Nanoesferas ocas de sílica encapsuladas com peroxidase de rábano para detecção intracelular de espécies reativas de oxigênio

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (ROS) têm papéis cruciais na sinalização e homeostase celular. A superprodução de ROS pode induzir dano oxidativo a várias biomoléculas e estruturas celulares. Portanto, o desenvolvimento de uma abordagem capaz de monitorar e quantificar ROS em células vivas é significativo para a fisiologia e diagnósticos clínicos. Algumas sondas fluorogênicas permeáveis às células desenvolvidas são úteis para a detecção de ROS em conjunto com a peroxidase de rábano (HRP). Seu cenário intracelular é, entretanto, prejudicado pela propriedade impermeável à membrana das enzimas. Aqui, uma nova abordagem para detecção intracelular de ROS usando nanoesferas de sílica oca encapsuladas com peroxidase de rábano (designadas HRP @ HSNs), com atividade catalítica satisfatória, permeabilidade da membrana celular e biocompatibilidade, foi preparada por meio de um método de microemulsão.

Esses HRP @ HSNs, combinados com sondas seletivas ou ligantes de direcionamento, podem ser previstos como ferramentas de detecção de ROS em organelas ou tipos de células específicos. Como tal, HRP @ HSNs acoplados a dihidrorodamina 123 foram usados para a análise qualitativa e semiquantitativa de H ₂ fisiológico O ₂ níveis em macrófagos RAW 264,7 ativados. Prevemos que estes HSNs encapsulando enzimas ativas podem ser conjugados com sondas seletivas e ligantes de direcionamento para detectar ROS em organelas específicas ou tipos de células de interesse.

Histórico

As espécies reativas de oxigênio (ROS) que consistem em moléculas radicais e não radicais, como ânions superóxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila, oxigênio singlete e peroxinitrito, são continuamente produzidas durante o metabolismo aeróbio. ROS celulares são gerados principalmente a partir da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (mETC) e são normalmente contrabalançados por enzimáticos (como superóxido dismutases, catalases e peroxidases) e não enzimáticos (por exemplo, vitaminas A, C e E; urato; e bilirrubina ) defesas antioxidantes [1]. No entanto, desequilíbrios na produção de ROS podem levar ao estresse oxidativo e danos subsequentes ao DNA, ácidos graxos, proteínas e outros componentes celulares, potencialmente contribuindo para diabetes [2], câncer [3] e distúrbios cardiovasculares [4] e distúrbios neurodegenerativos [5] como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson. A imagem direta e a quantificação de ROS em células vivas são altamente desejáveis, mas muito desafiadoras.

Os avanços na microscopia fluorescente [6, 7] permitiram o desenvolvimento da medição não invasiva e da imagem da evolução de ROS no nível de uma única célula. Para detectar ROS, a maioria das sondas são projetadas para medir mudanças na intensidade de fluorescência ou mudanças no comprimento de onda de emissão (isto é, métodos raciométricos) após a oxidação de moléculas aromáticas profluorescentes ou desproteção de compostos mascarados para produtos fluorescentes [8]. A especificidade para um tipo particular de ROS é importante ao projetar sondas bem-sucedidas; por exemplo, a oxidação de boronato é utilizada como uma abordagem de reação bioortogonal para estudar a química do peróxido de hidrogênio em sistemas vivos [9]. Para explorar a dinâmica espaço-temporal de ROS, várias sondas baseadas em boronato conjugadas com uma porção de fosfônio carregada positivamente foram geradas para o direcionamento mitocondrial [10, 11]. No entanto, seu potencial para imagens in vivo é limitado por sua instabilidade no meio biológico, baixa penetração de barreiras de tecido e rápida eliminação do corpo através do sistema urinário [12,13,14]. Para superar tais problemas, algumas estratégias foram desenvolvidas enxertando quimicamente uma estrutura estabilizadora adicional na sonda [15] (por exemplo, uma cadeia de trietilenoglicol), desenvolvendo indicadores baseados em proteína fluorescente codificados geneticamente [16], ou aplicando indicadores baseados em reações repórteres bioluminescentes [17] ou sondas de tomografia por emissão de pósitrons (PET) para a imagem molecular de ROS [18]. Além disso, vários estudos abrangentes destacaram as nano-formulações como uma consideração de design importante e demonstraram que as sondas baseadas em nanopartículas podem fornecer percepções mecanísticas e estratégias inovadoras para imagens ROS em organismos vivos com alta especificidade e sensibilidade [19,20,21,22]. Enzimas com alta atividade catalítica e seletividade de substrato distinta também têm sido utilizadas como ferramentas de diagnóstico clínico para a identificação de analitos alvo. No entanto, a falta de estabilidade duradoura e a dificuldade de permear através das membranas biológicas de enzimas livres têm freqüentemente limitado suas aplicações em ambientes biológicos complexos. Embora a aplicação do eletrodo não seja adequada para ensaios intracelulares ou imagens in vivo, esforços consideráveis têm sido dedicados ao desenvolvimento de biossensores incorporados à peroxidase de rábano (HRP) para determinar H ₂ O ₂ com base em métodos eletroquímicos [23, 24].

Neste trabalho, nanorreatores enzimáticos, compostos de HRP encapsulados em nanoesferas ocas de sílica de 45 nm, foram sintetizados por uma rota de microemulsão água-em-óleo (w / o) seguida por um processo de condicionamento suave [25]. Anteriormente, demonstramos que tais nanomateriais ocos podem manter a atividade estável das enzimas encapsuladas e nanocatalisadores enquanto protegem contra proteólise e sinterização, respectivamente [26, 27]. Neste trabalho, avaliamos seus potenciais usos como biossensores intracelulares estudando a eficiência de aprisionamento enzimático, capacidade de carga, reatividade e seletividade de peróxidos, captação celular, toxicidade e efeitos de proliferação de HRP @ HSNs. Usando dihidrorodamina 123 (DHR123) como substrato, que tem sido comumente acoplado com HRP para detectar a produção de peróxido de hidrogênio intracelular, as interações entre HRP @ HSNs e vários tipos de ROS em soluções aquosas foram investigadas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Além disso, foi demonstrado que a utilização de HRP @ HSNs com DHR123 pode simultaneamente criar imagens e quantificar H fisiológico ₂ O ₂ níveis em macrófagos RAW264.7 estimulados por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Tomados em conjunto, os nanorreatores enzimáticos de HRP @ HSNs têm o potencial para imagens de células inflamatórias associadas a ROS in vivo e os componentes encapsulados podem ser estendidos a várias enzimas diferentes [28], nanopartículas [26] e moléculas de reconhecimento para aplicações sinérgicas.

Métodos / Experimental

Produtos Químicos e Reagentes

Decano, n -hexanol (98%), hidróxido de amônio (NH ₄ OH, 35% em peso), ortossilicato de tetraetila (TEOS, 98%), 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS, 95%) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram adquiridos na ACROS. Éter isooctilfenílico de polioxietileno (5) (Igepal CA-520), HRP tipo VI-A (HRP), 3,3′5,5′-tetrametilbenzidina (TMB), ácido cítrico, dimetilsulfóxido (DMSO) e isotiocianato de rodamina B ( RITC) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H-tetrazólio foi adquirido a Clontech. DHR123 e PMA foram adquiridos da Cayman Chemical. Peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ , 35%) foi adquirido da SHOWA Chemical Industry. Solução de hidroperóxido de terc-butila (70% em H ₂ O) foi adquirido da Aldrich. Perclorato de ferro (II) (Fe (ClO ₄ ) ₂ ) foi adquirido da Alfa Aesar. Água ultrapura desionizada (D.I.) foi gerada por um sistema Millipore Milli-Q Plus. Todos os reagentes foram utilizados sem purificação adicional.

Síntese de nanoesferas de sílica oca (HSNs)

HSNs foram sintetizados por um sistema de microemulsão reversa acompanhado por um método de ataque seletivo, conforme descrito em nossos estudos anteriores [25, 29]. Normalmente, 20 mL de decano como fase oleosa, 1,63 mL de CA-520 como surfactante e 550 μL de n -hexanol como um co-tensoativo foram misturados, bem como magneticamente agitados com uma barra de agitação revestida com PTFE de 2 cm a 650 rpm. Depois disso, 350 μL de D.I. água foi adicionada à mistura em temperatura ambiente, gerando um sistema de microemulsão água-em-óleo (a / o). Em seguida, 25 μL de solução etanólica de APTMS (200 μL de APTMS em 1,4 mL de etanol absoluto) e 100 μL de TEOS foram adicionados com agitação. Após agitação por 10 min, 250 μL de amônia aquosa (35% em peso) foram introduzidos no sistema com agitação a 20 ° C. Após 10 h, etanol 95% foi adicionado para desestabilizar o sistema de microemulsão e as nanopartículas de sílica sólida (SSNs) foram coletadas por centrifugação a 11.000 rpm por 20 min. Para obter HSNs, os SSNs foram suspensos em D.I. água com agitação a 40 ° C durante 40 min. Em seguida, os HSNs foram coletados por centrifugação a 11.000 rpm por 20 min e lavados com etanol 95% várias vezes. Por fim, os HSNs foram suspensos e mantidos em etanol 99,5%.

Síntese de nanoesferas de sílica oca encapsuladas com peroxidase de rábano (HRP @ HSNs)

HRP @ HSNs foram sintetizados por um método baseado em nossos estudos anteriores [27, 28]. Normalmente, a síntese é semelhante ao procedimento acima, exceto que 350 μL de D.I. a água foi substituída por 350 μL de HRP aquoso (90 μL de 10 mg / mL de uma solução de HRP em 350 μL de água D.I.). Após a síntese, HRP @ HSNs foram mantidos em D.I. água a 4 ° C.

Síntese de FITC-HSNs e HRP @ FITC-HSNs

HSNs e HRP @ HSNs com corante de emissão verde de fluoresceína incorporado (designados FITC-HSNs e HRP @ FITC-HSNs) foram sintetizados de forma semelhante ao procedimento acima, exceto que a solução de APTMS etanólica foi substituída por uma de FITC-APTMS. Uma solução etanólica de FITC-APTMS foi preparada pela mistura de 10 mg de FITC e 200 μL de APTMS com 1,4 mL de etanol absoluto no escuro por 18 h em temperatura ambiente.

Eficiência de aprisionamento de HRP e capacidade de carga de HRP @ HSNs

Primeiro, uma mistura composta por HRP (6 mg em 500 μL de água D.I.) e RITC (3 mg em 350 μL de DMSO) foi agitada sob condições escuras por 24 h a 4 ° C. Depois disso, a mistura foi transferida para uma membrana de diálise composta de celulose regenerada com um peso molecular de corte de 12 ~ 14 kDa. Em seguida, para remover o RITC que não reagiu, a bolsa de diálise foi dialisada contra 1 L de D.I. água e agitada suavemente por 3 dias. Finalmente, o HRP marcado com RITC (designado RITC-HRP) foi usado para sintetizar RITC-HRP @ HSNs.

Para determinar a capacidade de carga de HRP, RITC-HRP @ HSNs foram dissolvidos em 1 mL de NaOH (1 M) por 1 h, e a quantidade de RITC-HRP aprisionada foi calculada a partir de uma curva de calibração estabelecida plotando a intensidade de fluorescência versus o concentração de RITC-HRP. A fluorescência foi medida com um instrumento Hitachi F-4500 em um comprimento de onda de excitação de 543 nm e um comprimento de onda de emissão de 550 ~ 650 nm. A eficiência de aprisionamento HRP e a capacidade de carga de HRP @ HSNs foram definidas como segue:eficiência de aprisionamento (%) =massa de RITC-HRP em RITC-HRP @ HSNs / massa inicial de RITC-HRP; e capacidade de carga =massa de RITC-HRP em HRP-RITC @ HSNs / massa de RITC-HRP @ HSNs.

Ensaio de atividade HRP

Para detectar a atividade da enzima peroxidase, foi utilizado um substrato cromogênico de TMB. O TMB pode ser convertido em um produto colorido quando oxidado por HRP usando peróxido de hidrogênio como agente oxidante. Primeiro, várias concentrações de HRP nativo e HRP @ HSN foram preparadas em tampão de fosfato e citrato (pH 5,2). Em seguida, cada solução foi suplementada com 50 μL da solução TMB (20 μM em DMSO) e 50 μL de H ₂ O ₂ (20 μM em água D.I.). A reação foi monitorada medindo a absorbância a 655 nm usando um leitor de microplacas (BioTek Synergy Hybrid Reader). A atividade do HRP encapsulado em HSNs foi calculada a partir da curva de calibração do HRP nativo.

Ensaio de reatividade de HRP @ HSNs para vários ROS

DHR123 (20 μM) sozinho ou misturado com HRP @ HSNs (50 μg / mL) foi incubado com vários tipos de ROS (100 μM) em 100 μL de solução DMEM (pH 7,4). A emissão de fluorescência a 530 nm (λex =488 nm) foi monitorada a cada 5 minutos nos primeiros 120 minutos. Os ROS investigados foram obtidos da seguinte forma:peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ) e hidroperóxido de terc-butila (TBHP) foram preparados a partir de soluções aquosas comercialmente disponíveis a 32 e 70%, respectivamente. Superóxido (O ₂ ^{• -} ) foi gerado a partir de estoque 10 mM de superóxido de potássio (KO ₂ ) no DMEM. Os radicais hidroxila (• OH) e os radicais terc-butoxi (• OtBu) foram produzidos pela reação de Fe 1 mM (ClO ₄ ) ₂ com 100 μM H ₂ O ₂ ou 100 μM de TBHP, respectivamente.

Cultura de células e ensaio de viabilidade

A linha celular de macrófagos de camundongo RAW264.7 foi obtida da ATCC. As células RAW264.7 foram mantidas em DMEM com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina (Gibco) a 37 ° C em 5% de CO ₂ atmosfera. Normalmente, 2 × 10 ⁵ As células RAW264.7 por poço foram semeadas em placas de 24 poços para os ensaios de viabilidade. Após 24 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com diferentes quantidades (0, 50, 100 e 200 μg / mL) de uma suspensão de nanopartículas em DMEM sem soro por 2 h. Para o ensaio de citotoxicidade, as células tratadas com nanopartículas foram lavadas duas vezes com meio de cultura seguido de incubação com o reagente WST-1 (Clontech) a 37 ° C por 2 h. Para o ensaio de proliferação, as células após o tratamento com nanopartículas por 2 h foram deixadas crescer em meio de crescimento regular por 24 h, seguido de incubação com o reagente WST-1. A viabilidade celular foi determinada pelo corante formazan gerado pelas células vivas, e a absorbância a 450 nm foi medida, com comprimento de onda de referência de 650 nm, usando um leitor de microplaca (Bio-Rad, modelo 680).

Análise de captação celular

Células RAW264.7 em 1 × 10 ⁶ por poço foram semeados em placas de seis poços durante a noite. Em seguida, macrófagos RAW264.7 foram tratados com diferentes quantidades (0, 50, 100 e 200 μg / mL) de uma suspensão de nanopartículas em meio DMEM sem soro por 2 h. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e destacadas por uma solução de tripsina-EDTA. A captação de nanopartículas por macrófagos RAW264.7 foi examinada por citometria de fluxo. O azul de tripano foi utilizado para extinguir a fluorescência das nanopartículas adsorvidas na membrana externa das células.

Análise de citometria de fluxo da produção de ROS em macrófagos RAW264.7 estimulados por PMA

Normalmente, após 2 h de tratamento de macrófagos RAW264.7 com nanopartículas, as células foram lavadas três vezes com PBS, seguido de incubação com 20 μM de DHR123 em DMEM sem soro por 30 min. Em seguida, as células RAW264.7 foram lavadas com PBS e incubadas com meio de cultura contendo PMA em diferentes concentrações por 1 h. Após a lavagem, os macrófagos RAW264.7 foram colhidos e analisados por um citômetro de fluxo FACS Canto II.

Análise Quantitativa

Células RAW264.7 em 3 × 10 ⁴ por poço foram semeados em placas de 96 poços para ensaios semiquantitativos. Após a incubação com 50 μL de 100 μg / mL de uma suspensão de nanopartículas em DMEM sem soro por 2 h, as células tratadas com nanopartículas foram tratadas com 50 μL de DMEM sem soro contendo diferentes concentrações de PMA e 20 μM de DHR123 para um adicional 1 h a 37 ° C. Ao mesmo tempo, padrões externos de H ₂ O ₂ misturado com 50 μg / mL HRP @ HSNs foram usados para desenvolver uma curva de calibração traçando a intensidade de fluorescência versus a concentração de H ₂ O ₂ . A intensidade da fluorescência foi medida com um leitor de microplacas (BioTek Synergy Hybrid Reader) com excitação a 488 nm e emissão a 530 nm. Usando a curva de calibração estabelecida, quantidades de H ₂ O ₂ em RAW264.7 células estimuladas com várias quantidades de PMA foram calculadas.

Caracterização

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram obtidas em um JEOL JEM-1200 EX II operando a 100 kV. As imagens foram gravadas com uma câmera GatanOrius CCD. As amostras foram dispersas em etanol a 95% e colocadas em uma grade de cobre revestida com carbono, e então secas ao ar e examinadas. Para verificar HRP nas esferas ocas, uma amostra de coloração negativa foi agitada em acetato de uranila aquoso a 1% (UA) por 1 hora e, em seguida, centrifugada para remover o UA restante. Finalmente, a amostra foi dispersa em etanol e jogada na grade de cobre para a geração de imagens. A dispersão de luz dinâmica (DLS) e as medições de potencial zeta foram realizadas em um Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido). Imagens ópticas de células RAW264.7 foram obtidas com um microscópio invertido Zeiss Axio Observer Z1.

Resultados e discussão

Projeto e Síntese de HSNs e HRP @ HSNs

Normalmente, HSNs e HRP @ HSNs foram sintetizados por meio de um processo sol-gel catalisado por amônia combinado com um sistema de microemulsão água em óleo (w / o) de acordo com nosso método anterior [27, 28]. O Esquema 1 ilustra a síntese de HRP @ HSNs. De acordo com as imagens TEM (Fig. 1), HSNs com e sem HRP encapsulado apresentaram um diâmetro médio de 45 nm (Arquivo adicional 1:Figura S1). A coloração de UA exibiu claramente uma densidade de elétrons aumentada dentro dos HRP @ HSNs, mas nenhuma coloração foi observada fora dos HRP @ HSNs (Fig. 1b), indicando que as enzimas HRP foram aprisionadas com sucesso dentro da cavidade interna dos HRP @ HSNs.

Fluxograma da síntese de nanoesferas ocas de sílica encapsuladas com peroxidase de rábano (HRP @ HSNs). APTMS, 3-aminopropiltrimetoxissilano; TEOS, ortossilicato de tetraetilo; SSN, nanopartícula de sílica sólida

Imagens TEM de a nanoesferas ocas de sílica (HSNs), b HSNs corados com acetato de uranila, c HSNs encapsulados com peroxidase de rábano (HRP @ HSNs) e d HRP @ HSNs corados com acetato de uranila. Detalhe:uma visão ampliada

As medições DLS e análises de potencial zeta realizadas à temperatura ambiente são mostradas na Tabela 1. Os dados de DLS mostraram que ambos HSNs e HRP @ HSNs deram potenciais zeta positivos em água (pH ~ 6,5) com diâmetros hidrodinâmicos de 188 ± 4 e 184 ± 6 nm na água, respectivamente. No entanto, quando as nanopartículas foram dispersas em DMEM sem soro, os diâmetros hidrodinâmicos aumentaram para 1767 ± 94 nm para HSNs e 1598 ± 127 nm para HRP @ HSNs. Isso indica um pequeno grau de agregação de HSNs, mas eles ainda estavam bem suspensos na mídia. Enquanto isso, os potenciais zeta negativos de ambas as nanopartículas medidos na mídia implicam que alguns dos íons e biomoléculas do meio biológico podem ter sido adsorvidos nas superfícies das nanopartículas [30, 31]. Sob essa condição, as superfícies carregadas positivamente das nanopartículas foram cobertas por substâncias carregadas negativamente, o que rapidamente causou a agregação das nanopartículas por meio de interações eletrostáticas. Para reduzir a agregação não específica e promover a estabilidade coloidal das nanopartículas, albumina de soro bovino (BSA) foi introduzida no meio biológico [28]. Posteriormente, os diâmetros hidrodinâmicos de HSNs e HRP @ HSNs mostraram diâmetros hidrodinâmicos diminuídos consideráveis para 197 ± 43 e 195 ± 19 nm, respectivamente.

Eficiência de aprisionamento de HRP e capacidade de carga de HRP @ HSNs

Para investigar a eficiência e capacidade de carga do aprisionamento de HRP, foi preparado HRP marcado com corante fluorescente (RITC) (designado RITC-HRP). A intensidade de fluorescência do RITC-HRP @ HSNs foi medida suspendendo as nanopartículas em NaOH 1 M, e a quantidade de RITC-HRP encapsulado foi determinada de acordo com uma curva de calibração estabelecida plotando a intensidade de fluorescência versus a concentração de RITC-HRP nativo nas mesmas condições (Arquivo adicional 1:Figura S2). Para estudar os efeitos da concentração da enzima na eficiência de aprisionamento e na capacidade de carga, três quantidades diferentes de HRP (11,1, 22,2 e 33,3 nmol) foram introduzidas na síntese. É importante notar que nesta faixa de concentração, independente de quanta enzima foi introduzida, a eficiência de aprisionamento das enzimas para cada um dos três casos foi de cerca de 6%. Essa baixa eficiência pode ser devida ao fato de que apenas uma fração das gotículas da microemulsão nuclearam e cresceram para HSN; a maioria das gotas da microemulsão não foram nucleadas e permaneceram em seu pequeno tamanho de ~ 8 nm [25]. Trabalhos futuros podem ser necessários para aumentar a eficiência de carregamento. No entanto, a capacidade de carga HRP de HRP @ HSNs aumentou gradualmente para 12,5 ± 1,2 μg HRP / mg HSNs quando 33,3 nmol de HRP foi usado (arquivo adicional 1:Tabela S1). Isso indica que a capacidade de carga de HRP pode ser controlada pela quantidade de enzima presente na reação.

Citotoxicidade e absorção celular de HSNs e HRP @ HSNs

Para avaliar a citotoxicidade in vitro de HSNs e HRP @ HSNs, a viabilidade celular foi examinada por ensaios WST-1. Conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S3, nenhuma mudança significativa na proliferação de células RAW264.7 foi observada após tratamentos de nanopartículas por 2 h, ou 2 h seguidos por um adicional de 24 h de cultura. Nenhum efeito óbvio na função mitocondrial celular causado pelas nanopartículas de sílica foi encontrado nos pontos de tempo indicados, independentemente da presença ou ausência de HRP dentro de HSNs.

Em seguida, HSNs conjugados com FITC e HRP @ HSNs foram preparados, respectivamente, para investigar o efeito da concentração de nanopartículas na marcação RAW264.7. Os resultados da citometria de fluxo (arquivo adicional 1:Figura S4) mostraram que as células RAW264.7 foram marcadas com sucesso com FITC-HSNs e HRP @ FITC-HSNs em diferentes concentrações por 2 h em meio sem soro. Em ambos os casos, aumentos dependentes da dose na eficiência de rotulagem foram encontrados, e mais de 80% das células RAW264.7 foram rotuladas por exposição a nanopartículas a uma concentração de> 50 μg / mL por 2 h. Propriedades como marcação intracelular de alta eficiência com um tempo de incubação curto, uma dose relativamente baixa de nanopartículas e não citotoxicidade tornam HRP @ HSNs adequado para detecção intracelular de ROS.

Reatividade de HRP @ HSNs a vários ROS

De acordo com o ensaio de atividade da enzima HRP usando TMB como substrato, cerca de 40% da atividade enzimática inicial permaneceu após o encapsulamento subsequente de HRP em HSNs. Esta diminuição na atividade específica observada da enzima encapsulada (moles de substrato convertido por unidade de enzima por unidade de tempo) pode ter resultado de limitações de transferência de massa, que ocorrem quando os substratos cruzam a camada de sílica em direção ao HRP [32]. No entanto, a estratégia de encapsulamento fornece recursos adicionais, por exemplo, a casca de sílica porosa pode proteger HRP contra proteólise, permitindo o transporte de pequenas moléculas de reagentes e produtos [26, 27]. Tomados em conjunto, a reatividade observada de HRP @ HSNs para ROS, avaliada pela incorporação de uma sonda fluorescente (DHR123), poderia ser resultado de uma combinação da afinidade das nanopartículas, bem como da propriedade intrínseca de HRP para ROS.

Sistemas livres de células foram usados para gerar uma variedade de ROS biologicamente relevantes, incluindo peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂ ), TBHP, radicais hidroxila (• OH), radicais terc-butoxi (• OtBu) e superóxido (O ₂ • ^- ) Primeiro, DHR123 foi incubado com um painel de ROS na ausência e presença de HRP ou HRP @ HSNs seguido pela medição da intensidade de fluorescência do produto rodamina 123 (R123). Conforme mostrado na Fig. 2, independentemente de qual tipo de ROS foi empregado, a intensidade de fluorescência foi medida de maneira dependente do tempo (30, 60, 90 e 120 min). No entanto, as diferenças aparentes de intensidade entre vários ROS dependem das propriedades intrínsecas de DHR123. Por outro lado, de acordo com um estudo anterior [33], a Fig. 2a mostra que nem H ₂ O ₂ nem O ₂ • ^- poderia oxidar DHR123 em R123. Além disso, DHR123 exibiu maior reatividade para radicais • OtBu e • OH em relação a outros ROS. Com a atividade catalítica de HRP, aumentos notáveis na intensidade de fluorescência foram observados na presença de HRP nativo e HRP @ HSNs como mostrado na Fig. 2b, c. Foi notado que a maior intensidade de fluorescência encontrada no caso de HRP nativo em comparação com HRP @ HSNs no mesmo tempo de reação foi positivamente correlacionada com suas atividades enzimáticas observadas.

a - c Intensidade de fluorescência dependente do tempo da reação de espécies reativas de oxigênio (ROS) selecionadas com a dihidrorodamina 123 (DHR123), b DHR123 + peroxidase de rábano (HRP) e c DHR123 + HSNs encapsulados com peroxidase de rábano (HRP @ HSNs). d Razão de intensidade aumentada da reação de ROS selecionados com DHR123 + HRP e DHR123 + HRP @ HSNs em 1 h. Os dados mostrados são para 20 μM de DHR123, 400 ng / mL de HRP, 50 μg / mL de HRP @ HSNs e 100 μM de ROS. (* p <0,05 versus o grupo de controle em pontos de tempo correspondentes)

Para permitir uma comparação direta entre vários ROS, os dados em um intervalo de tempo de 60 min foram selecionados e relatados como intensidade de fluorescência relativa normalizada para o controle (Arquivo adicional 1:Figura S5). A análise subsequente da razão de intensidade aumentada foi mostrada dividindo a intensidade de fluorescência relativa de DHR123 + HRP ou DHR123 + HRP @ HSNs por DHR123 (Fig. 2d). Em ambos os casos contendo HRP, uma tendência semelhante da razão de intensidade aprimorada em vários ROS, bem como aumentos significativos na reatividade de DHR123 para H ₂ O ₂ e O ₂ • ^- foram observados, demonstrando que o HRP encapsulado deu um alto grau de atividade enzimática intrínseca, e os invólucros de sílica de HRP @ HSNs permitiram o transporte de pequenas moléculas para realizar bio-catálise seletiva.

Detecção de ROS intracelular com HRP @ HSNs

Para avaliar a funcionalidade de detecção de ROS de HRP @ HSNs dentro das células, macrófagos RAW264.7 foram incubados com HRP @ HSNs por 2 h seguido por lavagem e, em seguida, incubação com DHR123 (20 μM) por 30 min. Posteriormente, as células foram lavadas e tratadas com PMA (1 μg / mL) por mais 1 h. Sabe-se que a estimulação de macrófagos com PMA resulta na produção de superóxido, que é dismutado em peróxido de hidrogênio pela superóxido dismutase ou por dismutação espontânea [34,35,36]. Assim, o PMA pode funcionar como um estimulante para gerar H ₂ O ₂ em macrófagos RAW264.7 para avaliar o H intracelular ₂ O ₂ -capacidade de detecção de HRP @ HSNs. Como mostrado na Fig. 3a, ambos os casos de macrófagos RAW264.7 cultivados sozinhos e cultivados com HSNs mostraram fluorescência fraca na análise de citometria de fluxo, indicando que as células não estimuladas produziram um nível basal fraco de ROS, onde nenhum ROS significativo foi induzido em a presença de HSNs. Além disso, as células tratadas com HRP @ HSNs mostraram aumento de intensidade significativo (Fig. 3a), sugerindo que os HRP @ HSNs entregues deram atividade catalítica extra dentro das células.

a Análises de citometria de fluxo de macrófagos RAW264.7 estimulados com e sem 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) na presença e ausência de nanopartículas. b PMA e c A concentração de HSNs encapsulados com peroxidase de rábano (HRP @ HSNs) alterou de forma dependente a fluorescência de macrófagos RAW264.7. d As imagens representativas de fluorescência de macrófagos RAW264.7 nas condições indicadas. Barras de escala 50 μm

Para experimentos de estimulação, as células tratadas com PMA normalmente geraram níveis mais do que duas vezes maiores de fluorescência de R123 em comparação com as células não estimuladas. Além disso, as células tratadas com HRP @ HSNs tiveram o nível mais alto de fluorescência, seguido por HSNs e então células sozinhas. Foi observado que o tratamento dos macrófagos RAW264.7 estimulados com HSNs resultou em um pequeno aumento na intensidade de fluorescência em comparação com o controle. Este resultado sugeriu que as respostas ao estresse celular são desencadeadas extremamente rapidamente e sensíveis a estímulos externos, incluindo a exposição a nanopartículas [37]. Além disso, tanto PMA (0,1, 0,25, 0,5, 1 e 2 μg / mL) e HRP @ HSNs (50, 100 e 200 μg / mL) induziram a expressão de R123 de uma maneira dependente da dose, como evidente na Fig 3b, c.

De acordo com a análise de citometria de fluxo, a Fig. 3d exibe as imagens de fluorescência representativas de macrófagos RAW264.7 estimulados com e sem PMA na presença e ausência de nanopartículas. O sistema foi capaz de visualizar H ₂ endógeno O ₂ geração em células RAW264.7, e a intensidade de fluorescência mais fraca foi observada em células tratadas com HRP @ HSNs seguido por estimulação PMA. Como mostrado na Fig. 4a, a viabilidade celular de macrófagos RAW264.7 na presença do estimulante PMA ou H exógeno ₂ O ₂ foi examinado por ensaios WST-1. Considerando que as ROS foram implicadas na apoptose [38], apenas um pequeno efeito na viabilidade celular foi encontrado no ponto de tempo indicado, tornando a seguinte análise semiquantitativa prática e significativa.

a Ensaio WST-1 de macrófagos RAW 264.7 após tratamentos de H ₂ exógeno O ₂ ou estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 1 h. b Detecção da concentração de H ₂ O ₂ produzidos endogenamente por macrófagos RAW264.7 sob várias concentrações do estimulante PMA na presença de nanoesferas de sílica oca encapsuladas por peroxidase de rábano (HRP @ HSNs) e dihidrorodamina 123 (DHR123). Detalhe:uma curva de calibração obtida a partir dos padrões externos de H ₂ O ₂ misturado com HRP @ HSNs e DHR123

Aplicação de HRP @ HSNs in vitro para análise quantitativa de H ₂ O ₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O ₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O ₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O ₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O ₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O ₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O ₂ has an extracellular concentration estimated at 10^− 7 ~10^− 6 M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O ₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10^− 4 M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Conclusões

In summary, we have demonstrated that hollow silica nanospheres encapsulating HRP can be synthesized via a microemulsion-templating system and act as intracellular fluorescent ROS sensors. The shells of HRP@HSNs are permeable to small molecules, such as the enzyme substrates, which allows them to react with large enzyme payloads in the hollow cavity. Both the effective intracellular delivery and satisfactory catalytic activity of HRP@HSNs significantly enhance reduction-triggered fluorescence and constitute the ability of semi-quantitative measurements of endogenous H₂ O ₂ in RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Because the concentration and location of H₂ O ₂ in eukaryotic cells strongly rely on the types of cells, and cellular compartments [1], specific targeting of tumor cells or organelles could further be achieved by surface modification of HRP@HSNs with monoclonal antibodies or peptides. Also, non-enzymatic H₂ O ₂ detection could be realized by replacing the interior nanoreactors of HRP with nanoparticles [43, 44] or boronate-based fluorescent probes [42, 45]. Future efforts should be devoted to maximizing the sensitivity and specificity for H₂ O ₂ as well as enabling more informative designs of next-generation nanomaterials. Such hollow capsules could be a promising platform for modern nanomedicines that aims to simultaneously image, sensing, and deliver therapeutic molecules specifically to defective cells.