Citotoxicidade dependente da forma e captação celular de nanopartículas de ouro sintetizadas usando extrato de chá verde

Resumo

No presente relatório, três formas diferentes de nanopartículas de ouro revestidas com quitosana (nanoesferas, nanostars e nanobastões) foram sintetizadas para investigar os efeitos da forma na citotoxicidade e absorção celular em células cancerosas. O extrato de chá verde foi utilizado como agente redutor para reduzir os sais de ouro a nanoesferas de ouro. As nanostars de ouro foram preparadas usando uma solução de nanosfera preparada como uma solução de semente. Nanobastões de ouro foram sintetizados usando um método convencional. Todos os três tipos de nanopartículas de ouro mostraram suas bandas de ressonância plasmônica de superfície características em espectrofotometria UV-visível. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução, estruturas reticuladas foram claramente observadas em todas as três formas, confirmando a natureza cristalina das nanopartículas. Todas as três soluções coloidais de nanopartículas de ouro mantiveram a estabilidade coloidal em várias soluções. Para avaliar a citotoxicidade, o ensaio de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi realizado em quatro linhas de células cancerosas. A citotoxicidade foi maior em nanobastões, seguido por nanostars e finalmente nanoesferas. A captação celular de nanopartículas de ouro em células de carcinoma de hepatócitos humanos (HepG2) foi medida, e os resultados seguiram a ordem nanoesferas> nanobastões> nanostars. Os resultados do presente estudo podem auxiliar no projeto de forma de nanopartículas de ouro para aplicações terapêuticas como veículos de entrega de drogas no campo da nanomedicina.

Introdução

As plantas contêm metabólitos primários e secundários naturais, incluindo flavonóides, saponinas, alcalóides, esteróides, cumarinas, taninos, fenóis, terpenóides, carboidratos, proteínas e aminoácidos. Recentemente, extratos vegetais têm sido utilizados para a síntese de nanomateriais, especificamente nanopartículas metálicas como ouro, prata, óxido de titânio, cobre, paládio, óxido de zinco e nanopartículas de platina [1]. Diversos fitoquímicos participam ativamente na conversão de sais metálicos em nanopartículas metálicas como agentes redutores. Além disso, os extratos vegetais desempenham um papel como agentes estabilizadores para manter a estabilidade coloidal das nanopartículas metálicas em solução. Os agentes redutores químicos são geralmente nocivos e tóxicos para os organismos vivos. Por outro lado, o uso de extratos de plantas na síntese de nanopartículas metálicas é verde, ecologicamente correto e sustentável. Várias partes da planta, como caules, frutos, sementes, folhas e flores, são utilizadas para sintetizar nanopartículas metálicas [1, 2]. Revisões extensas pesquisaram a síntese verde de nanopartículas de ouro (AuNPs) usando extratos de plantas como agentes redutores [2,3,4]. Usando essa estratégia verde, a etapa sintética é realizada em uma etapa e em um pote. Além disso, o processo é simples, fácil, econômico e ecológico. O tamanho, a forma e a topografia dos AuNPs dependem das concentrações dos sais e extratos de ouro, do tempo de reação, da temperatura da reação e do pH da solução. Técnicas espectroscópicas e microscópicas são empregadas para caracterizar AuNPs, incluindo espectrofotometria UV-visível, difração de raios-X, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura ( SEM), e tamanho hidrodinâmico e medições de potencial zeta. Esses AuNPs verdes são aplicados como catalisadores, antioxidantes e agentes antimicrobianos e anticâncer [5,6,7,8].

No laboratório dos autores, extratos de plantas ( Artemisia capillaris , Leonurus japonicus , Polygala tenuifolia , Caesalpinia sappan , Bupleurum falcatum e Garcinia mangostana ) têm sido usados ​​como agentes redutores para sintetizar em verde AuNPs e nanopartículas de prata (AgNPs) [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. A parte aérea de A. capillaris foi extraído e usado para a síntese de AgNPs e AuNPs [9, 15, 16]. Os AgNPs preparados exerceram excelente atividade antibacteriana contra Escherichia coli , Enterobacter cloacae , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes e Klebsiella oxytoca em comparação com o do extrato sozinho [15]. Este resultado indicou que o efeito sinérgico da combinação de AgNPs e o extrato contribuíram para o aumento da atividade antibacteriana. Curiosamente, AgNPs sintetizados usando A. capillaris na presença de brometo de cetiltrimetilamônio exibiu atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina [16]. Além disso, AuNPs sintetizados usando A. capilares mostrou atividade catalítica para a reação de redução do 4-nitrofenol [9]. L. japonicus extrato foi utilizado para a síntese de AgNPs exibindo melhorias notáveis ​​na atividade antibacteriana [10]. Observamos que a atividade antibacteriana para bactérias Gram-negativas foi maior do que para bactérias Gram-positivas. O extrato da raiz de P. tenuifolia também foi utilizado para a síntese de AuNPs e AgNPs [11, 17]. Atividade anticoagulante e atividade antibacteriana aumentadas foram observadas em AuNPs e AgNPs, respectivamente, sintetizados usando P. tenuifolia extrair. Mais interessante, AgNPs sintetizados usando C. sappana extrato mostrou atividade antibacteriana eficaz contra S. aureus [18]. O extrato de G. mangostana produziram AgNPs em formato de haltere assimétricos com efeitos apoptóticos [14].

Relatórios anteriores examinaram a síntese verde de AuNPs e AgNPs usando extrato de folha de chá [19,20,21,22,23]. Kamal e colaboradores relataram a síntese bem-sucedida de 25 nm-AgNPs [19]. Em outro relatório, AgNPs esféricos medindo 20 a 90 nm foram sintetizados usando extrato de folha de chá [20]. Os AgNPs sintetizados mostraram leve atividade antibacteriana contra E. coli . AgNPs esféricos medindo 3,42 ~ 4,06 nm também foram preparados por Loo e colaboradores usando extrato de folha de chá [21]. Vaseeharan e colegas de trabalho sintetizaram AgNPs antibacterianos usando extrato de folhas de chá [22]. Os AgNPs sintetizados foram eficazes contra o patogênico Vibrio harveyi infecção. Begum e colegas de trabalho usaram extrato de folha de chá preto para sintetizar AuNPs e AgNPs [23]. Até o momento, a maioria dos AgNPs esféricos foram sintetizados usando extrato de folhas de chá.

No presente relatório, a quitosana foi usada como agente de cobertura para AuNPs. A quitosana tem sido explorada como um veículo de entrega de drogas / genes devido à sua alta biocompatibilidade, baixa alergenicidade, biodegradabilidade e baixa toxicidade [24,25,26]. A quitosana se origina da quitina, abundante no exoesqueleto de insetos e crustáceos, como caranguejos, lagostas e camarões. A quitina é um polissacarídeo composto por N -acetil-D-glucosamina ligada por ligações glicosídicas β (1-4). A quitosana pode ser obtida a partir da quitina por um N heterogêneo -deacetilação processo. A própria quitosana possui atividade antibacteriana, antifúngica, antitumoral e antioxidante [25]. Como um agente de cobertura, a quitosana contata diretamente AuNPs através de um mecanismo eletrostérico [26]. Nanopartículas de quitosana afetam o mecanismo de captação celular pelas células A549 sem modificar a citotoxicidade [24]. Além disso, o grau de desacetilação da quitosana é mais influente do que o peso molecular na captação celular e na citotoxicidade [24].

A maioria dos estudos se concentrou na síntese de AgNPs esféricos usando extrato de folha de chá. Aqui, o extrato da folha de chá verde foi utilizado para sintetizar nanoesferas e nanoestrelas de ouro. As nanoesferas foram usadas como sementes para a síntese mediada por sementes de nanoestrelas. Para comparação, os nanobastões foram sintetizados por um método convencional comum [27]. Três formas diferentes de AuNPs (nanoesferas, nanostars e nanobastões) foram tampadas com quitosana para aumentar sua biocompatibilidade e estabilidade coloidal. Esses AuNPs foram caracterizados por espectrofotometria UV-visível, microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM) e FT-IR. As medições hidrodinâmicas do tamanho realizadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e medições do potencial zeta foram realizadas antes e após o capeamento com quitosana. A estabilidade coloidal foi avaliada em soluções salinas, tampão e meio de cultura celular. Para medir a citotoxicidade, o ensaio de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi aplicado a quatro células cancerosas:AGS (células de adenocarcinoma gástrico humano), HeLa (adenocarcinoma de colo epitelial humano células), HepG2 (células de carcinoma de hepatócitos humanos) e HT29 (células de adenocarcinoma colorretal humano). A captação celular de AuNPs em células HepG2 foi medida quantitativamente por espectroscopia de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES) e espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente com ablação a laser (LA-ICP-MS).

Materiais e métodos

Materiais e instrumentação

Ácido cloroáurico tri-hidratado (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), quitosano (de cascas de camarão, ≥ 75% desacetilado) e brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St . Louis, MO, EUA). Todos os outros reagentes foram de grau analítico. Um espectrofotômetro Shimadzu UV-1800 ou UV-2600 foi utilizado para adquirir espectros de UV-visível em uma cubeta de quartzo (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão). As medições de tamanho hidrodinâmico realizadas por DLS e medições de potencial zeta foram realizadas usando um NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Nova York, EUA). Um Varian 640 IR foi usado para adquirir espectros FT-IR (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA); a amostra medida foi preparada pelo método do disco KBr. Imagens HR-TEM foram capturadas usando um JEM-3010 operado a 300 kV (JEOL, Tóquio, Japão); a amostra foi carregada em uma grade de cobre revestida com carbono (carbono tipo-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, EUA) e deixada secar em estufa a 37 ° C por 24 h. Para sonicação, um modelo WUC-A22H foi usado (Daihan Scientific Co. LTD., Seul, República da Coréia). Um Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha) e um FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, República da Coréia) foram usados ​​para centrifugação e liofilização, respectivamente. Para a captação celular de AuNPs, foram utilizados um Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) e um J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, EUA).

Preparação do extrato de chá verde

O Instituto de Chá Verde Hadong (Hadong, Gyeongnam, República da Coréia) gentilmente ofereceu um presente de folhas de chá verde secas. Um liquidificador foi usado para preparar o pó das folhas secas. A extração foi realizada pela mistura de água desionizada (2 L) e folhas em pó (200 g). A extração foi permitida durante 1 h por sonicação à temperatura ambiente com três repetições. Os papéis de filtro Whatman foram usados ​​para filtrar frações de água para remover materiais insolúveis. Em seguida, o filtrado foi centrifugado (3.000 g força, 18 ° C, 25 min), e o sobrenadante foi recolhido. O sobrenadante recolhido foi filtrado com seringa e o filtrado foi seco por congelação. O material liofilizado foi dissolvido em água desionizada para criar uma solução estoque com uma concentração final de 2% ( w / v ) para a síntese verde descrita na seção a seguir.

Síntese de nanoesferas de ouro usando extrato

O processo de síntese de nanosfera é ilustrado na Fig. 1a. A solução estoque descrita na seção anterior foi usada para a síntese. Em um frasco de vidro, o extrato (concentração final de 0,03%) e tri-hidrato de ácido cloroáurico (concentração final de 0,5 mM) foram misturados e foi adicionado hidróxido de sódio (concentração final de 1 mM). Água desionizada foi adicionada para perfazer um volume final de 2 mL. A incubação em forno foi realizada em um forno seco a 80 ° C por 2 h. A ressonância plasmônica de superfície (SPR) das nanoesferas foi monitorada pela aquisição de espectros de UV-visível na faixa de 300 ~ 800 nm. As nanoesferas também foram utilizadas como sementes para a síntese das nanoestrelas descritas na seção seguinte.

Síntese de nanoesferas de ouro. a Um diagrama esquemático do processo de síntese e b Espectros UV-visíveis de nanoesferas antes e depois da cobertura com quitosana. Uma fotografia digital mostra as nanoesferas imediatamente após a síntese

Síntese de nanostars de ouro

O processo de síntese nanostar é ilustrado na Fig. 2a. As nanoesferas (50 μL) sintetizadas conforme descrito na seção anterior foram agitadas (750 rpm) com uma barra magnética em uma placa quente à temperatura ambiente. Foi adicionado tri-hidrato de ácido cloroáurico (0,25 mM, 5 mL) a esta solução. Após 15 s, duas soluções foram adicionadas simultaneamente:nitrato de prata (1 mM, 50 μL) e ácido ascórbico (preparado de fresco, 100 mM, 25 μL). Em seguida, a mistura foi agitada a 750 rpm durante 5 min. Os espectros de UV-visível foram adquiridos na faixa de 300 ~ 1100 nm.

Síntese de nanostars de ouro. a Um diagrama esquemático do processo de síntese e b Espectros UV-visíveis de nanoestrelas antes e depois da cobertura com quitosana. Uma fotografia digital mostra nanostars imediatamente após a síntese

Síntese de nanobastões de ouro

O processo de síntese de nanobastões é ilustrado na Fig. 3a. Para a síntese de nanobastões de ouro, a síntese mediada por sementes foi realizada de acordo com um relatório anterior com pequenas modificações [27]. A solução de crescimento foi preparada como segue. Em um frasco de vidro de 20 mL, tri-hidrato de ácido cloroáurico (10 mM, 500 μL) e brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) foram misturados. A solução era castanha amarelada. Em seguida, ácido ascórbico (preparado recentemente, 100 mM, 55 μL) foi adicionado, e esta solução foi agitada até passar de marrom amarelado a incolor. Nitrato de prata (10 mM, 100 μL) foi adicionado e agitado por 10 s. Esta solução final foi rotulada como solução de crescimento. A solução de semente foi sintetizada como segue. Em um frasco de vidro de 20 mL, tri-hidrato de ácido cloroáurico (10 mM, 250 μL) e CTAB (100 mM, 9,75 mL) foram misturados. Em seguida, borohidreto de sódio recém-preparado gelado (10 mM, 600 μL) foi adicionado e agitado em vórtice por 2 min. A solução foi rotulada como uma solução de semente. A solução de semente (12 μL) foi misturada com uma solução de crescimento sintetizada anteriormente. Os espectros de UV-visível foram adquiridos na faixa de 400 ~ 900 nm.

Síntese de nanobastões de ouro. a Um diagrama esquemático do processo de síntese e b Espectros UV-visíveis de nano-bastões antes e depois da cobertura com quitosana. Uma fotografia digital mostra os nanobastões imediatamente após a síntese

Cobertura de quitosana de nanoesferas, nanostars e nanobastões

O capeamento de quitosana foi empregado para aumentar a estabilidade coloidal e biocompatibilidade de AuNPs. A quitosana foi dissolvida em ácido acético a 1% e a concentração final foi ajustada para 0,01%. Em seguida, a sonicação foi realizada para dissolver completamente a quitosana; esta solução foi usada como uma solução estoque para cobertura de quitosana no procedimento a seguir. Tanto as nanoesferas quanto as nanoestrelas previamente sintetizadas foram tampadas com a solução estoque de quitosana (0,01%). A solução estoque de quitosana (30%, v / v ) foi misturado com a solução AuNP (70%, v / v ) A mistura foi agitada a 900 rpm durante 2 h para completar a proteção com quitosana. Para os nanobastões, o excesso de CTAB foi usado e, portanto, a centrifugação (14.000 rpm, 15 min, 25 ° C) foi realizada para remover o CTAB. Os nanobastões foram recuperados do pellet e a cobertura de quitosana foi conduzida conforme mencionado acima. Em seguida, espectros de UV-visível foram adquiridos.

Avaliação da estabilidade do colóide

A estabilidade coloidal de AuNPs é importante para aplicações in vitro e in vivo. Os três tipos de AuNPs com cobertura de quitosana e nanoesferas sem cobertura de quitosana foram avaliados quanto à estabilidade coloidal nas seguintes soluções:água deionizada, albumina de soro bovino a 5% (BSA), NaCl a 5%, PBS (pH 7,4), meio de Eagle modificado por Dulbecco ( DMEM) e meio completo. O meio completo era DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Um mililitro de cada tipo de solução AuNP foi misturado com a solução de teste como mencionado acima (0,5 mL). A mistura foi incubada a 25 ° C durante 30 min e os espectros de UV-visível foram adquiridos.

Cultura de células e citotoxicidade

As seguintes linhas de células cancerosas foram adquiridas do Korean Cell Line Bank (Seul, República da Coréia):AGS, HeLa, HepG2 e HT29. O ensaio MTT foi realizado para avaliar a citotoxicidade in vitro de AuNPs. Foi utilizado DMEM contendo piruvato de sódio. O meio de cultura de células continha 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina (100 unidades / mL) e estreptomicina (100 unidades / mL). As células foram cultivadas em placas de cultura de 100 mm e mantidas em aproximadamente 70% de confluência. Antes da cultura de células, os AuNPs de três formas diferentes foram submetidos à evaporação a vácuo para obter uma concentração final de Au de 5 mM. Em placas de 96 poços, as células foram semeadas a uma densidade de 5,0 × 10 ³ células / poço, e a incubação foi conduzida por 24 h em um forno a 37 ° C sob um CO ₂ (5%) atmosfera. Em seguida, cinco concentrações diferentes de AuNPs (500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM e 31,25 μM) foram tratadas e incubadas no forno por mais 24 h a 37 ° C sob um CO ₂ (5%) atmosfera. Em seguida, o reagente MTT (5 μL, 5% em água desionizada) foi adicionado e incubado em um forno a 37 ° C sob um CO ₂ (5%) atmosfera por mais 3 h. A absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de multi-detecção de fluorescência (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, EUA). As células não tratadas foram utilizadas como controle.

Captação celular

A captação celular de cada tipo de AuNP foi medida quantitativamente usando células HepG2. Em placas de 24 poços, as células foram semeadas a uma densidade de 5,0 × 10 ⁴ células / poço, e a incubação foi conduzida por 24 h em um forno a 37 ° C sob um CO ₂ (5%) atmosfera. Em seguida, 5 μM (concentração final) de cada tipo de solução AuNP foram tratados e incubados no forno por mais 24 h a 37 ° C sob um CO ₂ (5%) atmosfera. Após a incubação, a solução contendo excesso de AuNPs foi removida e as células foram tratadas com tripsina. A concentração de Au nas células tripsinizadas foi medida quantitativamente por ICP-OES e LA-ICP-MS, que forneceram a concentração de captação de Au nas células. O controle foi de 5 μM da solução coloidal original de cada tipo de AuNP, que também foi analisado por ICP-OES e LA-ICP-MS para obtenção da concentração de Au.

Resultados e discussão

Espectro UV-visível

Os espectros de UV-visível são comumente adquiridos para confirmar a síntese de AuNPs. O SPR característico de AuNPs pode ser observado na faixa de comprimento de onda do infravermelho próximo ao visível. Além disso, o capeamento de AuNPs geralmente induz um deslocamento batocrômico (ou vermelho) ou hipsocrômico (ou azul). Além disso, uma mudança hipocrômica é geralmente induzida junto com mudanças para vermelho e azul. Como mostrado na Fig. 1b, os espectros de UV-visível foram monitorados em uma faixa de 300 ~ 800 nm. As nanoesferas mostraram um SPR característico de 532 nm com uma cor bordô profunda. Após o capeamento de quitosana das nanoesferas, o SPR máximo foi desviado para o vermelho para 537 nm, juntamente com um desvio hipocrômico (Fig. 1b). Uma ampla faixa de comprimentos de onda SPR (600 ~ 800 nm) com uma solução azul escura foi observada para as nanostars (Fig. 2b). O capeamento de quitosana das nanostars mostrou um deslocamento hipocrômico, onde a absorbância foi menor do que a de AuNPs sem capeamento de quitosana (Fig. 2b). Os nanobastões apresentaram dois comprimentos de onda SPR distintos de 514 nm e 815 nm, com a formação de uma solução rosa claro (Fig. 3b). O capeamento de quitosana de nanobastões induziu um desvio para o azul para 797 nm, juntamente com um desvio hipocrômico (Fig. 3b). Considerando todos esses resultados, o capeamento de AuNPs com quitosana alterou o comprimento de onda do SPR e induziu deslocamentos. O exame cuidadoso dos espectros de UV-visível demonstrou que os três tipos de AuNPs foram tampados com sucesso com quitosana.

Tamanho hidrodinâmico e potenciais zeta

Em seguida, o tamanho hidrodinâmico e os potenciais zeta foram medidos; os resultados são mostrados na Tabela 1. Sem cobertura de quitosana, os tamanhos hidrodinâmicos das nanoesferas e nanoestrelas foram 28,4 e 97,8 nm, respectivamente. O tamanho hidrodinâmico dos nanobastões não foi medido porque o tamanho hidrodinâmico foi bem ajustado às formas esféricas das nanopartículas. Com o capeamento de quitosana, o tamanho hidrodinâmico foi aumentado para 190,7 nm para nanoesferas e 123,9 nm para nanostars. O capeamento de quitosana foi confirmado por um aumento no tamanho hidrodinâmico. A mudança nos potenciais zeta também refletiu o capeamento de quitosana na superfície de AuNPs. A quitosana é um polissacarídeo com carga positiva; assim, o capeamento de quitosana resultou em potenciais zeta positivos para todos os três tipos de AuNPs. Para as nanoesferas, o potencial zeta foi alterado de -12,73 a 42,28 mV. O potencial zeta das nanostars foi alterado de -42,46 para 47,44 nm. No caso dos nanobastões, CTAB (um surfactante catiônico) foi utilizado para a síntese. Assim, o potencial zeta original era de 27,96 mV sem limite. O capeamento de quitosana de nanobastões aumentou o potencial zeta para 33,23 nm. Portanto, a mudança nos potenciais zeta de valores negativos para positivos para as nanoesferas e nanoestrelas indicou claramente um capeamento bem-sucedido com quitosana. Além disso, o potencial zeta dos nanobastões aumentou, sugerindo que a superfície foi coberta com quitosana.

Imagens HR-TEM

A microscopia é crucial para a pesquisa de nanopartículas, fornecendo informações essenciais sobre o tamanho e a forma das nanopartículas. As ferramentas de microscopia fornecem uma variedade de informações detalhadas, como o estado de dispersão, morfologia e topografia bidimensionais e tridimensionais e maciez / dureza relativa dos materiais. As nanoesferas mediram 8,7 ± 1,7 nm, com base na média de 75 nanopartículas discretas selecionadas aleatoriamente em imagens HR-TEM (Fig. 4). O tamanho mais abundante foi de 8 ~ 9 nm (29,3%), seguido por 9 ~ 10 nm (12,0%). Com o capeamento de quitosana, a forma das nanoesferas foi conservada sem qualquer alteração na forma (Fig. 4c, d). A natureza cristalina das partículas foi claramente indicada pelas estruturas de rede mostradas na Fig. 4d. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,24 nm (Fig. 4d). Além disso, a camada de quitosana também foi visualizada, conforme indicado pelas setas vermelhas na Fig. 4d. As nanostars foram visualizadas por HR-TEM, como mostrado na Fig. 5. As nanostars mediram 99,0 ± 47,0 nm, representando a média de 19 nanopartículas discretas. A estrutura da rede é indicada em uma imagem ampliada (Fig. 5c). Como mostrado, a distância entre as redes vizinhas foi medida em 0,24 nm (Fig. 5c). As setas vermelhas na Fig. 5c indicam a camada de quitosana. Os nanobastões foram visualizados como mostrado na Fig. 6. O comprimento e a largura médios das partículas foram 60,4 nm e 16,4 nm, respectivamente, de acordo com as medições feitas para 28 partículas. A proporção de aspecto, definida como o comprimento da partícula dividido pela largura da partícula, foi 3,7. A estrutura da rede é mostrada na Fig. 6c, confirmando a estrutura cristalina dos nanobastões. A distância entre as redes vizinhas foi medida em 0,23 nm (Fig. 6c). As setas vermelhas indicam a camada de quitosana (Fig. 6c).

Imagens HR-TEM de nanoesferas de ouro. As barras de escala representam a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm e d 5 nm. Imagens a e b foram obtidos sem cobertura de quitosana, e c e d foram obtidos com cobertura de quitosana. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,24 nm. As setas vermelhas indicam a camada de quitosana após a cobertura

Imagens HR-TEM de nanostars de ouro. As barras de escala representam a 200 nm, b 50 nm e c 5 nm. d Uma representação esquemática de nanostars com um tamanho médio de 99,0 ± 47,0 nm. Imagem a foi obtido sem cobertura de quitosana, e b e c foram obtidos com cobertura de quitosana. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,24 nm. As setas vermelhas indicam a camada de quitosana após a cobertura

Imagens HR-TEM de nanobastões de ouro. As barras de escala representam a 100 nm, b 200 nm e c 5 nm. d Uma representação esquemática de nanobastões com comprimento e largura médios de 60,4 nm e 16,4 nm, respectivamente. Imagem a foi obtido sem cobertura de quitosana, e b e c foram obtidos com cobertura de quitosana. A distância entre redes vizinhas foi medida em 0,23 nm. As setas vermelhas indicam a camada de quitosana após a cobertura

Espectro FT-IR

O chá verde contém diversos metabólitos primários e secundários. Especificamente, os principais constituintes do chá verde são polifenóis, incluindo epigalocatequina-3-galato, (-) - epicatequina-3-galato, (-) - epigalocatequina e (-) - epicatequina [28]. Os espectros FT-IR foram adquiridos para obter informações sobre os grupos funcionais que contribuíram para a síntese de AuNPs. Comparamos o espectro FT-IR das nanoesferas com o espectro do extrato (Fig. 7). O principal grupo funcional mais provavelmente envolvido na reação de redução dos sais de Au foi –OH. No extrato, grupos funcionais –OH apareceram em 3255 cm ⁻¹ (Fig. 7a). Após a síntese, este pico foi deslocado para um número de onda maior em 3300 ~ 3341 cm ⁻¹ . Este resultado demonstrou que os grupos funcionais –OH se originaram de polifenóis oxidados a C =O enquanto reduziam os sais de Au a AuNPs. Notavelmente, o aparecimento de grupos funcionais C =O em 1716 cm ⁻¹ em nanoesferas claramente suportou a oxidação de grupos funcionais –OH durante a síntese (Fig. 7b).

Espectros FT-IR de a extrato de chá verde usado para síntese e b nanoesferas de ouro

Avaliação da estabilidade coloidal sob várias soluções

A estabilidade coloidal das nanopartículas é uma preocupação importante para aplicações diagnósticas e terapêuticas. Seis soluções diferentes foram testadas quanto à estabilidade coloidal:(i) água desionizada, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM, e (vi ) meio completo (DMEM com 10% de FBS). Depois de misturar cada tipo de AuNPs com a solução de teste, os espectros de UV-visível foram adquiridos; os resultados são mostrados na Tabela 2 e Fig. 8. Um deslocamento hipocrômico junto com um ligeiro deslocamento para o vermelho ou azul foi observado para todos os três tipos de AuNPs no espectro de UV-visível (Fig. 8a, c e e). A forma do espectro foi mantida, e nenhuma agregação da solução coloidal foi observada (Fig. 8b, d e f). Este resultado demonstrou que a estabilidade coloidal foi muito bem mantida nas soluções de teste mencionadas acima.

Avaliação da estabilidade coloidal. a e b nanoesferas com cobertura de quitosana, c e d nanostars com cobertura de quitosana, e e f nanorods com cobertura de quitosana, g e h nanoesferas sem cobertura de quitosana. DW representa água desionizada

Na Tabela 2, o deslocamento hipocrômico é expresso como a porcentagem da absorbância retida, com a absorbância da solução original ajustada para 100%. Em todos os três AuNPs, a estabilidade coloidal foi melhor mantida em meio completo, que foi usado para os experimentos de citotoxicidade subsequentes:nanoesferas (65,3%), nanostars (93,4%) e nanobastões (80,2%). A solução de proteína, BSA (5%), também forneceu estabilidade coloidal razoável:nanoesferas (61,8%), nanostars (70,2%) e nanobastões (72,0%). Esses resultados indicaram que as proteínas que recobrem as nanopartículas têm efeitos benéficos adicionais na estabilidade coloidal dos AuNPs juntamente com o capeamento de quitosana. A estabilidade coloidal das nanoesferas sem cobertura de quitosana também foi avaliada (Fig. 8g, h). Todas as soluções induziram uma mudança hipocrômica. Entre as soluções testadas, apenas a solução de NaCl (5%) apresentou um grande desvio para o vermelho junto com um desvio hipocrômico.

Citotoxicidade

Um ensaio de MTT foi realizado para medir a citotoxicidade contra quatro tipos de células cancerosas (Fig. 9):AGS, HeLa, HepG2 e HT29. A citotoxicidade de todos os três tipos de AuNPs era dependente da concentração de Au. Entre os quatro tipos de células, a maior citotoxicidade foi observada para células HepG2. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). a AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.

Conclusão

The continued development of nanotechnology requires elaborate shape and size designs of nanoparticles for successful applications, including as drug delivery carriers or vehicles for biologically active compounds such as anticancer agents. Green tea extract was used as a green reducing agent for the synthesis of Au nanospheres and nanostars. Interestingly, the cytotoxicity of nanorods was higher than that of nanospheres and nanostars, while nanospheres showed the lowest cytotoxicity against four types of cancer cells. Cellular uptake by HepG2 cells was most likely dependent on shape and size; nanospheres showed the highest uptake by the cells, whereas nanostars showed the lowest uptake. The optimization of size and shape together with surface modification and functionalization will lead to the development of nanoparticles for future use in nanomedicine.

Abreviações

AFM:

Força atômica microscópica

AgNPs:

Nanopartículas de prata

AGS:

Human gastric adenocarcinoma cells

AuNPs:

Nanopartículas de ouro

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

DMEM:

Meio Eagle modificado por Dulbecco

FBS:

Soro fetal bovino

FT-IR:

Fourier-transform infrared spectroscopy

HeLa:

Human epithelial cervix adenocarcinoma cells

HepG2:

Human hepatocyte carcinoma cells

HR-TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

HT29:

Human colorectal adenocarcinoma cells

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

LA-ICP-MS:

Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

SPR:

Ressonância de plasmon de superfície

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