Citotoxicidade e Captura Celular Dependentes da Forma de Nanopartículas de Ouro Reduzidas por Chá Verde em Células Cancerígenas

Resumo

Neste relatório, três formas diferentes de nanopartículas de ouro (nanoesferas, nanoestrelas e nanobastões) encapsuladas com quitosana foram sintetizadas para investigar os efeitos da forma na citotoxicidade e captura celular em células cancerígenas. Extrato de chá verde foi utilizado como agente redutor para reduzir sais de ouro a nanoesferas de ouro. Nanoestrelas de ouro foram preparadas usando uma solução de nanoesferas como solução semente. Nanobastões de ouro foram sintetizados usando método convencional. Todos os três tipos de nanopartículas de ouro mostraram suas bandas características de ressonância plasmonica de superfície na espectrofotometria UV-visível. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução, estruturas de rede foram claramente observadas em todas as três formas, confirmando a natureza cristalina das nanopartículas. Todas as três soluções coloidais de nanopartículas de ouro mantiveram estabilidade coloidal em várias soluções. Para avaliar citotoxicidade, o ensaio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) foi realizado em quatro linhagens de células cancerígenas. A citotoxicidade foi mais alta em nanobastões, seguida por nanoestrelas e finalmente nanoesferas. A captura celular de nanopartículas de ouro em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) foi medida, e os resultados seguiram a ordem nanoesferas > nanobastões > nanoestrelas. Os resultados do estudo atual podem auxiliar no design de forma de nanopartículas de ouro para aplicações terapêuticas como veículos de liberação de fármacos no campo da nanomedicina.

Introdução

Plantas contêm metabólitos primários e secundários naturais, incluindo flavonoides, saponinas, alcaloides, esteróides, cumarinas, taninos, fenóis, terpenoides, carboidratos, proteínas e aminoácidos. Recentemente, extratos de plantas têm sido utilizados para síntese de nanomateriais, especificamente nanopartículas metálicas como ouro, prata, óxido de titânio, cobre, paládio, óxido de zinco e nanopartículas de platina. Fitoquímicos diversos participam ativamente na conversão de sais metálicos em nanopartículas metálicas como agentes redutores. Além disso, extratos de plantas desempenham papel como agentes estabilizadores para manter a estabilidade coloidal de nanopartículas metálicas em solução. Agentes redutores químicos são geralmente nocivos e tóxicos a organismos vivos. Em contraste, o uso de extratos de plantas na síntese de nanopartículas metálicas é verde, ecológico e sustentável. Várias partes de plantas, como caules, frutos, sementes, folhas e flores, são utilizadas para sintetizar nanopartículas metálicas. Revisões extensivas abordaram a síntese verde de nanopartículas de ouro (AuNPs) usando extratos de plantas como agentes redutores. Usando esta estratégia verde, a etapa sintética é realizada em uma etapa e em um pote. Além disso, o processo é simples, fácil, custo-efetivo e ecológico. O tamanho, forma e topografia das AuNPs dependem das concentrações de sais de ouro e extratos, tempo de reação, temperatura de reação e pH da solução. Técnicas espectroscópicas e microscópicas são empregadas para caracterizar AuNPs, incluindo espectrofotometria UV-visível, difração de raios X, espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier (FT-IR), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (SEM), e medições de tamanho hidrodinâmico e potencial zeta. Estas AuNPs verdes são aplicadas como catalisadores, antioxidantes, e agentes antimicrobianos e anticancerígenos.

No laboratório dos autores, extratos de plantas (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum e Garcinia mangostana) têm sido usados como agentes redutores para sintetizar verde tanto AuNPs quanto nanopartículas de prata (AgNPs). A parte aérea de A. capillaris foi extraída e usada para síntese de AgNPs e AuNPs. Os AgNPs preparados exerceram excelente atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes e Klebsiella oxytoca comparado com o do extrato sozinho. Este resultado indicou que o efeito sinérgico da combinação de AgNPs e extrato contribuiu para atividade antibacteriana aprimorada. Curiosamente, AgNPs sintetizados usando A. capillaris na presença de brometo de cetiltrimetilamônio exibiram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina. Além disso, AuNPs sintetizados usando A. capillaris mostraram atividade catalítica para reação de redução de 4-nitrofenol. Extrato de L. japonicus foi utilizado para síntese de AgNPs exibindo melhorias notáveis em atividade antibacteriana. Observou-se que atividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas foi maior que contra bactérias Gram-positivas. Extrato de raiz de P. tenuifolia também foi utilizado para síntese de AuNPs e AgNPs. Atividade anticoagulante aprimorada e atividade antibacteriana foram observadas em AuNPs e AgNPs, respectivamente, sintetizados usando extrato de P. tenuifolia. Mais interessante, AgNPs sintetizados usando extrato de C. sappan mostraram atividade antibacteriana efetiva contra S. aureus resistente à meticilina. Extrato de G. mangostana produziu AgNPs em forma de haltere assimétrico com efeitos apoptóticos.

Relatórios prévios examinaram a síntese verde de AuNPs e AgNPs usando extrato de folha de chá. Kamal e colaboradores relataram síntese bem-sucedida de AgNPs de 25 nm. Em outro relatório, AgNPs esféricos medindo 20 a 90 nm foram sintetizados usando extrato de folha de chá. Os AgNPs sintetizados mostraram leve atividade antibacteriana contra E. coli. AgNPs esféricos medindo 3,42~4,06 nm também foram preparados por Loo e colaboradores usando extrato de folha de chá. Vaseeharan e colaboradores sintetizaram AgNPs antibacterianos usando extrato de folha de chá. Os AgNPs sintetizados foram efetivos contra infecção patogênica de Vibrio harveyi. Begum e colaboradores usaram extrato de folha de chá preto para sintetizar tanto AuNPs quanto AgNPs. Até o momento, principalmente AgNPs esféricos foram sintetizados usando extrato de folha de chá.

No presente relatório, quitosana foi usada como agente encapsulante para AuNPs. Quitosana tem sido explorada como veículo de liberação de fármaco/gene devido à sua alta biocompatibilidade, baixa alergenicidade, biodegradabilidade e baixa toxicidade. Quitosana origina-se de quitina, abundante nos exoesqueletos de insetos e crustáceos como caranguejos, lagostas e camarões. Quitina é um polissacarídeo composto de N-acetil-D-glicosamina ligada por ligações glicosídicas β(1-4). Quitosana pode ser obtida de quitina por processo heterogêneo de N-desacetilação. Quitosana em si possui atividade antibacteriana, antifúngica, antitumoral e antioxidante. Como agente encapsulante, quitosana contata diretamente AuNPs através de mecanismo eletrostérico. Nanopartículas de quitosana afetam o mecanismo de captura celular por células A549 sem modificar citotoxicidade. Além disso, o grau de desacetilação de quitosana é mais influente que peso molecular na captura celular e citotoxicidade.

A maioria dos estudos focou na síntese de AgNPs esféricos usando extrato de folha de chá. Aqui, extrato de folha de chá verde foi utilizado para sintetizar nanoesferas e nanoestrelas de ouro. As nanoesferas foram usadas como sementes para síntese mediada por semente de nanoestrelas. Para comparação, nanobastões foram sintetizados por método convencional comum. Três formas diferentes de AuNPs (nanoesferas, nanoestrelas e nanobastões) foram encapsuladas com quitosana para aumentar sua biocompatibilidade e estabilidade coloidal. Estas AuNPs foram caracterizadas por espectrofotometria UV-visível, microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM) e FT-IR. Medições de tamanho hidrodinâmico por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e medições de potencial zeta foram conduzidas antes e depois da encapsulação com quitosana. Estabilidade coloidal foi avaliada em soluções de sal, buffer e meio de cultura celular. Para medir citotoxicidade, o ensaio MTT foi aplicado a quatro células cancerígenas: AGS (células de adenocarcinoma gástrico humano), HeLa (células de adenocarcinoma epitelial de colo uterino humano), HepG2 (células de carcinoma hepatocelular humano) e HT29 (células de adenocarcinoma colorretal humano). Captura celular de AuNPs em células HepG2 foi medida quantitativamente por espectroscopia de emissão óptica de plasma acoplado indutivamente (ICP-OES) e espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente com ablação a laser (LA-ICP-MS).

Materiais e Métodos

Materiais e Instrumentação

Ácido cloroáurico tri-hidratado (HAuCl₄·3H₂O), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), quitosana (de cascas de camarão, ≥75% desacetilada), e brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes eram de grau analítico. Espectrofotômetro Shimadzu UV-1800 ou UV-2600 foi utilizado para adquirir espectros UV-visíveis em cubeta de quartzo (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). Medições de tamanho hidrodinâmico por DLS e medições de potencial zeta foram conduzidas usando NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, EUA). Um Varian 640 IR foi usado para adquirir espectros FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA); a amostra medida foi preparada pelo método de disco KBr. Imagens HR-TEM foram capturadas usando JEM-3010 operado a 300 kV (JEOL, Tokyo, Japão); a amostra foi carregada em grade de cobre revestida de carbono (tipo carbono-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, EUA) e deixada secar em estufa a 37 °C por 24 h. Para sonicação, modelo WUC-A22H foi usado (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, República da Coreia). Centrífuga 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha) e FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, República da Coreia) foram usados para centrifugação e liofilização, respectivamente. Para captura celular de AuNPs, Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, EUA) foram utilizados.

Preparação do Extrato de Chá Verde

O Instituto de Chá Verde de Hadong (Hadong, Gyeongnam, República da Coreia) gentilmente forneceu folhas de chá verde secas. Um liquidificador foi usado para preparar pós das folhas secas. Extração foi realizada misturando água desionizada (2 L) e folhas em pó (200 g). Extração foi permitida prosseguir por 1 h por sonicação à temperatura ambiente com três repetições. Papéis de filtro Whatman foram usados para filtrar frações aquosas para remover materiais insolúveis. Então, o filtrado foi centrifugado (3.000g, 18 °C, 25 min), e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante coletado foi filtrado em seringa, e o filtrado foi liofilizado. O material liofilizado foi dissolvido em água desionizada para criar solução estoque com concentração final de 2% (p/v) para a síntese verde descrita na seção seguinte.

Síntese de Nanoesferas de Ouro Usando Extrato

O processo de síntese de nanoesferas é ilustrado na Fig. 1a. A solução estoque descrita na seção anterior foi usada para síntese. Em um frasco de vidro, o extrato (concentração final de 0,03%) e ácido cloroáurico tri-hidratado (concentração final de 0,5 mM) foram misturados, e hidróxido de sódio (concentração final de 1 mM) foi adicionado. Água desionizada foi adicionada para volume final de 2 mL. Incubação em estufa foi realizada em estufa seca a 80 °C por 2 h. A ressonância plasmonica de superfície (SPR) das nanoesferas foi monitorada adquirindo espectros UV-visíveis sobre faixa de 300~800 nm. As nanoesferas também foram usadas como sementes para síntese de nanoestrelas descrita na seção seguinte.

Síntese de Nanoestrelas de Ouro

O processo de síntese de nanoestrelas é ilustrado na Fig. 2a. As nanoesferas (50 µL) sintetizadas como descrito na seção anterior foram agitadas (750 rpm) com barra magnética em chapa quente à temperatura ambiente. Ácido cloroáurico tri-hidratado (0,25 mM, 5 mL) foi adicionado a esta solução. Após 15 s, duas soluções foram adicionadas simultaneamente: nitrato de prata (1 mM, 50 µL) e ácido ascórbico (recém-preparado, 100 mM, 25 µL). Então, a mistura foi agitada a 750 rpm por 5 min. Espectros UV-visíveis foram adquiridos sobre faixa de 300~1100 nm.

Síntese de Nanobastões de Ouro

O processo de síntese de nanobastões é ilustrado na Fig. 3a. Para síntese de nanobastões de ouro, síntese mediada por semente foi realizada de acordo com relatório prévio com modificações menores. A solução de crescimento foi preparada da seguinte forma. Em um frasco de vidro de 20 mL, ácido cloroáurico tri-hidratado (10 mM, 500 µL) e brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) foram misturados. A solução era marrom-amarelada. Em seguida, ácido ascórbico (recém-preparado, 100 mM, 55 µL) foi adicionado, e esta solução foi agitada até que mudasse de marrom-amarelada para incolor. Nitrato de prata (10 mM, 100 µL) foi adicionado e agitado por 10 s. Esta solução final foi rotulada solução de crescimento. A solução semente foi sintetizada da seguinte forma. Em um frasco de vidro de 20 mL, ácido cloroáurico tri-hidratado (10 mM, 250 µL) e CTAB (100 mM, 9,75 mL) foram misturados. Então, borohidreto de sódio (10 mM, 600 µL) recém-preparado e gelado foi adicionado e vortexado por 2 min. A solução foi rotulada solução semente. A solução semente (12 µL) foi misturada com solução de crescimento sintetizada anteriormente. Espectros UV-visíveis foram adquiridos sobre faixa de 400~900 nm.

Encapsulação com Quitosana de Nanoesferas, Nanoestrelas e Nanobastões

Encapsulação com quitosana foi empregada para aumentar estabilidade coloidal e biocompatibilidade de AuNPs. Quitosana foi dissolvida em ácido acético 1%, e concentração final foi ajustada a 0,01%. Então, sonicação foi realizada para dissolver completamente quitosana; esta solução foi usada como solução estoque para encapsulação com quitosana no procedimento seguinte. Tanto nanoesferas quanto nanoestrelas previamente sintetizadas foram encapsuladas com solução estoque de quitosana (0,01%). A solução estoque de quitosana (30%, v/v) foi misturada com solução de AuNP (70%, v/v). A mistura foi agitada a 900 rpm por 2 h para completar encapsulação com quitosana. Para nanobastões, excesso de CTAB foi usado, e assim, centrifugação (14.000 rpm, 15 min, 25 °C) foi realizada para remover CTAB. Os nanobastões foram recuperados do pellet, e a encapsulação com quitosana foi conduzida como mencionado acima. Então, espectros UV-visíveis foram adquiridos.

Avaliação de Estabilidade Coloidal

A estabilidade coloidal de AuNPs é importante para aplicações in vitro e in vivo. Os três tipos de AuNPs com encapsulação de quitosana e nanoesferas sem encapsulação de quitosana foram avaliados para estabilidade coloidal nas seguintes soluções: água desionizada, albumina sérica bovina (BSA) 5%, NaCl 5%, PBS (pH 7,4), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e meio completo. O meio completo era DMEM contendo 10% soro fetal bovino (FBS). Um mililitro de cada tipo de solução de AuNP foi misturado com a solução de teste como mencionado acima (0,5 mL). A mistura foi incubada a 25 °C por 30 min, e espectros UV-visíveis foram adquiridos.

Cultura Celular e Citotoxicidade

As seguintes linhagens de células cancerígenas foram compradas do Banco de Linhagens Celulares Coreano (Seoul, República da Coreia): AGS, HeLa, HepG2 e HT29. O ensaio MTT foi realizado para avaliar citotoxicidade in vitro de AuNPs. DMEM contendo piruvato de sódio foi utilizado. Meio de cultura celular continha 10% soro fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 1% penicilina (100 unidades/mL), e estreptomicina (100 unidades/mL). Células foram cultivadas em pratos de cultura de 100 mm e mantidas a aproximadamente 70% de confluência. Antes da cultura celular, os AuNPs de três formas diferentes foram submetidos a evaporação a vácuo para obter concentração final de Au de 5 mM. Em placas de 96 poços, as células foram semeadas a densidade de 5,0×10³ células/poço, e incubação foi conduzida por 24 h em estufa a 37 °C sob atmosfera de CO₂ (5%). Em seguida, cinco diferentes concentrações de AuNPs (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM e 31,25 µM) foram tratadas e incubadas na estufa por mais 24 h a 37 °C sob atmosfera de CO₂ (5%). Em seguida, reagente MTT (5 µL, 5% em água desionizada) foi adicionado e incubado em estufa a 37 °C sob atmosfera de CO₂ (5%) por 3 h adicionais. A absorbância foi medida a 570 nm usando leitor multi-detecção de fluorescência (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, EUA). Células não tratadas foram utilizadas como controle.

Captura Celular

A captura celular de cada tipo de AuNP foi medida quantitativamente usando células HepG2. Em placas de 24 poços, as células foram semeadas a densidade de 5,0×10⁴ células/poço, e incubação foi conduzida por 24 h em estufa a 37 °C sob atmosfera de CO₂ (5%). Em seguida, 5 µM (concentração final) de cada tipo de solução de AuNP foi tratada e incubada na estufa por 24 h adicionais a 37 °C sob atmosfera de CO₂ (5%). Após incubação, a solução contendo AuNPs em excesso foi removida, e as células foram tratadas com tripsina. A concentração de Au nas células tripsinizadas foi medida quantitativamente por ICP-OES e LA-ICP-MS, que forneceram a concentração de captura de Au nas células. O controle foi 5 µM da solução coloidal original de cada tipo de AuNP, que também foi analisada por ICP-OES e LA-ICP-MS para obter a concentração de Au.

Resultados e Discussão

Espectros UV-visíveis

Espectros UV-visíveis são comumente adquiridos para confirmar síntese de AuNPs. A SPR característica de AuNPs pode ser observada sobre faixa de comprimento de onda visível-infravermelho próximo. Além disso, encapsulação de AuNPs geralmente induz deslocamento batocrômico (ou vermelho) ou hipsocrômico (ou azul). Além disso, deslocamento hipocrômico é geralmente induzido junto com deslocamentos vermelho e azul. Como mostrado na Fig. 1b, espectros UV-visíveis foram monitorados sobre faixa de 300~800 nm. Nanoesferas mostraram SPR característica de 532 nm com cor bordô profunda. Após encapsulação de nanoesferas com quitosana, SPR máximo foi deslocado para vermelho a 537 nm junto com deslocamento hipocrômico (Fig. 1b). Ampla faixa de comprimentos de onda SPR (600~800 nm) com solução azul escura foram observados para nanoestrelas (Fig. 2b). A encapsulação de nanoestrelas com quitosana mostrou deslocamento hipocrômico, onde a absorbância foi menor que a de AuNPs sem encapsulação (Fig. 2b). Nanobastões mostraram dois comprimentos de onda SPR distintos de 514 nm e 815 nm, com formação de solução rosa-claro (Fig. 3b). A encapsulação de nanobastões induziu deslocamento azul para 797 nm junto com deslocamento hipocrômico (Fig. 3b). Considerando todos estes resultados, a encapsulação de AuNPs com quitosana mudou o comprimento de onda SPR e induziu deslocamentos. Exame cuidadoso dos espectros UV-visíveis demonstrou que os três tipos de AuNPs foram encapsulados com sucesso com quitosana.

Tamanho Hidrodinâmico e Potenciais Zeta

Em seguida, tamanho hidrodinâmico e potenciais zeta foram medidos; resultados são mostrados na Tabela 1. Sem encapsulação de quitosana, os tamanhos hidrodinâmicos de nanoesferas e nanoestrelas foram 28,4 e 97,8 nm, respectivamente. O tamanho hidrodinâmico dos nanobastões não foi medido porque o tamanho hidrodinâmico foi bem ajustado às formas esféricas das nanopartículas. Com encapsulação de quitosana, o tamanho hidrodinâmico aumentou para 190,7 nm para nanoesferas e para 123,9 nm para nanoestrelas. Encapsulação de quitosana foi confirmada por aumento no tamanho hidrodinâmico. A mudança nos potenciais zeta também refletiu encapsulação de quitosana na superfície de AuNPs. Quitosana é um polissacarídeo positivamente carregado; assim, encapsulação de quitosana resultou em potenciais zeta positivos para todos os três tipos de AuNPs. Para nanoesferas, o potencial zeta foi alterado de −12,73 para 42,28 mV. O potencial zeta das nanoestrelas foi alterado de −42,46 para 47,44 mV. No caso dos nanobastões, CTAB (surfactante catiônico) foi utilizado para síntese. Assim, o potencial zeta original era 27,96 mV sem encapsulação. A encapsulação de nanobastões com quitosana aumentou o potencial zeta para 33,23 mV. Portanto, a mudança nos potenciais zeta de valores negativos para positivos para nanoesferas e nanoestrelas indicou claramente encapsulação bem-sucedida com quitosana. Além disso, o potencial zeta dos nanobastões aumentou, sugerindo que a superfície foi encapsulada com quitosana.

Imagens HR-TEM

Microscopia é crucial para pesquisa de nanopartículas, fornecendo informação essencial sobre tamanho e forma das nanopartículas. Ferramentas de microscopia entregam gama de informação detalhada, como estado de dispersão, morfologia e topografia bi e tridimensional, e maciez/dureza relativa de materiais. As nanoesferas mediram 8,7 ± 1,7 nm, baseada na média de 75 nanopartículas discretas selecionadas aleatoriamente em imagens HR-TEM (Fig. 4). O tamanho mais abundante foi 8~9 nm (29,3%), seguido por 9~10 nm (12,0%). Com encapsulação de quitosana, a forma das nanoesferas foi conservada sem qualquer mudança de forma (Fig. 4c, d). A natureza cristalina das partículas foi claramente indicada pelas estruturas de rede mostradas na Fig. 4d. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,24 nm (Fig. 4d). Além disso, a camada de quitosana também foi visualizada, conforme indicado pelas setas vermelhas na Fig. 4d. Nanoestrelas foram visualizadas por HR-TEM, como mostrado na Fig. 5. As nanoestrelas mediram 99,0 ± 47,0 nm, representando a média de 19 nanopartículas discretas. A estrutura de rede é indicada em imagem ampliada (Fig. 5c). Como mostrado, a distância entre redes vizinhas foi medida em 0,24 nm (Fig. 5c). As setas vermelhas na Fig. 5c indicam a camada de quitosana. Nanobastões foram visualizados como mostrado na Fig. 6. O comprimento e largura médios das partículas foram 60,4 nm e 16,4 nm, respectivamente, de acordo com medições feitas para 28 partículas. A razão de aspecto, definida como comprimento da partícula dividido por largura da partícula, foi 3,7. A estrutura de rede é mostrada na Fig. 6c, confirmando a estrutura cristalina dos nanobastões. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,23 nm (Fig. 6c). As setas vermelhas indicam a camada de quitosana (Fig. 6c).

Espectros FT-IR

Chá verde contém diversos metabólitos primários e secundários. Especificamente, os principais constituintes do chá verde são polifenóis, incluindo epigalocatequina-3-galato, (-)-epicatequina-3-galato, (-)-epigalocatequina e (-)-epicatequina. Espectros FT-IR foram adquiridos para obter informação sobre grupos funcionais que contribuíram para síntese de AuNPs. Comparamos espectro FT-IR de nanoesferas com espectro do extrato (Fig. 7). O principal grupo funcional que mais provavelmente esteve envolvido na reação de redução de sais de Au foi –OH. No extrato, grupos funcionais –OH apareceram a 3255 cm⁻¹ (Fig. 7a). Após síntese, este pico foi deslocado para número de onda maior a 3300~3341 cm⁻¹. Este resultado demonstrou que grupos funcionais –OH originados de polifenóis oxidaram a C=O enquanto reduziam sais de Au a AuNPs. Notavelmente, o aparecimento de grupos funcionais C=O a 1716 cm⁻¹ em nanoesferas apoiou claramente a oxidação de grupos funcionais –OH durante síntese (Fig. 7b).

Avaliação de Estabilidade Coloidal sob Várias Soluções

A estabilidade coloidal de nanopartículas é preocupação importante para aplicações diagnósticas e terapêuticas. Seis diferentes soluções foram testadas para estabilidade coloidal: (i) água desionizada, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM, e (vi) meio completo (DMEM com 10% FBS). Após misturar cada tipo de AuNPs com a solução de teste, espectros UV-visíveis foram adquiridos; resultados são mostrados na Tabela 2 e Fig. 8. Um deslocamento hipocrômico junto com leve deslocamento vermelho ou azul foi observado para todos os três tipos de AuNPs nos espectros UV-visíveis (Fig. 8a, c e e). A forma dos espectros foi retida, e nenhuma agregação da solução coloidal foi observada (Fig. 8b, d e f). Este resultado demonstrou que a estabilidade coloidal foi bastante bem retida nas soluções de teste acima mencionadas.

Na Tabela 2, o deslocamento hipocrômico é expresso como porcentagem de absorbância retida, com absorbância da solução original definida como 100%. Em todos os três AuNPs, estabilidade coloidal foi melhor retida em meio completo, que foi usado para os subsequentes experimentos de citotoxicidade: nanoesferas (65,3%), nanoestrelas (93,4%) e nanobastões (80,2%). A solução de proteína, BSA (5%), também forneceu estabilidade coloidal razoável: nanoesferas (61,8%), nanoestrelas (70,2%) e nanobastões (72,0%). Estes resultados indicaram que as proteínas que cobrem as nanopartículas têm efeitos benéficos adicionais na estabilidade coloidal dos AuNPs junto com a encapsulação de quitosana. A estabilidade coloidal das nanoesferas sem encapsulação de quitosana também foi avaliada (Fig. 8g, h). Todas as soluções induziram deslocamento hipocrômico. Entre as soluções testadas, apenas a solução NaCl (5%) mostrou grande deslocamento vermelho junto com deslocamento hipocrômico.

Citotoxicidade

Um ensaio MTT foi realizado para medir citotoxicidade contra quatro tipos de células cancerígenas (Fig. 9): AGS, HeLa, HepG2 e HT29. A citotoxicidade de todos os três tipos de AuNPs dependeu da concentração de Au. Entre os quatro tipos de células, a maior citotoxicidade foi observada para células HepG2. Além disso, nanobastões mostraram maior toxicidade contra os quatro tipos de células, seguidos por nanoestrelas e finalmente por nanoesferas. Especificamente, nanobastões mostraram toxicidade muito alta; assim, a citotoxicidade de nanobastões contendo faixa baixa de concentrações de Au também foi avaliada (Fig. 9e). Em concentrações tão baixas como 8 µM Au, nanobastões mostraram citotoxicidade dependente de concentração. Contra células HepG2, o valor IC₅₀ foi 127,1 µM Au para nanoesferas, 81,8 µM Au para nanoestrelas e 22,7 µM Au para nanobastões. Assim, nanobastões foram os mais citotóxicos, seguidos por nanoestrelas, e nanoesferas foram as menos citotóxicas contra células HepG2.

Foi relatado que citotoxicidade de AuNPs é afetada por tamanho, forma e carga superficial. Favi e colaboradores investigaram citotoxicidade de nanoesferas de Au (61 nm) e nanoestrelas de Au (34 nm) contra dois tipos de células (fibroblastos de pele humana e células endoteliais de gordura de rato). Em ambos os tipos de células, concentração letal foi observada a 40 µg/mL para nanoesferas e a 400 µg/mL para nanoestrelas. Seus resultados sugeriram que nanoesferas eram mais citotóxicas que nanoestrelas, sugerindo que tamanho, forma e química de superfície são mais prováveis influentes na citotoxicidade de AuNPs. Woźniak e colaboradores relataram citotoxicidade de AuNPs com formas diversas contra tanto HeLa quanto HEK293T (células renais embrionárias humanas), nomeadamente, nanoesferas (~10 nm), nanoflores (~370 nm), nanobastões (~41 nm), nanoprismas (~160 nm) e nanoestrelas (~240 nm). Curiosamente, nanoesferas e nanobastões foram mais citotóxicos que nanoflores, nanoprismas e nanoestrelas. Os autores explicaram que o pequeno tamanho das nanopartículas e o processo de agregação foram as principais forças motrizes para citotoxicidade de nanoesferas e nanobastões em seu trabalho. De fato, muitos estudos abordaram o efeito de tamanho de AuNPs na citotoxicidade. À medida que AuNPs se tornam menores, sua captura por células aumenta. Esta maior captura resulta em maior concentração de AuNPs na célula, o que leva a maior citotoxicidade contra células. No entanto, baixa concentração de AuNPs na célula também mostra alta citotoxicidade. A concentração de AuNPs na célula afeta citotoxicidade; no entanto, é vital considerar e entender as características de AuNPs. A citotoxicidade de AuNPs de duas formas diferentes (nanoesferas 43 nm, nanobastões 38×17 nm) foi avaliada em células epiteliais por Tarantola e colaboradores. Nanoesferas foram determinadas como mais citotóxicas que nanobastões. Além disso, nanoesferas induziram disfunção em membranas de células epiteliais, medida por sensoriamento de impedância de substrato de célula elétrica. Como discutido anteriormente, muitos estudos estão atualmente investigando citotoxicidade de diferentes formas de AuNPs em várias células. Embora as formas de AuNPs possam permanecer as mesmas, muitos fatores ainda afetam citotoxicidade de AuNPs. Ao avaliar citotoxicidade, fatores incluindo tamanho, forma, propriedades físico-químicas de superfície, concentração, tempo de exposição e tipo de célula também devem ser considerados. Além das características de AuNPs, mecanismos citotóxicos incluindo disrupção de membrana celular, estresse oxidativo, destruição do citoesqueleto e perda de função mitocondrial também são importantes. Atualmente, autofagia e disfunção lisossomal estão emergindo como explicações da citotoxicidade de nanomateriais. Em lisossomos, nanomateriais induzem citotoxicidade por estresse oxidativo mediado por ferro lisossomal e liberação de cathepsinas e outras hidrolases lisossomais associadas, que causam disfunção mitocondrial e morte celular. No relatório atual, nanobastões foram os mais citotóxicos contra os quatro tipos de células cancerígenas testadas. Assim, nosso trabalho futuro examinará os mecanismos detalhados de citotoxicidade.

Captura Celular em Células HepG2

Células HepG2 mostraram maior citotoxicidade entre os quatro tipos de células cancerígenas; accordingly, selecionamos este tipo de célula para avaliar captura celular. Dois instrumentos, ICP-OES e LA-ICP-MS, foram usados para analisar quantitativamente concentração de Au em células, e resultados são mostrados na Fig. 10. Concentração de Au de 5 µM foi usada para avaliar captura celular porque nenhuma toxicidade foi observada nesta concentração entre os quatro tipos de células cancerígenas. A captura foi mais alta para nanoesferas (58,0%), seguida por nanobastões (52,7%) e nanoestrelas (41,5%). Como indicado na seção anterior, a citotoxicidade dependia da forma da partícula (nanobastões > nanoestrelas > nanoesferas). No entanto, a ordem de captura celular (nanoesferas > nanobastões > nanoestrelas) não correspondeu à ordem de citotoxicidade. A captura celular de nanoesferas foi a mais alta; no entanto, a citotoxicidade destas partículas foi a mais baixa. Estes resultados sugerem que alta captura celular nem sempre induz alta citotoxicidade. Como mencionado anteriormente, diversos fatores incluindo tamanho, forma, propriedades físico-químicas de superfície, concentração, tempo de exposição e tipo de célula são importantes na influência da citotoxicidade.

Os diferentes graus de captura dos três tipos de AuNPs (41,5~58,0%) possivelmente dependem da competição entre envolvimento (i.e., como uma membrana envolve uma nanopartícula) sob força motriz termodinâmica e cinética de difusão de receptor. Chithrani e Chan compararam captura celular de Au nanoesferas e Au nanobastões revestidos com transferrina por células HeLa. No mesmo tamanho (i.e., mesmo valor para diâmetro de nanoesfera e largura de nanobastão), nanoesferas mostraram maior captura que nanobastões. Este resultado é consistente com nossas observações no relatório atual de maior captura de nanoesferas comparado com nanobastões. Para captura de nanobastões, largura é mais importante que comprimento, e razão de aspecto crescente diminui taxa de captura. O tamanho das nanoestrelas foi 99,0 ± 47,0 nm, tornando-as as maiores partículas entre os três tipos de AuNPs. Para nanopartículas grandes (>50 nm), cinética lenta de difusão de receptor leva a tempos curtos de envolvimento. Assim, captura celular de nanopartículas grandes é baixa, i.e., nanoestrelas no relatório atual. Quitosana foi usada para encapsular AuNPs para aumentar sua estabilidade coloidal e biocompatibilidade. Encapsulação de quitosana também pode desempenhar papel na captura celular de AuNPs interagindo com receptores na superfície celular. Estudo mecanicista detalhado é necessário para elucidar esta questão.

Conclusão

O desenvolvimento contínuo de nanotecnologia requer designs elaborados de forma e tamanho de nanopartículas para aplicações bem-sucedidas, incluindo como veículos de liberação de fármacos ou veículos para compostos biologicamente ativos como agentes anticancerígenos. Extrato de chá verde foi usado como agente redutor verde para síntese de nanoesferas e nanoestrelas de Au. Curiosamente, a citotoxicidade de nanobastões foi maior que a de nanoesferas e nanoestrelas, enquanto nanoesferas mostraram menor citotoxicidade contra quatro tipos de células cancerígenas. Captura celular por células HepG2 foi mais provavelmente dependente de forma e tamanho; nanoesferas mostraram maior captura pelas células, enquanto nanoestrelas mostraram menor captura. A otimização de tamanho e forma junto com modificação de superfície e funcionalização levará ao desenvolvimento de nanopartículas para uso futuro em nanomedicina.

Abreviações

AFM:

Microscopia de força atômica

AgNPs:

Nanopartículas de prata

AGS:

Células de adenocarcinoma gástrico humano

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

CTAB:

Brometo de cetiltrimetilamônio

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

DMEM:

Meio de Eagle modificado por Dulbecco

FBS:

Soro fetal bovino

FT-IR:

Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier

HeLa:

Células de adenocarcinoma epitelial de colo uterino humano

HepG2:

Células de carcinoma hepatocelular humano

HR-TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

HT29:

Células de adenocarcinoma colorretal humano

ICP-OES:

Espectroscopia de emissão óptica de plasma acoplado indutivamente

LA-ICP-MS:

Espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente com ablação a laser

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

SPR:

Ressonância plasmonica de superfície