Nanoesferas de Sílica Oca Encapsulando Peroxidase de Raiz-forte para Detecção Intracelular de ROS

Resumo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são fundamentais na sinalização celular, mas sua superprodução causa danos oxidativos. A quantificação precisa de ROS em células vivas é essencial para biologia básica e diagnóstico clínico. Sondas fluorogênicas tradicionais associadas à peroxidase de raiz-forte (HRP) sofrem da baixa permeabilidade de membrana da HRP. Apresentamos nanoesferas de sílica oca encapsulando HRP (HRP@HSNs) fabricadas via abordagem sol-gel templada por microemulsão. Esses nanorreatores mantêm atividade enzimática robusta, atravessam prontamente membranas celulares e exibem excelente biocompatibilidade. O acoplamento de HRP@HSNs com a sonda diidrorrodamina 123 (DHR123) permitiu detecção qualitativa e semi-quantitativa de peróxido de hidrogênio intracelular (H₂O₂) em macrófagos RAW 264.7 ativados. A plataforma pode ser prontamente funcionalizada com ligantes de direcionamento, oferecendo capacidades de imagem de ROS específicas para organelas ou tipos celulares.

Contexto

ROS — incluindo superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxila, oxigênio singlete e peroxinitrito — são gerados continuamente durante metabolismo aeróbico, principalmente da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. Defesas antioxidantes, tanto enzimáticas (ex.: superóxido dismutase, catalase, peroxidases) quanto não enzimáticas (vitaminas A, C, E, urato, bilirrubina), normalmente neutralizam estas espécies. Desequilíbrio leva a estresse oxidativo, danificando DNA, lipídios, proteínas e contribuindo para doenças como diabetes, câncer, distúrbios cardiovasculares e neurodegenerativos (Alzheimer, Parkinson) [1–5].

Avanços recentes em microscopia fluorescente permitiram imagem não invasiva de ROS em célula única, amplamente através de sondas baseadas em intensidade ou ratiométricas que se tornam fluorescentes upon oxidação de um precursor não fluorescente [6–8]. Especificidade é crítica; sondas baseadas em boronato, por exemplo, visam H₂O₂ via oxidação bioortogonal [9]. No entanto, muitas sondas são instáveis in vivo, pouco penetrantes em tecidos e rapidamente eliminadas renalmente [12–14]. Estratégias como ligantes estabilizadores, sensores geneticamente codificados, repórteres bioluminescentes ou traçadores PET foram exploradas [15–18]. Nanoformulações aprimoram ainda mais a imagem de ROS melhorando especificidade e sensibilidade [19–22].

Enzimas com alta atividade catalítica são biossensores poderosos, mas sua forma livre carece de estabilidade e permeabilidade de membrana, limitando uso intracelular. Sensores de HRP baseados em eletrodos são inadequados para imagem em células vivas. Encapsulação de HRP dentro de cascas de nanopartículas pode proteger a enzima e facilitar entrega intracelular, como demonstrado com nanoesferas de sílica oca (HSNs) [25–27]. Este estudo avalia HRP@HSNs para detecção intracelular de ROS, avaliando carregamento, atividade, captação celular, citotoxicidade e imagem funcional em macrófagos.

Métodos/Experimental

Químicos e Reagentes

Decano, n-hexanol (98%), hidróxido de amônio (35% p/p), TEOS (98%), APTMS (95%), FITC e outros reagentes foram adquiridos da ACROS e Sigma-Aldrich. HRP (tipo VI-A), DHR123, PMA e H₂O₂ (35%) foram comprados da Cayman e SHOWA Chemical Industry. Todos os reagentes foram usados como recebidos.

Síntese de Nanoesferas de Sílica Oca (HSNs)

HSNs foram preparadas por microemulsão água-em-óleo com etching seletivo, seguindo protocolos de nosso trabalho anterior [25, 29]. Brevemente, 20 mL decano, 1,63 mL CA-520 e 550 µL n-hexanol foram agitados a 650 rpm, então 350 µL água foi adicionada para formar a microemulsão. APTMS (25 µL, 200 µL em 1,4 mL etanol) e TEOS (100 µL) foram introduzidos, seguidos por 250 µL amônia 35% a 20 °C. Após 10 h, 95% etanol desestabilizou a emulsão; nanopartículas de sílica sólida (SSNs) foram coletadas por centrifugação (11.000 rpm, 20 min). SSNs foram etchadas em água a 40 °C por 40 min para gerar cascas ocas, então lavadas e armazenadas em etanol 99,5%.

Síntese de Nanoesferas de Sílica Oca Encapsulando Peroxidase de Raiz-forte (HRP@HSNs)

O procedimento espelha a síntese de HSNs, substituindo 350 µL água por 350 µL HRP aquosa (10 mg mL⁻¹). HRP@HSNs foram armazenadas em água desionizada a 4 °C.

Síntese de FITC-HSNs e HRP@FITC-HSNs

Para introduzir fluorescência verde, FITC-APTMS (10 mg FITC, 200 µL APTMS em 1,4 mL etanol, 18 h, escuro) substituiu o APTMS etanólico na síntese, resultando em FITC-HSNs e HRP@FITC-HSNs.

Eficiência de Aprisionamento e Capacidade de Carga de HRP

HRP foi marcada com RITC para criar RITC-HRP, que foi encapsulada formando RITC-HRP@HSNs. Após dissolução em 1 M NaOH, fluorescência foi medida (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 nm, λ_em = 550–650 nm) e comparada a curva de calibração. Eficiência de aprisionamento (%) = (massa de RITC-HRP nas nanoesferas / RITC-HRP inicial) × 100; capacidade de carga (µg HRP mg⁻¹ HSNs) foi calculada accordingly.

Ensaio de Atividade de HRP

Atividade de HRP foi quantificada usando substrato cromogênico TMB. Soluções enzimáticas (HRP nativa e HRP@HSN) foram misturadas com 20 µM TMB e 20 µM H₂O₂ em tampão fosfato/citrato (pH 5,2). Absorbância a 655 nm foi registrada com leitor BioTek Synergy; atividade foi derivada da curva de calibração de HRP nativa.

Ensaio de Reatividade com Vários ROS

DHR123 (20 µM) com ou sem HRP@HSNs (50 µg mL⁻¹) foi incubado com 100 µM de ROS (H₂O₂, TBHP, superóxido, •OH, •OtBu) em DMEM (pH 7,4). Fluorescência (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) foi medida a cada 5 min por 120 min.

Cultura Celular e Ensaio de Viabilidade

Macrófagos RAW264.7 foram cultivados em DMEM + 10% FBS + antibióticos a 37 °C, 5% CO₂. Para viabilidade, 2 × 10⁵ células/poço foram semeadas em placas de 24 poços; após 24 h, células foram expostas a 0–200 µg mL⁻¹ de nanopartículas em DMEM sem soro por 2 h. Reagente WST-1 (Clontech) foi usado para avaliar viabilidade (450 nm, referência 650 nm) com leitor Bio-Rad 680.

Análise de Captação Celular

1 × 10⁶ células RAW264.7/poço foram incubadas com 0–200 µg mL⁻¹ de nanopartículas marcadas com FITC por 2 h. Após lavagem e tripsinização, captação foi quantificada por citometria de fluxo; azul de tripano extinguiu fluorescência extracelular.

Citometria de Fluxo de Produção de ROS em Macrófagos Estimulados por PMA

Após 2 h exposição a nanopartículas e 30 min carregamento de DHR123, células foram estimuladas com 1 µg mL⁻¹ PMA por 1 h antes de análise em FACS Canto II.

Análise Quantitativa

Placas de 96 poços foram semeadas com 3 × 10⁴ células RAW264.7/poço. Após 2 h tratamento com nanopartículas e 1 h incubação com PMA (variado) + DHR123 (20 µM), fluorescência (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) foi medida. Curva de calibração (H₂O₂ + HRP@HSN) permitiu conversão de fluorescência para concentração de H₂O₂.

Caracterização

TEM (JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV) confirmou núcleos ocos de 45 nm; coloração com acetato de uranila verificou HRP interna. Espalhamento dinâmico de luz (Malvern Zetasizer Nano ZS) avaliou tamanho hidrodinâmico e potencial zeta; células foram imageadas com Zeiss Axio Observer Z1.

Resultados e Discussão

Design e Síntese de HSNs e HRP@HSNs

HRP@HSNs foram produzidas via química sol-gel catalisada por amônia dentro de microemulsão w/o (Esquema 1). TEM (Fig. 1) mostra esferas monodispersas de 45 nm; coloração com acetato de uranila confirma encapsulamento de HRP dentro da cavidade oca. DLS revela diâmetros hidrodinâmicos de 188 ± 4 nm (HSNs) e 184 ± 6 nm (HRP@HSNs) em água, que aumentam para 1,8–1,7 µm em DMEM sem soro devido a agregação. Albumina sérica bovina (BSA) reduz esta agregação, resultando em partículas estáveis de 195–197 nm.

Eficiência de Aprisionamento e Capacidade de Carga de HRP

Encapsulamento de RITC-HRP rendeu ~6% eficiência de aprisionamento em 11–33 nmol carga; a maior capacidade de carga atingiu 12,5 ± 1,2 µg HRP mg⁻¹ HSN a 33,3 nmol entrada. Embora a eficiência seja modesta, demonstra que HRP pode ser retida dentro da nanocavidade, e a carga pode ser ajustada pela concentração de enzima.

Citotoxicidade e Captação Celular

Ensaio WST-1 mostra nenhuma redução significativa na proliferação de RAW264.7 após 2 h ou 26 h exposição a até 200 µg mL⁻¹ HSNs ou HRP@HSNs, indicando baixa citotoxicidade. Partículas marcadas com FITC alcançaram >80% eficiência de marcação a >50 µg mL⁻¹ após 2 h, confirmando entrega intracelular eficiente sem comprometer viabilidade celular.

Reatividade de HRP@HSNs a Vários ROS

Ensaio de atividade HRP mostra ~40% retenção de atividade nativa após encapsulamento, provavelmente devido a limitações de difusão através da casca de sílica. Em ensaios livres de células, DHR123 sozinha não responde a H₂O₂ ou superóxido mas reage fortemente com •OH e •OtBu. HRP ou HRP@HSNs amplificam marcadamente fluorescência para todos ROS testados, com sinal maior de HRP nativa correlacionando com sua maior atividade. Razões de fluorescência relativa a 60 min revelam que ambas variantes HRP aumentam detecção de H₂O₂ e superóxido, confirmando que a nanocavidade preserva função catalítica enquanto permite difusão de substrato.

Detecção Intracelular de ROS com HRP@HSNs

Células RAW264.7 pré-tratadas com HRP@HSNs (2 h) e carregadas com DHR123 (30 min) exibiram fluorescência marcadamente maior após estimulação por PMA comparado a controles. Citometria de fluxo mostra aumento >2 vezes na fluorescência R123 em células estimuladas; HRP@HSNs entregam atividade catalítica adicional, enquanto HSNs simples produzem aumento modesto de fluorescência, provavelmente refletindo respostas de estresse celular. Intensidade de fluorescência aumentou dependente de dose com tanto PMA (0,1–2 µg mL⁻¹) quanto HRP@HSNs (50–200 µg mL⁻¹). Imagens confocal representativas confirmam imagem intracelular de ROS aprimorada (Fig. 3d).

Aplicação de HRP@HSNs para Análise Quantitativa de H₂O₂

Usando curva de calibração externa de H₂O₂ (0,625–15 µM), H₂O₂ intracelular gerado por células RAW264.7 estimuladas por PMA foi quantificado. Células tratadas com 100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs e 20 µM DHR123, então expostas a 0,1–2 µg mL⁻¹ PMA, renderam concentrações endógenas de H₂O₂ de ~10 µM a ≥0,25 µg mL⁻¹ PMA. Esta medição semi-quantitativa demonstra a utilidade da plataforma para avaliar estresse oxidativo em células vivas.

Conclusões

Projetamos nanoesferas de sílica oca que encapsulam HRP ativa, criando sensores robustos de ROS intracelulares. A casca de sílica porosa permite substratos pequenos alcançarem a enzima aprisionada enquanto protege HRP de proteólise. Acopladas com DHR123, HRP@HSNs fornecem detecção aprimorada, semi-quantitativa de H₂O₂ endógeno em macrófagos sob estresse oxidativo. Funcionalização de superfície com anticorpos ou peptídeos permitirá direcionamento específico a organelas ou células tumorais, e cargas alternativas (ex.: nanocatalisadores ou sondas boronato) podem ampliar o repertório de sensoriamento. Estes nanorreatores representam plataforma versátil para imagem simultânea de ROS, quantificação e entrega terapêutica direcionada em pesquisa biomédica e diagnóstico clínico.

Abreviações

APTMS

3-Aminopropiltrimetoxisilano

BSA

Albumina sérica bovina

DHR123

Dihidrorrodamina 123

DLS

Espalhamento dinâmico de luz

FITC

Isotiocianato de fluoresceína

HRP

Peroxidase de raiz-forte

HSNs

Nanoesferas de sílica oca

Igepal CA‑520

Polioxietileno (5) éter isooctilfenil

mETC

Cadeia de transporte de elétrons mitocondrial

PET

Tomografia por emissão de pósitrons

PMA

Forbol 12-miristato 13-acetato

R123

Rhodamina 123

RITC

Isotiocianato de rodamina B

ROS

Espécies reativas de oxigênio

SSN

Nanopartícula de sílica sólida

TBHP

Hidroperóxido de terc-butila

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

TEOS

Ortossilicato de tetraetila

TMB

3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina