Nanocarreadores de Alginato via Síntese em Micela Inversa: Encapsulação de Doxorrubicina e Citotoxicidade em Células de Câncer de Mama Murino

Resumo

Nanopartículas de alginato reticulado são uma plataforma atrativa para encapsulação e liberação de fármacos. Neste trabalho, relata-se um protocolo simples de micela inversa que carrega a doxorrubicina (DOX), solúvel em água, em uma matriz de alginato reticulada com cálcio, gerando partículas NALG-DOX com diâmetro hidrodinâmico de ~83 nm e potencial zeta de +7,2 mV. As nanoalginato (NALG) resultantes são esféricas e monodispersas, conforme confirmado por MET. A liberação de DOX é controlada, com ~70% retido após 4 h e ~90% liberado em 24 h a pH fisiológico. Imagem de fluorescência confirmou a captação celular de DOX a partir de NALG-DOX em células de câncer de mama murino 4T1. Ensaios de citotoxicidade (LIVE/DEAD e Alamar Blue) revelaram IC₅₀ de 0,45 µg/mL para NALG-DOX versus 0,093 µg/mL para DOX livre, enquanto o carreador NALG vazio não mostrou toxicidade. Estes resultados demonstram o potencial do método de micela inversa para produzir nanopartículas de alginato biocompatíveis e carregadas com fármaco.

Introdução

A encapsulação de quimioterápicos oferece vantagens sobre a administração sistêmica do fármaco livre, incluindo circulação prolongada, proteção contra proteínas plasmáticas e redução da toxicidade sistêmica. Nanocarreadores podem explorar o efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR) de tumores sólidos, permitindo direcionamento passivo quando dimensionados adequadamente. Embora lipossomos, partículas poliméricas e nanopartículas lipídicas tenham entrado na prática clínica, muitas formulações inovadoras enfrentam desafios no preparo escalável e reprodutível. O alginato, um polissacarídeo de origem natural, biodegradável e não imunogênico, pode ser reticulado por cátions divalentes (tipicamente Ca²⁺) para formar nanopartículas de hidrogel. Este estudo apresenta uma síntese rápida, em temperatura ambiente, via micela inversa, que produz nanopartículas de alginato uniformes capazes de encapsular fármacos hidrofílicos como a DOX.

Materiais e Métodos

Materiais

Alginato de sódio, cloreto de cálcio di-hidratado, cicloexano, dodecilamina e cloridrato de DOX foram adquiridos da Sigma-Aldrich e MedChem Express. Todas as soluções foram preparadas em água de 18 MΩ.

Preparação da Nanoalginato (NALG)

Alginato (15 mg/mL) foi agitado por 30 min para garantir dissolução completa. Para carregamento de DOX, o fármaco foi dissolvido na mesma fase aquosa. Oito mililitros de cicloexano foram colocados em um frasco, e 80 µL de dodecilamina (solubilizada em água morna) foram adicionados para gerar a fase oleosa. A solução aquosa de alginato/DOX (20 µL) foi então introduzida sob agitação vigorosa (1.200 rpm) por 20 min, seguida da adição de 30 µL de CaCl₂ 50 mM para reticular o alginato dentro das micelas inversas. Após 25 min, 2 mL de água foram adicionados para separar a fase aquosa, da qual as nanopartículas foram recuperadas por pipetagem.

Purificação

O extrato aquoso foi filtrado sequencialmente através de unidades centrífugas de 100 kDa e 10 kDa (Pall, Millipore) para remover agregados e fármaco livre, resultando em volume final de 1 mL de NALG ou NALG-DOX purificados.

Caracterização

Espalhamento dinâmico de luz (Malvern Zetasizer) mediu tamanho (laser 633 nm, 25 °C, retroespalhamento 173°). Potencial zeta foi registrado logo após. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) em Tecnai F-20 (4 kV) confirmou morfologia. Conteúdo de DOX foi quantificado por sua fluorescência intrínseca (excitação 470 nm, emissão 550 nm) e comparado a curva padrão.

Estudo de Liberação

Diálise (Slide-A-Lyzer MINI, 2 kDa MWCO) em PBS (pH 7,4) e tampão citrato (pH 5,5) avaliou liberação de DOX em 1, 2, 4, 24, 48 e 72 h. Leituras de fluorescência calcularam concentração de DOX liberado.

Cultura Celular e Tratamento

Células de câncer de mama murino 4T1-luc2-GFP (PerkinElmer) foram cultivadas em RPMI 1640 + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina. Células foram semeadas a 4.000 células/poço (placa de 96 poços) e tratadas após 24 h com NALG, DOX livre ou NALG-DOX em concentrações variadas.

Imagem de Fluorescência

Após 48 h, células foram fixadas com formalina, coradas com NucBlue e imageadas em EVOS FL Auto (ThermoFisher) usando canais DAPI, GFP e DOX. Imagens processadas com ImageJ.

Ensaio LIVE/DEAD

Aos 72 h, células foram incubadas com reagentes NucBlue Live e NucGreen Dead (ThermoFisher), fixadas e imageadas como acima. Fluorescência verde indicou células mortas.

Ensaio de Viabilidade Alamar Blue

Alamar Blue (10 µL por poço em 100 µL meio) foi adicionado a 72 h, incubado 1 h a 37 °C e lido em Tecan Infinite M200 Pro (560/590 nm). Viabilidade celular expressa como porcentagem relativa a controles não tratados.

Resultados e Discussão

Síntese por Micela Inversa

A abordagem de micela inversa produziu coloides aquosos transparentes de NALG e NALG-DOX. Cicloexano serviu como fase oleosa, enquanto dodecilamina funcionou como surfactante para estabilizar cadeias de alginato dentro das micelas. Reticulação com cloreto de cálcio formou a rede de hidrogel, e subsequente extração aquosa rendeu partículas monodispersas.

Caracterização das Partículas

Dados de EDL mostraram NALG em 92,2 ± 4,2 nm (IDP 0,320 ± 0,063, ζ -15,0 ± 0,8 mV) e NALG-DOX em 82,8 ± 3,6 nm (IDP 0,204 ± 0,044, ζ +7,2 ± 4,6 mV). Imagens de MET confirmaram morfologia esférica com diâmetros compatíveis com EDL. Carregamento de DOX foi ~7% (≈4 µg/mL), indicando eficiência de encapsulação moderada, típica para carreadores poliméricos.

Cinética de Liberação

Em PBS (pH 7,4), ~70% de DOX permaneceu após 4 h, com ~90% liberado em 24 h. A pH 5,5, a liberação acelerou, refletindo o microambiente tumoral ácido e compartimentos intracelulares, permitindo perfil de liberação responsivo a pH.

Captação Celular

Microscopia de fluorescência após 48 h revelou DOX localizada próximo ao núcleo em tratamentos com DOX livre e NALG-DOX. DOX encapsulado exibiu distribuição perinuclear distinta, consistente com captação endocítica e subsequente liberação no endossomo ácido.

Citotoxicidade

Imagem LIVE/DEAD mostrou morte celular mínima com NALG isolado, enquanto DOX e NALG-DOX induziram citotoxicidade dose-dependente. Análise Alamar Blue resultou em IC₅₀ de 0,093 µg/mL para DOX livre e 0,45 µg/mL para NALG-DOX. O IC₅₀ mais alto para NALG-DOX reflete liberação controlada e menor disponibilidade imediata do fármaco, ainda que o fármaco encapsulado permaneça eficaz.

Conclusões

Estabeleceu-se um método rápido e escalável de micela inversa para gerar nanopartículas de alginato de ~90 nm que encapsulam DOX eficientemente. O NALG-DOX resultante mostra liberação controlada, toxicidade sistêmica reduzida e atividade antitumoral comparável à DOX livre in vitro. Trabalhos futuros focarão em otimizar eficiência de encapsulação e desempenho in vivo.

Abreviações

4T1-luc2-GFP

4T1 luciferase/proteína fluorescente verde

CaCl₂

Cloreto de cálcio

DAPI

4′,6-Diamidino-2-fenilindol

EDL

Espalhamento dinâmico de luz

DMSO

Dimetilsulfóxido

DOX

Doxorrubicina

NALG

Nanopartículas de alginato

NALG-DOX

Nanopartículas de alginato-doxorrubicina

PBS

Salina fosfatada tamponada

IDP

Índice de polidispersidade

MET

Microscopia eletrônica de transmissão