Como o diâmetro de células HepG2 usadas na Fig. 4 é cerca de 10–20 μm e o diâmetro de nanopartículas MB@SiO₂ está entre 75 e 200 nm, será muito difícil clarificar as morfologias das nanopartículas usando imagens com baixa ampliação (como mostrado na Fig. S21). Também investigamos a localização intracelular das nanopartículas nas outras 5 linhagens celulares, e 4 nanopartículas foram selecionadas aleatoriamente para demonstrar que as nanopartículas foram aprisionadas nos endolisossomos (Fig. S22). As nanopartículas com todos os parâmetros mostraram estrutura central-oca em todas as outras 5 linhagens celulares após incubação de 24 h, indicando liberação de AM. Além disso, sob observação mais precisa, notamos que a liberação de AM pode ser diferente devido a diferentes tamanhos ocos, apontando para o fato de que (1) o pH endolisossomal em diferentes células é diferente e (2) a liberação de AM das nanopartículas é muito sensível ao pH endolisossomal, especialmente para NPs_6/100 e NPs_7,5/80. Da Fig. S23, podemos encontrar que as nanopartículas já realizaram endocitose e permaneceram nas vesículas 2 h após alimentação de nanopartículas, então nanopartículas gradualmente se acumularam em lisossomos.

Então avaliamos a correlação entre valores de pH e valores de DO em pH 4,0–4,8. Dos resultados na Fig. 5 e Fig. S24, para sistemas de nanopartículas NPs_6/100 e NPs_7,5/80, a liberação de AM apresentou diminuição linear como função de pH na faixa de pH de 4,0 a 4,8.

Então convertemos o valor de DO para porcentagem de liberação de AM de acordo com eficiência de carregamento de AM e quantidade de alimentação. Como mostrado na Fig. S25, nas primeiras 6 h, a porcentagem de liberação de AM nos sistemas de nanopartículas NPs_6/100 e NPs_7,5/80 também apresentou como função de valores de pH. Então calculamos a soma dos quadrados dos resíduos e coeficiente de correlação de Pearson em duração de liberação de 6 h e 12 h, respectivamente, como a soma dos quadrados dos resíduos apresenta correlação negativa com proximidade do ajuste linear, enquanto mais próximo o valor absoluto do coeficiente de correlação de Pearson a 1, mais linear é. Como mostrado nas Tabelas S2 e S3, o maior grau de linearidade é o ajuste do sistema de nanopartículas NPs_6,0/100, seguido pelo de NPs_7,5/80 na liberação de 6 h.

Até então, estávamos tão animados com os resultados que o método para monitorar precisamente os valores de pH foi estabelecido, especialmente com precisão menor ou igual a intervalo de 0,1 valor de pH. Isso significa que temos grandes possibilidades de descobrir a correlação entre valores de pH endolisossomais e status de autofagia, o que é de grande significado para melhor estudar o mecanismo de autofagia e prever o processo de autofagia. Como podemos ver na Fig. S26, a liberação de AM em células HepG-2 já atingiu o platô após incubação por 4 h. Assim, escolhemos 6 h como ponto de observação.

Então investigamos cuidadosamente a liberação de AM de NPs_6,0/100 em 6 linhagens celulares na duração de interação nanopartícula-célula de 6 h, incluindo linhagem de câncer de fígado HepG-2, linhagens de câncer de cólon HCT8, HCT 15 e HCT 116, linhagem de câncer de pulmão A549 e linhagem de câncer miomelanocítico B16.

Como mostrado na Tabela 2, diferenciamos claramente os endolisossomos em 6 linhagens de células cancerígenas, com precisão em 0,01 valores de pH, o que é impossível de ser feito com kits comerciais de indicador de pH intraocular.

Além disso, reavaliamos valores de pH em endolisossomos de células HepG2 antes e depois de cultivadas com nanopartículas BPSi. Chegamos à conclusão que a captação de BPSi aumenta significativamente os valores de pH endolisossomais, de 4,70 ± 0,09 para 5,59 ± 0,05, ilustrando perfeitamente a razão para BPSi captado induzir autofagia inicialmente então terminar fluxo autofágico. A captação intracelular de BPSi faz as quantidades de endolisossomos aumentarem, o que foi consistente com resultados de sequenciamento gênico, que genes relacionados à autofagia (TFEB-CLEAR) foram ativados. Enquanto isso, a terminação da autofagia pelos valores de pH aumentados em endolisossomos também coincide com resultados de superexpressão de proteínas p62 no estudo de Western blot.

Discussão

Nanopartículas podem geralmente causar autofagia em células, e estudos mostraram que a resposta autofágica a nanopartículas apresentando superfície neutra ou aniônica envolve eliminação aprimorada de carga autofágica. Exposição celular a nanopartículas apresentando superfície catiônica, por outro lado, resulta em regulação transcripcional ascendente da via TFEB, mas também causa disfunção lisossomal, resultando finalmente em bloqueio do fluxo autofágico. E nossos resultados são consistentes com estas conclusões prévias. Em nosso estudo, descobrimos que a expressão de genes e proteínas relacionadas à autofagia em células HepG2 foi aumentada após alimentação de nanopartículas BPSi através de sequenciamento de transcriptoma, RT-qPCR e experimentos Western. Porém, o nível de expressão da proteína P62 relacionada à autofagia não diminui como a autofagia é ativada. Suspeitamos que o PEG-amina na superfície das nanopartículas BPSi eleva o valor de pH do lisossomo, resultando em inibição da degradação de P62. Indicadores de pH lisossomal existentes não podem verificar nossa suposição. Para medir precisamente o pH lisossomal de células vivas, estabelecemos novo método para determinação qualitativa de pH endolisossomal baseado em sistemas de nanopartículas autodecomponíveis. Dez sistemas de nanopartículas com parâmetros específicos de AM/TEOS foram empregados para obter método de medição responsivo a pH sensivelmente otimizado. O gradiente de concentração radial de AM de dentro para fora serviu como força motriz principal para liberação de AM. A liberação do fármaco prosseguiu com decomposição simultânea do carreador, impulsionada por mecanismo controlado por difusão. Além disso, à medida que o valor de pH diminui, a concentração de íons de hidrogênio aumenta, e a interação eletrostática aprimorada promove AM interno a liberar mais rápido que em solução neutra. O sistema otimizado de nanopartículas central-ocas pôde liberar o AM concentrado central como função linear de valores precisos de pH na faixa de pH 4,0–4,8, que é exatamente o pH dos lisossomos. Finalmente, por este indicador de pH qualitativo baseado em nanopartículas autodecomponíveis, conseguimos na detecção dos valores médios de pH de lisossomos em 6 linhagens celulares. Além disso, por este sistema, podemos diferenciar qualitativamente as mudanças de pH de lisossomos antes e depois de endocitose de nanopartículas BPSi por células HepG-2, esclarecendo o mecanismo de ocorrência e então terminação da autofagia após endocitose de BPSi. Os sistemas de nanopartículas autodecomponíveis abrem um caminho totalmente novo para estudo de valores de pH luminal, fornecendo novas ferramentas para melhor conhecer sinalização celular e metabolismo, e então fornecendo novos caminhos e métodos para tratamento de câncer.

Conclusão

Neste estudo, descobrimos que BPSi pode promover autofagia celular através de sequenciamento de transcriptoma, mas os grupos amino na superfície das nanopartículas podem aumentar o pH do lisossomo e inibir a degradação do fluxo autofágico. Assim, o pH lisossomal influencia significativamente os estágios da autofagia. E adquirir precisamente a informação de pH lisossomal promoverá a percepção da autofagia. Porém, indicadores fluorescentes de pH lisossomal existentes só podiam determinar uma faixa ampla de pH lisossomal; assim, estabelecemos um indicador preciso de pH lisossomal baseado no sistema de autodissociação. Ajustando os parâmetros de síntese de MB@SiO₂, a liberação de AM carregado nas nanopartículas foi linear e negativamente correlacionada com pH. E as nanopartículas permanecem principalmente no lisossomo após entrar na célula. Medindo a quantidade de AM liberado nas células, o valor de pH do lisossomo pode ser calculado exatamente de acordo com a função linear. O indicador de pH preciso estabelecido forneceu uma ferramenta e metodologia totalmente nova para estudar precisamente os valores de pH lisossomal e adquirir mais informação sobre autofagia.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informação suplementar.

Abreviações

BPSi:

Silício mesoporoso preto

SFB:

Soro bovino fetal

GO:

Ontologia gênica

HCl:

Ácido clorídrico

KEGG:

Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto

AM:

Azul de metileno

NaBr:

Brometo de sódio

NaSi:

Siliceto de sódio

NH4Br:

Brometo de amônio

NPs:

Nanopartículas

DO:

Densidade óptica

PBS:

Salino fosfato tamponado

PDMPO:

2-(4-Piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-laminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol

RT-qPCR:

Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa

TEOS:

Ortossilicato de tetraetila