Nanoalginatos via síntese de micela inversa:encapsulação de doxorrubicina e citotoxicidade do câncer de mama

Resumo

Nanopartículas de biopolímero reticulado fornecem uma plataforma conveniente para encapsulação e distribuição terapêutica. Aqui, apresentamos um processo robusto de micela inversa para carregar drogas solúveis em água em uma matriz de alginato reticulado de cálcio. A utilidade dos transportadores de nanoalginato (NALG) resultantes foi avaliada por uma formulação de doxorrubicina (DOX) (NALG-DOX) e avaliando sua potência em células de câncer de mama (4T1). Este processo de síntese fácil produziu partículas contendo doxorrubicina de ~ 83 nm por tamanho hidrodinâmico e potencial zeta de ~ 7,2 mV. A microemulsão de ciclohexano / dodecilamina produziu nanopartículas esféricas e uniformes conforme observado por microscopia eletrônica. A absorção da droga da formulação NALG-DOX em células 4T1 foi observada por microscopia de fluorescência empregando a fluorescência inerente da doxorrubicina. A eficácia terapêutica do NALG-DOX contra células 4T1 foi demonstrada qualitativamente por meio de um ensaio de fluorescência LIVE / DEAD e quantitativamente via ensaio de viabilidade celular (Alamar Blue). Além disso, IC ₅₀ os valores foram determinados, com a doxorrubicina encapsulada tendo um valor ligeiramente superior. Nenhuma toxicidade do transportador NALG vazio foi observada. No geral, esses resultados demonstram a utilidade deste processo de síntese para encapsulação de terapêutica hidrofílica e NALG para funcionar como um transportador de droga.

Histórico

O encapsulamento de cargas úteis terapêuticas oferece muitas vantagens em relação à administração sistêmica de medicamentos gratuitos na corrente sanguínea. O aumento do tempo de circulação [1,2,3], a proteção contra as proteínas plasmáticas [4] e a menor toxicidade sistêmica [5, 6] alcançada pela entrega de nanocarreadores podem melhorar significativamente a eficácia terapêutica. Além disso, a permeabilidade e retenção aumentadas de tumores sólidos podem ser potencializadas para direcionamento passivo se a terapêutica for encapsulada em portadores de tamanho ou tipo apropriado [7,8,9]. Numerosos produtos terapêuticos foram incorporados em nanocarreadores, incluindo doxorrubicina (DOX) [6, 10,11,12], cisplatina [13, 14] e paclitaxel [15,16,17]. Além disso, muitas tecnologias de carreadores, como lipossomas [18,19,20,21], carreadores baseados em polímero [15, 22,23,24,25] e nanopartículas de lipídeos [26,27,28,29], começaram tendo um impacto nos resultados clínicos. No entanto, a tradução de novas formulações é frequentemente dificultada por desafios na preparação e processamento desses compostos. Aqui, apresentamos um método simples, confiável e robusto de produção de nanocarreadores de alginato biocompatíveis, capazes de encapsular agentes quimioterápicos hidrofílicos.

Biopolímeros têm sido usados ​​para encapsular terapêuticas em parte devido à sua facilidade de uso e sua natureza biocompatível [30]. Os polímeros usados ​​incluem alginato [31, 32], heparina [33, 34], quitosana [35, 36] e carragenina [37, 38], entre outros. O alginato, um polímero derivado naturalmente, é composto por quantidades variadas de resíduos de β-d-manuronato e α-l-guluronato ligados por ligações 1,4-glicosídicas [39] (blocos M e G, respectivamente). O alginato pode ser reticulado através da adição de cátions multivalentes, dos quais o cálcio é comumente usado [40,41,42]. A presença de cálcio pode levar à formação de estruturas compactadas maiores entre os blocos G ligados, conhecidas como estruturas de “caixa de ovo” [43]. A reticulação dos filamentos de alginato em solução cria um hidrogel. Outros polímeros, como a quitosana [43,44,45], influenciam as propriedades estruturais da partícula. Os grupos hidroxila e ácido carboxílico nas cadeias de alginato conferem uma carga geral negativa às estruturas montadas do polímero [14, 46]. Ao ligar os ácidos carboxílicos e formar uma matriz tridimensional, a terapêutica pode ser aprisionada.

A doxorrubicina é um quimioterápico amplamente utilizado no tratamento de vários tipos de câncer [47]. O principal mecanismo de ação da doxorrubicina envolve a associação com enzimas associadas à replicação, o que permite a intercalação em fitas de DNA. Também é capaz de inserção direta na fita de DNA. O resultado é a interrupção do processo de replicação, o que impede a proliferação celular e leva à apoptose [48]. Além desse mecanismo, a doxorrubicina está associada à geração de espécies reativas de oxigênio na célula [48, 49]. A doxorrubicina é altamente eficaz [6, 50], mas tem efeitos tóxicos graves envolvendo vários órgãos, incluindo o coração [51, 52], cérebro [53], fígado [47] e rins [54]. O encapsulamento pode levar à redução da toxicidade sistêmica, com o doxil lipossomal tornando-se um sucesso bem conhecido [7].

O alginato é uma substância de baixo custo, biocompatível, biodegradável e de fácil obtenção, sendo geralmente considerado não imunogênico [55, 56]. Nanopartículas de hidrogel formadas por alginato reticulado têm sido utilizadas para a encapsulação de várias terapêuticas [56]. Esses processos variam desde a formação de micelas inversas conduzida por surfactante [39] até estímulos mecânicos ou formação de partículas induzida pela temperatura [41]. Apresentamos um meio simples e robusto de produzir nanocarreadores de alginato relativamente monodispersos. Este processo de síntese é realizado à temperatura ambiente (ao contrário do apresentado por Machado et al.) E pode ser realizado em apenas algumas horas. O processo de micela inversa incorpora terapêutica solúvel em água na matriz de alginato, sem a necessidade de modificação química. Medições de espalhamento dinâmico de luz (DLS) das nanopartículas de alginato mostraram distribuições uniformes de partículas ~ 80-90 nm. A microscopia eletrônica confirmou os tamanhos e a morfologia esférica áspera das partículas. A doxorrubicina encapsulada na matriz de alginato das nanopartículas mostra eficácia in vitro distinta em relação à doxorrubicina livre, indicando que estudos futuros podem investigar a eficácia da terapêutica in vivo.

Métodos

Materiais

O alginato de sódio, cloreto de cálcio di-hidratado, ciclo-hexano (99,9%) e dodecilamina (98%) foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O cloridrato de doxorrubicina foi adquirido na MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Estes reagentes foram usados ​​como estão, com dissolução de alginato de sódio e a terapêutica em água conforme indicado. Toda a água era água filtrada 18 MΩ fornecida a partir de uma fonte Milli-Q.

Preparação de nanoalginatos

O alginato de sódio foi dissolvido em um frasco de vidro a 15 mg / mL em água e misturado por meio de uma barra de agitação por pelo menos 30 minutos antes do uso. O DOX foi dissolvido nesta fase aquosa se fosse incorporado no nanocarrier. A solução de alginato foi verificada quanto à dissolução completa do pó de alginato antes do uso na síntese. Sem a introdução de um cátion multivalente, a fase aquosa de alginato permanece homogênea por semanas. Oito mililitros de ciclohexano foram pipetados para um frasco. A dodecilamina, um sólido à temperatura ambiente, foi aquecida sob água morna por alguns minutos, até que parte do sólido se convertesse na forma líquida. Em seguida, 80 μL de dodecilamina foram pipetados para o ciclohexano. Uma barra de agitação foi adicionada ao frasco de vidro e a mistura foi então agitada a 125 rpm. Após 5 min de mistura, a fase orgânica foi considerada bem misturada e pronta para adição da fase aquosa. Vinte microlitros da fase aquosa de alginato foram adicionados à fase orgânica ciclo-hexano / dodecilamina. A taxa de agitação foi aumentada para 1200 rpm. A mistura ocorreu sob agitação constante durante 20 min. Trinta microlitros de solução de cloreto de cálcio 50 mM foram então adicionados à mistura. Após 25 min de mistura / gelificação das partículas, 2 mL de água foram adicionados à mistura, criando uma camada aquosa por baixo da camada orgânica. As nanopartículas se separaram na fase aquosa, e uma pipeta de 1 mL foi usada para remover a camada aquosa.

Purificação de NALG

A camada aquosa foi centrifugada em uma unidade de filtro centrífugo de 100 kDa (Pall) por 10 min a 3200 × g em uma centrífuga para remover grandes agregados, e o permeado foi transferido para uma unidade de 10 kDa (Millipore). A solução foi então centrifugada por 5 min na mesma velocidade para filtrar pequenas impurezas. Adicionou-se água e centrifugou-se durante 5 minutos para lavar o retido. O volume final de 1 mL foi coletado e a caracterização foi realizada neste produto.

Caracterização do NALG

A solução filtrada de nanopartículas foi transferida para uma cubeta (Malvern Instruments, DTS 1070 zeta cell) para medição dinâmica de espalhamento de luz. A distribuição de tamanho foi determinada usando um Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, UK). As medições de tamanho foram realizadas usando um laser de comprimento de onda de 633 nm a 25 ° C com um método de detecção de ângulo de retroespalhamento de 173 °. As medições do potencial zeta para as nanopartículas de alginato foram realizadas na mesma cubeta imediatamente após a medição do tamanho. As medições de tamanho e potencial zeta foram realizadas em triplicata, e os resultados apresentados indicam a média ± desvio padrão dos três ensaios. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi usada para confirmar o tamanho das nanopartículas e investigar sua morfologia. As imagens TEM foram adquiridas usando um microscópio eletrônico de transmissão Technai F-20 operando a 4200 eV. A preparação das grades TEM envolveu a deposição gota a gota de 10 μL de solução de nanopartículas pós-filtrada na superfície de cobre da grade TEM formavar / com suporte de carbono (Ted Pella). Grades TEM úmidas foram colocadas cobertas em um dessecador durante a noite antes da imagem para garantir a secagem adequada.

A doxorrubicina tem fluorescência intrínseca, que pode ser usada para comparar a fluorescência das nanopartículas de alginato de doxorrubicina (NALG-DOX) a uma curva padrão de DOX para estimar sua concentração. Usamos comprimentos de onda de excitação / emissão de 470/550 nm. A liberação de doxorrubicina a partir de soluções NALG-DOX foi determinada por diálise da solução de nanopartículas filtrada final em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH 7,4 ou tampão citrato em pH 5,5. Dois conjuntos de cinco lotes de NALG-DOX foram preparados conforme descrito anteriormente, com uma concentração inicial de DOX de 1,25 mg / mL na fase aquosa de alginato. Dezoito dispositivos de diálise Slide-A-Lyzer MINI (ThermoFisher) com um volume interno de 100 μL e um peso molecular de corte de 2 kDa foram preparados adicionando 100 μL de NALG-DOX a cada dispositivo. Cada dispositivo foi colocado em um frasco de cintilação contendo 20 mL de tampão. Uma barra de agitação foi adicionada a cada frasco contendo tampão, e todos os frascos foram colocados em uma placa de agitação para agitação suave durante o experimento. Os frascos foram cobertos para reduzir a perda do tampão por evaporação e para proteger da luz. Em cada ponto de tempo (1, 2, 4, 24, 48, 72 h), três dispositivos foram removidos, 100 μL da amostra foram removidos de cada dispositivo e colocados em um poço separado, e uma medição de fluorescência foi feita em um Tecan Leitor de microplaca Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG) a 470/550 nm. As medições de fluorescência foram comparadas às medições de uma curva padrão e alíquotas iniciais tomadas antes do experimento para determinar a concentração e a quantidade de perda de DOX para o tampão.

Cultura de células e dosagem

Células de câncer de mama murino, Bioware Ultra Green Cell Line 4T1 luciferase / proteína fluorescente verde (4T1-luc2-GFP, adenocarcinoma de camundongo) e nenhuma célula repórter 4T1 foram obtidas de PerkinElmer (Waltham, MA). Estas células foram mantidas com meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina em 5% de CO ₂ incubadora operando a 37 ° C. As células 4T1 foram semeadas a 4000 células / poço em uma placa de fundo transparente de parede preta de 96 poços. Vinte e quatro horas após a semeadura nos poços, o meio inicial foi aspirado e a formulação de fármaco / meio foi introduzida.

Imagens de fluorescência

Em 48 h, o meio foi aspirado, as células foram lavadas três vezes com PBS e formalina foi adicionada aos poços. Após 30 min de incubação à temperatura ambiente, as células foram novamente lavadas três vezes com PBS, e duas gotas de reagente ReadyProbes de células fixas NucBlue (ThermoFisher) por mililitro de meio foram adicionadas aos poços. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, as células foram novamente lavadas três vezes com PBS. Em seguida, 100 μL de PBS foram adicionados às células fixadas e as placas foram transferidas para um EVOS FL Auto Cell Imaging System (ThermoFisher). Uma objetiva × 20 foi usada para obter imagens de partes de certos poços em cada placa. Uma imagem de cada canal de fluorescência foi gravada separadamente; uma imagem azul para 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), uma imagem vermelha para DOX (usando o canal RFP para capturar a fluorescência intrínseca) e uma imagem verde para GFP. As células 4T1-luc2-GFP expressam a proteína fluorescente verde, portanto, nenhuma coloração adicional foi necessária para que as células fossem visíveis no canal verde. O tratamento DOX “mancha” as células, e nenhum outro reagente é necessário para visualizá-lo no canal vermelho. O brilho / contraste das imagens foram ajustados no ImageJ.

Ensaio de viabilidade de células vivas / mortas

A avaliação qualitativa da viabilidade das células 4T1 após a coincubação com NALG, DOX e NALG-DOX foi avaliada usando um ensaio de viabilidade celular LIVE / DEAD (ThermoFisher). 72 h após a introdução do meio carregado de droga, o meio foi aspirado e as células foram lavadas três vezes com PBS. O ensaio LIVE / DEAD foi realizado adicionando duas gotas de cada conta-gotas de NucBlue Live Reagent e NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) por mililitro de meio. Mais três lavagens com PBS foram realizadas após 30 min de incubação e formalina foi adicionada aos poços para fixar as células. Mais três lavagens com PBS seguiram a formalina e uma quantidade final de 100 μL de PBS foi adicionada a cada poço. Imagens semelhantes foram realizadas conforme declarado, mas o canal verde agora indicava a presença de células mortas, pois as membranas celulares comprometidas permitiam que o reagente verde entrasse na célula.

Ensaio de viabilidade de células vivas / mortas

A avaliação quantitativa da viabilidade de células 4T1 após a coincubação com NALG, DOX e NALG-DOX foi avaliada usando o ensaio de viabilidade de células Alamar Blue (ThermoFisher). 72 h após a introdução do meio carregado de droga, o meio foi aspirado. O ensaio Alamar Blue foi realizado adicionando 10 μL de reagente Alamar Blue a cada poço com 100 μL de novo meio e incubado por 1 h a 37 ° C. Após 1 h, a viabilidade celular foi determinada para cada poço usando um leitor de microplaca Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG). Os comprimentos de onda de excitação / emissão foram definidos para 560/590, as configurações de ganho ideais foram determinadas para a placa pelo software e um protocolo de leitura de fundo foi usado para ler a intensidade de fluorescência para cada poço na placa. A% de viabilidade celular pode ser determinada a partir da leitura da intensidade de fluorescência através da equação:
$$ \% \ mathrm {cell} \ \ mathrm {viabilidade} =\ frac {\ mathrm {fluorescência} \ \ mathrm {intensidade} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {poço}} {\ mathrm {fluorescência} \ \ mathrm {intensidade} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {no} \ \ mathrm {tratamento} \ \ mathrm {bem}} \ ast 100 \% $$

Resultados e discussões

Processo de Emulsão de Micela Inversa

Neste trabalho, um carreador de nanoalginato, NALG, foi preparado por meio de um processo de emulsão de micela inversa, conforme ilustrado na Fig. 1. Alginato aquoso foi adicionado a uma fase de óleo de ciclohexano / dodecilamina, que forma as micelas inversas. O alginato foi então reticulado com adição de cloreto de cálcio (CaCl ₂ ) solução. Após o tempo passado para permitir a reticulação do alginato dentro das micelas inversas, o NALG foi extraído por adição de água. Finalmente, os filtros centrífugos removeram os contaminantes latentes e ajudaram a estreitar a distribuição do tamanho das nanopartículas. O produto final foi uma solução coloidal aquosa transparente.

Processo de formulação para formação de NALG e NALG-DOX. a Representação esquemática do processo de síntese de micelas inversas. As cadeias de alginato aquosas são reticuladas em banho orgânico (parte superior), extraídas para uma fase aquosa (parte inferior esquerda) e, em seguida, filtradas para purificação (parte inferior direita). b Interação molecular de Ca ²⁺ reticulação, levando à formação de NALG. c Fotografia da síntese em vários pontos, da esquerda para a direita, emulsão antes do CaCl ₂ adição, emulsão após CaCl ₂ adição e separação após adição de água

Os componentes do sistema de emulsão de micela inversa foram determinados com base em dados experimentais e literatura anterior. Para estreitar os graus de liberdade no sistema, escolhemos o ciclohexano para a fase orgânica. Na otimização desse processo, testamos uma série de surfactantes quanto à capacidade de formar partículas de alginato em nanoescala, indicada por um aumento na turbidez da mistura orgânica após a introdução de uma pequena quantidade de fase aquosa durante a agitação. A dodecilamina era uma candidata adequada e foi escolhida como o surfactante a ser usado no futuro. A água foi escolhida como a fase aquosa nos experimentos aqui apresentados.

Caracterização de NALG

Na Fig. 2a, b, a distribuição dos tamanhos hidrodinâmicos das nanopartículas para NALG e NALG-DOX são mostrados. As nanopartículas, vazias ou carregadas terapeuticamente, mostraram picos semelhantes centrados em torno de 90 nm. Os diâmetros das partículas para NALG e NALG-DOX, respectivamente, foram 92,2 ± 4,2 nm e 82,8 ± 3,6 nm. O índice de polidispersidade (PDI) para as partículas foi 0,320 ± 0,063 e 0,204 ± 0,044, e os potenciais ζ foram - 15,0 ± 0,8 mV e 7,2 ± 4,6 mV.

Distribuições de espalhamento de luz dinâmica de a NALG e b NALG-DOX mostra distribuições monodispersas de nanopartículas de alginato. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de c NALG e d NALG-DOX mostra a morfologia esférica das partículas. Barras de escala indicam 50 nm na imagem maior e 20 nm na inserção

Os tamanhos das partículas eram consistentes após a incorporação do DOX na matriz de alginato. O potencial ζ era negativo para o NALG vazio, o que era consistente com outras nanopartículas de alginato ligadas por cálcio [39]. As partículas carregadas com doxorrubicina possuíam um potencial ζ positivo. Isso pode ser devido em parte a um excesso de íons de cálcio carregados positivamente na superfície da partícula, o que pode ajudar a transmitir a carga positiva na nanopartícula. Além disso, a amina primária presente nas moléculas de DOX pode interagir eletrostaticamente com os grupos de ácido carboxílico livre no alginato, reduzindo as cargas negativas disponíveis na superfície da partícula.

A Figura 2c, d mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão de NALG e NALG-DOX reticulados com cálcio. Ambos os tipos de nanopartículas exibiram morfologia esférica. A distribuição geral das nanopartículas parecia ser semelhante em tamanho à distribuição DLS. A concentração da solução NALG-DOX final foi avaliada usando a fluorescência intrínseca da molécula de doxorrubicina. O volume do produto NALG-DOX filtrado foi dividido em conjuntos triplicados de dispositivos de diálise colocados em frascos de cintilação preenchidos com PBS e DOX foi permitido várias vezes para liberar do NALG-DOX. Inicialmente, a concentração de DOX na solução NALG-DOX era de ~ 4 μg / mL, indicando que a eficiência de encapsulação, ou razão de DOX em NALG-DOX para DOX inicial adicionado à formulação, para o NALG-DOX é de ~ 7%. Embora essa eficiência de encapsulamento seja considerada baixa em comparação com partículas semelhantes [57], isso é provavelmente devido ao DOX inicial presente na fase aquosa. Não iteramos na formulação reduzindo a quantidade de DOX presente na fase aquosa inicial e hipotetizamos que a eficiência poderia ser melhorada reduzindo a quantidade de DOX na formulação inicial. O DOX não encapsulado provavelmente está passando pelas lavagens do filtro de 3 kDa no final da síntese. Com a disponibilidade e o custo relativamente baixo da doxorrubicina, optamos por “saturar” a formulação com DOX, sabendo que grandes quantidades da DOX restante provavelmente passariam sem encapsulamento. Aumentar a eficiência do encapsulamento pode melhorar esta plataforma de partículas em trabalhos futuros.

A curva de liberação para o NALG-DOX em pH 5,5 e 7,4 pode ser encontrada na Fig. 3. NALG-DOX retém aproximadamente 70% da carga útil de DOX ao longo das primeiras 4 h, com 90% deixando as partículas em 24 h , a pH 7,4. Este padrão de liberação é comum para materiais poliméricos [57, 58] e demonstra liberação controlada ao longo das primeiras 24 horas quando exposto ao reservatório de PBS. Em um pH inferior de 5,5, mais semelhante ao pH que as nanopartículas veriam durante a captação celular em um endossomo tardio [59], o DOX é liberado em uma taxa mais rápida. Este é o comportamento desejado, pois a liberação mais lenta é necessária quando em circulação geral no sangue, mas quando no microambiente tumoral ácido, a liberação mais rápida é preferida.

A liberação de doxorrubicina da solução de nanopartículas mostra liberação controlada ao longo das primeiras 24 h em PBS, pH 7,4. A liberação mais rápida de doxorrubicina ocorre em pH 5,5. Cada ponto representa a média ± desvio padrão de n =3 medições

Captação celular de DOX

A captação de NALG-DOX por células de câncer de mama de camundongo 4T1 em 48 h é mostrada na Fig. 4a, b. Cada linha indica um canal de cor separado e a linha inferior mostra a imagem composta de todos os canais de cor. Na coluna da esquerda, uma alta concentração de DOX ou NALG-DOX é usada, o que é suficiente para eliminar a maioria das células. A coluna do meio mostra uma concentração de 0,31 μg / mL para DOX e 0,28 μg / mL para o DOX no NALG-DOX, que mostra algum potencial de morte celular, e a coluna da direita mostra células não tratadas. As células na imagem central mostram doxorrubicina (vermelho) ao redor e sobrepondo-se ao núcleo (azul) das células. Existem números de células reduzidos nas duas primeiras colunas em ambos os painéis aeb devido à presença do DOX, que inibiu a proliferação celular em comparação com os poços não tratados. A doxorrubicina funciona por meio da intercalação no DNA nuclear [12], e a co-localização da doxorrubicina e do núcleo pode indicar que ela está funcionando por meio desse mecanismo após a captação. Na Fig. 4b, a doxorrubicina encapsulada é distinta na periferia da área nuclear. A coluna da direita mostra células não tratadas sem nenhum sinal significativo detectado no canal vermelho. O DOX livre, embora potente, infligiria toxicidade fora do alvo e reduziria os tempos de circulação in vivo. O encapsulamento permite uma liberação mais estável ao longo do tempo de circulação aumentado, tornando o NALG-DOX potencialmente melhor in vivo e pode ser explorado em trabalhos futuros.

Microscopia de fluorescência de imagens de células fixas de câncer de mama 4T1-luc2-GFP tratadas com doxorrubicina (DOX) ( a ) e NALG-DOX ( b ) após exposição de 48 horas. As barras de escala indicam 100 μm. Coloração nuclear azul:DAPI; verde (linha celular transfectada):GFP; vermelho (fluorescência molecular intrínseca):DOX

Citotoxicidade de NALG-DOX

Como um teste básico para o potencial de morte celular, células 4T1 não tratadas e células tratadas com NALG-DOX foram coradas com ensaio de células LIVE / DEAD (ThermoFisher) e fixadas após 72 h de exposição. Um exemplo de imagem de um poço não tratado, um poço tratado com NALG, um poço tratado com 0,078 μg / mL DOX e um poço tratado com 0,20 μg / mL NALG-DOX é mostrado na Fig. 5a-d, respectivamente. A sobreposição verde mostrada na Fig. 5c, d indica que o tratamento DOX e NALG-DOX nesses poços leva à morte de muitas das células naquele poço. As células não foram capazes de proliferar da mesma maneira que nos poços tratados com nanopartículas vazias e não tratadas mostradas na Fig. 5a, b devido à presença do agente terapêutico. A diluição de nanopartículas usadas para dosagem em NALG e NALG-DOX foi idêntica.

O ensaio de fluorescência LIVE / DEAD demonstra pouca ou nenhuma morte celular em células 4T1 não tratadas ( a ) e em células tratadas com NALG ( b ) A intensidade do sinal do canal verde (mancha de células mortas) é forte em uma grande quantidade de células tratadas com 0,078 μg / mL DOX ( c ) e 0,20 μg / mL NALG-DOX ( d ), indicando morte celular. As barras de escala indicam 100 μm. As concentrações indicam a quantidade de DOX, livre ou em partículas. Dosagem de NALG em ( b ) na mesma densidade de partícula que em NALG-DOX

A avaliação quantitativa da viabilidade celular das células 4T1-luc2-GFP após 72 h de exposição a NALG, DOX livre e NALG-DOX via ensaio Alamar Blue (ThermoFisher) é mostrada na Fig. 6. Na Fig. 6a, a doxorrubicina livre As células tratadas mostraram células menos viáveis ​​em toda a faixa de concentração do que as células tratadas com NALG-DOX (para concentração equivalente de DOX). Isso é posteriormente exibido pelo IC ₅₀ valores, ou concentração necessária para mostrar um efeito inibidor de 50%, que foram 0,093 μg / mL e 0,45 μg / mL, para DOX livre e NALG-DOX, respectivamente. O valor de DOX livre é semelhante ao encontrado em 72 h contra células 4T1 por Du et al. [60]. O IC ₅₀ os valores são semelhantes aos encontrados por Eliaz et al. com DOX e DOX encapsulado em lipossoma em 72 h contra células de melanoma B16F10 [61].

Viabilidade celular de células 4T1-luc2-GFP após exposição de 72 h a NALG-DOX e DOX ( a ) e NALG ( b ) em várias concentrações. Os pontos de dados e as barras de erro indicam a média ± desvio padrão de n =3 poços. As concentrações indicam a quantidade de DOX, livre ou em partículas, em ( a ) Em b , Os poços NALG foram dosados ​​começando nas mesmas concentrações de partículas que NALG-DOX, indicando pouca ou nenhuma morte celular do carreador da droga sozinho

É necessária uma concentração mais elevada de doxorrubicina para que o NALG-DOX apresente um efeito semelhante ao do fármaco livre. Isso deveria ser esperado, uma vez que a terapêutica encapsulada é mais dificultada em seu transporte até o local de efeito. A doxorrubicina encapsulada ainda apresentou efeitos inibidores celulares, ou seja, a droga ainda é terapeuticamente ativa ou a própria nanopartícula é tóxica para as células. Para testar isso, a viabilidade do NALG foi avaliada de maneira semelhante ao NALG-DOX. NALG mostrou toxicidade mínima em todas as concentrações, como mostrado na Fig. 6b, indicando que a droga é eficaz.

Conclusões

Desenvolvemos uma plataforma de micela inversa capaz de produzir nanopartículas esféricas de alginato com tamanho de ~ 90 nm. A captação de NALG-DOX foi examinada em células de câncer de mama 4T1-luc2-GFP e mostrou captação distinta para locais próximos ao núcleo quando encapsulado no transportador de alginato. A toxicidade celular do fármaco livre versus o fármaco encapsulado foi comparada examinando IC terapêutico ₅₀ valores. A doxorrubicina encapsulada apresentou menor toxicidade quando comparada à sua contraparte livre. Estes NALG-DOX podem ser de grande interesse para fins de administração de drogas, uma vez que os efeitos fora do alvo da doxorrubicina seriam reduzidos na dosagem sistêmica da forma encapsulada. Formulações futuras serão otimizadas para perfis de liberação controlada mais lentos e maior encapsulamento. Este processo fácil fornece uma rota sintética eficiente que pode ser concluída em apenas algumas horas, permitindo uma caracterização adicional, in vitro e experimentação in vivo para prosseguir rapidamente.

Abreviações

4T1-luc2-GFP:

4T1 luciferase / proteína fluorescente verde

CaCl ₂ :

Cloreto de cálcio

DAPI:

4 ′, 6-Diamidino-2-fenilindol

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DOX:

Doxorrubicina

NALG:

Nanopartículas de alginato

NALG-DOX:

Nanopartículas de alginato de doxorrubicina

PBS:

Salina tamponada com fosfato

PDI:

Índice de polidispersidade

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

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