Como Nanotubos de Carbono de Múltiplas Paredes Promovem Desenvolvimento de Raízes Laterais de Tomate via Sinalização de Óxido Nítrico

Resumo

Estudos abundantes revelaram que nanotubos de carbono de múltiplas paredes (MWCNTs) são tóxicos para plantas. No entanto, se ou como MWCNTs influenciam formação de raízes laterais (RL), que é componente importante da adaptabilidade do sistema radicular a vários sinais ambientais, permanece controverso. Neste relatório, encontramos que MWCNTs podem entrar em raízes de mudas de tomate. A administração com MWCNTs promoveu formação de RL de tomate de forma aproximadamente dependente da dose. Produção endógena de óxido nítrico (NO) foi desencadeada por MWCNTs, confirmada por método do reagente de Griess, ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e microscopia confocal a laser (LSCM), junto com o sequestrador de NO. Existe relação causa-efeito entre MWCNTs e NO na indução de desenvolvimento de RL, já que síntese de NO e formação de RL desencadeadas por MWCNTs foram obviamente bloqueadas pela remoção de NO endógeno com seu sequestrador. A atividade de enzima geradora de NO redutase de nitrato (NR) foi aumentada em resposta a MWCNTs. Inibição de NR por tungstato não apenas prejudicou produção de NO, mas também aboliu formação de RL desencadeada por MWCNTs. A adição de N^G-nitro-L-arginina metil éster (l-NAME), inibidor de enzima sintase de óxido nítrico (NOS) tipo mamífera, falhou em influenciar formação de RL. Coletivamente, propomos que NO pode atuar como molécula de sinalização downstream no controle de MWCNTs de desenvolvimento de RL, pelo menos parcialmente via NR.

Introdução

Existem muitas aplicações biológicas e biomédicas de nanotubos de carbono [1, 2]. Devido à capacidade única de penetrar facilmente membranas celulares, a biossegurança de nanotubos de carbono é sempre tópico de debate [3, 4]. Enquanto isso, desde que produção e uso de nanotubos de carbono crescem rapidamente, torna-se importante caracterizar mecanismos detalhados de sua citotoxicidade em seres humanos e mamíferos, e recentemente em plantas [3,4,5,6,7,8,9]. É bem sabido que plantas e suas comunidades são muito importantes para humanos e ambiente, e elas estão em risco de exposição a nanotubos de carbono também, devido a acúmulo em solos através de aplicação de fertilizante de biossólidos [6, 10, 11]. Como membros importantes de nanotubos de carbono, a toxicidade de nanotubos de carbono de múltiplas paredes (MWCNTs), consistindo de múltiplas camadas enroladas de grafeno, tem sido amplamente investigada. Estudos em mamíferos revelaram que exposição com ambos MWCNTs e nanotubos de carbono de parede única induziram dano oxidativo e ativação de NF-κB em queratinócitos humanos e células A549 [9, 12]. MWCNTs e nanotubos de carbono de parede única podem fundir com membrana plasmática, causando dano celular através de peroxidação lipídica e estresse oxidativo [9, 11, 13, 14]. Citotoxicidade e estresse oxidativo desencadeados por MWCNTs, bem como respostas inflamatórias modestas, foram observados em células endoteliais de veia umbilical humana [15]. Estudo prévio sugeriu que toxicidade primária de MWCNTs em espinafre vermelho foi principalmente derivada de superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS), e efeitos tóxicos poderiam ser revertidos por ácido ascórbico suplementado [7]. Neste sentido, MWCNTs é considerado novo fator de estresse para organismos, seja em animais ou plantas.

Formação de raiz lateral (RL), determinante importante da arquitetura radicular, tem sido considerada como indicador de resposta adaptativa a vários estresses [16]. Em plantas superiores, formação de RL é influenciada por fitohormônios e ampla gama de sinais ambientais, incluindo disponibilidade de água, nutrientes e estresse abiótico, como hipóxia e estresse por metais pesados [17,18,19]. Enquanto isso, ampla evidência confirmou que formação de RL não apenas atua como suporte físico, mas também contribui para absorção de água e nutrientes para crescimento e desenvolvimento de plantas [19,20,21]. Diferentes pistas ambientais poderiam desencadear vários fenótipos de resposta morfogênica induzida por estresse (SIMR), incluindo promoção de formação de RL e inibição de alongamento de raiz primária [17]. A regulação de formação de RL também é rigidamente controlada por fitohormônios, como auxina, e ativação de genes reguladores de ciclo celular em resposta a auxina foi sugerida [19, 22]. Enquanto isso, o envolvimento de algumas moléculas pequenas em organogênese radicular induzida por auxina foi confirmado em pepino, tomate, soja e plantas de colza [23,24,25,26,27]. Estas moléculas pequenas incluem peróxido de hidrogênio (H₂O₂), óxido nítrico (NO), monóxido de carbono (CO) e gás hidrogênio (H₂).

Entre estes, NO, gás radical livre, tem mostrado ter múltiplas funções fisiológicas em plantas [28, 29]. Além do aumento de adaptação de plantas contra estresses, funções de NO incluem promoção de desenvolvimento de pêlos radiculares, enraizamento adventício e formação de raiz lateral [30,31,32,33], embora recurso(s) enzimático(s) de biossíntese de NO naqueles processos supracitados permaneça elusivo. Em animais, síntese de NO a partir de L-arginina é catalisada pela enzima contendo heme sintase de óxido nítrico (NOS) [34]. Embora gene(s) codificando enzimas NOS não tenha sido identificado em plantas, atividade tipo NOS mamífera é detectada amplamente [35, 36], e inibidores de NOS mamífero, como N^G-nitro-L-arginina metil éster hidrocloreto (l-NAME), podem inibir geração de NO em plantas [25, 33, 36,37,38,39]. Importantemente, ampla evidência genética revelou que NO pode ser produzido por redutase de nitrato (NR), enzima bem conhecida responsável por metabolismo de nitrogênio em plantas [28]. O envolvimento de produção de NO mediada por NR em fechamento estomático e aclimatação a frio foi demonstrado geneticamente [37, 38]. Nosso estudo prévio mostrou que síntese de NO dependente de NR está envolvida em formação de raiz lateral mediada por gás hidrogênio induzida por auxina [39].

Até agora, diferentes respostas em formação de RL, promoção ou inibição, foram respectivamente relatadas em várias espécies de plantas quando suplementadas com nanomateriais, incluindo MWCNTs [40,41,42,43], nanopartículas de ouro (Au NP, [44]), nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NP [45, 46];), nanopartículas de dióxido de titânio (TiO₂ NP [46];), e óxido de grafeno (GO [47,48,49];) (Tabela 1), e nenhum estudo ainda forneceu prova definitiva de papel de NO nas respostas acima. Neste estudo, detecção de NO endógeno por método do reagente de Griess, microscopia confocal a laser (LSCM) e análises de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) revelaram que nível de NO foi aumentado em mudas de tomate tratadas com MWCNTs. Depois, formação de RL foi observada. Estudamos further o envolvimento de NO em formação de RL desencadeada por MWCNTs, manipulando níveis endógenos de NO usando sequestrador de NO e antagonistas que inibem atividade de NR e NOS tipo mamífera. Experimento further revelou que NO dependente de NR pode ser, pelo menos parcialmente, essencial para formação de RL em resposta a MWCNTs. Este trabalho assim abre nova janela para entender efeitos biológicos de nanomateriais em plantas.

Materiais e Métodos

Químicos

Salvo indicação contrária, todos os outros químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA). MWCNTs, adquiridos da Sigma-Aldrich, foram caracterizados como descrito previamente [50]. Diâmetro externo, diâmetro interno e comprimento dos MWCNTs eram 6–12 nm, 2,5–5 nm e 1–9 μm, respectivamente. Após tratamento de sonicação, a suspensão coloidal homogeneizada obtida foi esterilizada e usada.

Outras nanopartículas de carbono foram obtidas da Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., incluindo nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs, XFS22; pureza > 95%, diâmetro 1–2 nm, comprimento 5–30 μm, área de superfície especial > 1075 m²/g), grafeno (XF001W; pureza ~ 99%, diâmetro 0,5–5 μm, espessura ~ 0,8 nm, razão de camada única ~ 80%, área de superfície BET 500~1000 m²/g; resistividade elétrica ≦ 0,30 Ω.cm), e carbono ativo (AC, XFP06; pureza > 95%, tamanho de partícula 5 ± 1 μm, volume de poro 1–1,2 cm³/g, abertura 2,0–2,2 nm, área de superfície especial ~ 1500–1700 m²/g).

Adicionalmente, nitroprussiato de sódio (SNP) foi usado como composto liberador de NO [30,31,32,33]. 2-(4-Carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido sal de potássio (cPTIO) foi considerado como sequestrador de NO [51,52,53,54]. Tungstato (Tg; inibidor de NR [28, 33, 37, 55,56,57];) e N^G-nitro-L-arginina metil éster hidrocloreto (NAME; inibidor de enzima NOS tipo mamífera [25, 33, 36,37,38,39];) também foram aplicados. Neste estudo, concentrações dos químicos acima foram determinadas em experimentos piloto, dos quais respostas significativas foram observadas.

Material Vegetal, Condições de Crescimento e Determinação de Formação de RL

Tomate (Solanum lycopersicum L.) sementes "Jiangshu 14" foram gentilmente fornecidas por Institutos Agrícolas de Jiangsu, Nanjing, Província de Jiangsu, China. Sementes selecionadas de tamanho idêntico foram germinadas em água destilada a 25 ± 1 °C no escuro por 3 dias. Mudas selecionadas idênticas com radículas de 2–3 mm foram então transferidas para soluções de tratamento de 6 mL contendo as concentrações indicadas de MWCNTs, 200 nM ácido 1-naftilacético (NAA; auxina bem conhecida), 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, 20 μM tungstato (Tg), 0,2 mM NAME, e outras nanopartículas de carbono, incluindo 5 mg/mL nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs), grafeno e carbono ativo (AC), sozinhos ou em combinação para os pontos temporais indicados. Mudas foram cultivadas em incubadora iluminada (25 ± 1 °C) com intensidade de luz de 200 μmol m⁻² s⁻¹ a fotoperíodo 14/10 h (luz/escuro).

Após tratamentos, fotos foram tiradas, e o número e comprimento de raiz lateral emergida (> 1 mm) por muda foram então determinados usando software Image J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) [39, 58]. Conforme descrito previamente, apenas segmentos indutíveis de raiz lateral foram usados para análise subsequente.

Imageamento de Distribuição de MWCNTs por Microscopia Eletrônica de Transmissão

A distribuição de MWCNTs em raiz de muda de tomate foi caracterizada usando microscopia eletrônica de transmissão (MET; JEOL, JEM-200CX, Tóquio, Japão). Preparação de amostra para análise MET foi de acordo com protocolo prévio [59].

Imageamento de NO Endógeno por Microscópio Confocal a Laser

Imageamento de NO foi realizado usando sonda fluorescente NO razoavelmente específica 4-amino-5-metilamino-2′,7′-difluorofluoresceína diacetato (DAF-FM DA). Após a sonda ser lavada completamente, as imagens foram obtidas usando microscópio confocal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha, excitação a 488 nm, emissão a 500–530 nm para análise de NO). Em nosso experimento, 20 amostras individuais foram aleatoriamente selecionadas e medidas por tratamento. Fotografias são representativas de resultados idênticos.

Conteúdo de NO Determinado por Ensaio do Reagente de Griess

De acordo com métodos previamente descritos [50], conteúdo de NO foi determinado com ensaio do reagente de Griess. Importantemente, para escapar interferência causada por conteúdos concentrados de nitrato e nitrito em plantas, amostras idênticas pré-incubadas em 200 μM cPTIO (sequestrador de NO) por 30 min foram consideradas como amostras em branco. Após adição do reagente de Griess por 30 min, absorbância foi registrada a 540 nm, e conteúdo de NO foi determinado por comparação a curva padrão de NaNO₂.

Determinação de NO com Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR)

De acordo com nossos métodos prévios [39, 55, 60], determinação de nível de NO usando ressonância paramagnética eletrônica (EPR) foi realizada. Camada de solvente orgânico foi usada para determinar NO em espectrômetro Bruker A300 (Bruker Instrument, Karlsruhe, Alemanha) sob as seguintes condições: temperatura ambiente; frequência de microondas, 9,85 GHz; potência de microondas, 63,49 mW; e frequência de modulação, 100,00 kHz.

Determinação de Atividade de Redutase de Nitrato (NR)

Atividade de NR foi detectada espectrofotometricamente a 540 nm de acordo com método prévio [57]. Nitrito produzido foi determinado espectrofotometricamente a 540 nm pela adição de 1 mL de 1% (p/v) sulfanilamida em 3 M HCl junto com 1 mL de 0,02% (v/v) n-(1-naftil)-etilenodiamina.

Análise Estatística

Onde indicado, resultados foram expressos como valores médios ± EE de três experimentos independentes com três replicatas biológicas para cada. Análise estatística foi realizada usando software SPSS Statistics 17.0. Para análise estatística, teste múltiplo de Duncan (p < 0,05) foi escolhido como apropriado.

Resultados

MWCNTs não apenas Entram em Células Radiculares, mas também Promovem Formação de RL

Formação de RL é determinante maior da arquitetura de sistemas radiculares. Para investigar efeito de MWCNTs em formação de RL, mudas de tomate de 3 dias foram incubadas com uma gama de concentrações de MWCNTs (0,05, 0,5, 5 e 50 mg/mL) por 3 dias. Aplicação de ácido 1-naftilacético (NAA) foi considerada como controle positivo. Em nosso experimento, tanto número quanto comprimento de RL foram determinados como dois parâmetros de formação de RL. Como mostrado na Fig. 1, comparado às amostras controle, MWCNTs exógenos induziram significativamente formação de RL de forma aproximadamente dependente da dose, com efeito máximo em 5 e 50 mg/mL. Resposta indutível similar foi observada quando 200 nM NAA foi administrado. Considerando custo de MWCNTs e resposta indutível em formação de RL, 5 mg/mL MWCNTs foi aplicado nos experimentos seguintes.

Formação de RL de tomate induzida por MWCNTs foi de forma aproximadamente dependente da dose. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com 200 nM NAA e as concentrações indicadas de MWCNTs, respectivamente. O número e comprimento de raiz lateral emergida (> 1 mm) por muda foram então determinados após 3 dias de tratamento. Havia 30 (10 × 3) plantas em três replicatas biológicas, e os experimentos foram conduzidos por 3 vezes. Dados são médias ± EE. Dentro de cada conjunto de experimentos, barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Duncan

Para validar função específica de MWCNTs na indução de formação de RL, further investigamos se outras alotropias de MWCNTs também têm tais efeitos indutíveis. Como mostrado na Fig. 2a, todos estes nanomateriais de carbono exibiram efeitos tóxicos em crescimento de parte aérea (dados não mostrados). Curiosamente, aplicação de MWCNTs, nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs), grafeno e carbono ativo com concentração idêntica (5 mg/mL) poderiam diferencialmente resultar em aumentos em número e comprimento de RL, comparado a plantas controle sem químicos (Fig. 2b). Entre estes químicos, a resposta indutível máxima foi descoberta em mudas de tomate incubadas com MWCNTs.

Mudanças em formação de raiz lateral em resposta a diferentes nanopartículas de carbono. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com água destilada (Con), 5 mg/mL MWCNT, nanotubos de carbono de parede única (SWCNTs), grafeno e carbono ativo (AC), respectivamente, por mais 3 dias. a Fotos representativas foram então tiradas. b O número e comprimento de raiz lateral emergida (> 1 mm) por muda foram então determinados também. Barra de escala = 50 mm. Havia 30 (10 × 3) plantas em três replicatas biológicas, e os experimentos foram conduzidos por 3 vezes. Dados são médias ± EE. Dentro de cada conjunto de experimentos, barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Duncan

Com auxílio de microscopia eletrônica de transmissão (MET), a distribuição de MWCNTs pode ser avaliada facilmente. Resultados mostrados na Fig. 3 revelaram que MWCNTs, quando aplicados exogenamente, poderiam ser absorvidos por mudas de tomate, e a distribuição de MWCNTs foi encontrada em células radiculares. Este resultado pode ser entendido, já que raízes de mudas são diretamente cultivadas em solução líquida contendo MWCNTs.

Distribuição de MWCNTs em raízes de tomate. Imagens de MET de mudas de tomate de 3 dias tratadas com água destilada (Con; a) ou 5 mg/mL MWCNTs (b) por 1 dia foram tiradas. Seta vermelha indica parede celular, enquanto seta branca indica MWCNTs

Síntese de NO Induzida por MWCNTs e Formação de RL Thereafter Foram Sensíveis a cPTIO, Sequestrador de NO

Para investigar se NO também está envolvido em formação de RL induzida por MWCNTs, a função de NO em formação de RL elicitada por MWCNTs foi avaliada manipulando níveis endógenos de NO usando composto liberador de NO e o sequestrador. Similar a resultados prévios [31], administração de nitroprussiato de sódio (SNP) poderia resultar em indução de formação de RL, e resposta aditiva foi observada quando SNP e MWCNTs foram aplicados juntos (Fig. 4). Quando 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido sal de potássio (cPTIO; sequestrador de NO) foi adicionado, as respostas de promoção em formação de RL causadas por MWCNTs foram significativamente prejudicadas. Sozinho, cPTIO poderia inibir desenvolvimento de RL, comparado ao controle sem químicos, indicando papel importante de NO endógeno em organogênese radicular.

Formação de RL induzida por MWCNTs foi sensível à remoção de NO endógeno com cPTIO, seu sequestrador. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com água destilada, 5 mg/mL MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, sozinhos ou em combinação por 3 dias. Depois, o número e comprimento de raiz lateral emergida (> 1 mm) por muda foram então determinados. Havia 30 (10 × 3) plantas em três replicatas biológicas, e os experimentos foram conduzidos por 3 vezes. Dados são médias ± EE. Dentro de cada conjunto de experimentos, barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Duncan

Para further avaliar papel importante de NO endógeno em resposta a MWCNTs, um curso temporal de produção de NO in vivo foi primeiramente detectado com método do reagente de Griess. Durante determinação acima, o filtrado idêntico pré-tratado com cPTIO foi considerado como branco para resultados precisos. Observou-se que produção de NO em raízes de mudas de tomate aumentou dramaticamente até 24 h após tratamento com MWCNTs e então recuperou aos níveis iniciais (48 h; Fig. 5a). Acima nível máximo de NO endógeno desencadeado por MWCNTs por 24 h foi obviamente abolido por cPTIO, sequestrador de NO, sugerindo papel específico de NO.

Produção de NO induzida por MWCNTs foi bloqueada por cPTIO, sequestrador de NO. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com água destilada e 5 mg/mL MWCNTs com ou sem 0,2 mM cPTIO, respectivamente. a Mudanças em atividade de NR (esquerda), e produção de NO (direita) determinadas usando método do reagente de Griess. b Após tratamento por 24 h, sinal de NO foi analisado por LSCM (esquerda) e EPR (direita). Barra de escala = 0,1 mm. Dados são médias ± EE. Barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Ducan

Para confirmar resultados acima, tanto LSCM quanto ESR foram adotados. Primeiramente, as mudanças em níveis endógenos de NO em raízes de mudas de tomate foram monitoradas marcando NO usando sonda fluorescente permeável a células, razoavelmente específica de NO, DAF-FM DA e imageando com LSCM. Similar aos resultados prévios (Fig. 5a), na presença de cPTIO, a intensidade de fluorescência dependente de DAF-FM aumentada por MWCNTs foi grandemente abolida (Fig. 5b). Estes resultados implicaram que fluorescência desencadeada por DAF-FM está relacionada a níveis endógenos de NO em raízes de mudas de tomate.

Produção de NO induzida por MWCNTs foi confirmada por espectroscopia EPR. Como esperado, raízes de mudas tratadas por 24 h com MWCNTs apresentaram a típica estrutura de hiperfina triplet do complexo NO. No entanto, adição de cPTIO aboliu sinal acima, indicando que exposição a MWCNTs de fato resultou em forte produção de NO (Fig. 5b). Coletivamente, estes dados sugeriram que síntese de NO pode ser necessária para formação de RL desencadeada por MWCNTs em mudas de tomate.

NR Pode Ser Responsável por Produção de NO Induzida por MWCNTs e Formação de RL Thereafter

Como NR e NOS tipo mamífera são duas enzimas principais relacionadas à síntese de NO em plantas, tanto tungstato (inibidor de NR) quanto NAME (inibidor de NOS mamífero) foram aplicados no experimento subsequente. Aqui, tratamento com tungstato substancialmente suprimiu promoção de formação de RL em raízes de mudas de tomate tratadas com MWCNTs (Fig. 6). Comparativamente, indução de formação de RL desencadeada por MWCNTs não foi fortemente inibida pela adição de NAME, indicando que NOS tipo mamífera pode não ser a enzima sintética de NO alvo responsável por produção de NO elicitada por MWCNTs. Também foi observado que diminuição leve mas não significativa em formação de RL foi observada em mudas de tomate quando tungstato ou NAME foi aplicado separadamente.

Mudanças em formação de RL em resposta a MWCNTs e dois inibidores de síntese de NO. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com 5 mg/mL MWCNT, 20 μM tungstato (Tg), 0,2 mM NAME, sozinhos ou em combinação por 3 dias. Depois, o número e comprimento de raiz lateral emergida (> 1 mm) por muda foram então determinados. Havia 30 (10 × 3) plantas em três replicatas biológicas, e os experimentos foram conduzidos por 3 vezes. Dados são médias ± EE. Dentro de cada conjunto de experimentos, barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Duncan

Papel de NR em formação de RL desencadeada por MWCNTs foi further examinado monitorando produção de NO em resposta a MWCNTs aplicados com ou sem tungstato. Comparado às mudanças em produção endógena de NO (Fig. 5a), análise de curso temporal em atividade de NR mostrou tendência similar (Fig. 7a), também atingindo pico a 24 h após tratamento com MWCNTs. Estes resultados sugeriram que aumento de produção de NO induzido por MWCNTs pode resultar principalmente de atividade aumentada de NR. Consistentemente, inibição de produção de NO dependente de NR por tungstato foi confirmada usando método do reagente de Griess (Fig. 7b), LSCM e EPR (Arquivo Adicional 1: Figura S1).

Produção de NO induzida por MWCNTs foi bloqueada por tungstato, inibidor de NR. Mudas de tomate de 3 dias foram tratadas com água destilada e 5 mg/mL MWCNTs com ou sem 20 μM tungstato (Tg). Mudanças em atividade de NR (a) e produção de NO (b) determinadas usando método do reagente de Griess. Dados são médias ± EE. Barras denotadas pela mesma letra não diferiram significativamente em p < 0,05 nível segundo teste múltiplo de Ducan

Discussão

Fitotoxicidade é consideração significativa em entender impacto ambiental potencial de nanopartículas [4, 7, 61,62,63]. Evidência abundante revelou que MWCNTs são tóxicos para plantas, incluindo indução de dano oxidativo, inibição de germinação de sementes, crescimento e desenvolvimento de raiz [11, 63, 64]. No entanto, sendo como fenótipo de SIMR, ramificação radicular através de formação de raiz lateral é componente importante da adaptabilidade do sistema radicular a vários sinais ambientais [17]. Neste trabalho, integramos análise biológica, farmacológica e bioquímica para mostrar envolvimento de produção de NO mediada por NR em formação de RL induzida por MWCNTs, pelo menos parcialmente em nossas condições experimentais. Também, a função de NO em organogênese radicular estimulada por MWCNTs enfatizou papéis centrais deste segundo mensageiro envolvido em processo de desenvolvimento de plantas e adaptação contra estresse [29,30,31,32,33, 37, 38].

Primeiro, confirmamos que 5 mg/mL MWCNTs (DE 6–12 nm) podiam entrar em tecidos radiculares (Fig. 3). Depois, indução de formação de RL de tomate foi observada (Fig. 1), imitando papéis de indução de NAA e SNP (Fig. 4), composto liberador de NO bem conhecido [30, 31]. Respostas indutoras similares foram descobertas em árvores resinosas [41], alface [42] e Arabidopsis [43] quando desafiadas com MWCNTs (DE 6–13 nm, cerca de 9,5 nm e 30–40 nm, respectivamente). Por exemplo, aplicação com MWCNT pristino (p-MWCNT) ou MWCNT carboxil-funcionalizado (c-MWCNT) (diâmetro médio 9,5 nm) poderia promover desenvolvimento de RL em mudas de alface [42]. Por outro lado, inibição de raiz primária e até formação de RL foram simultaneamente encontradas em plantas de soja quando submetidas a MWCNTs (DE 20–70 nm [40];). Comparando com dados de diâmetro externo de MWCNTs (Tabela 1), supusemos que efeitos de MWCNTs em formação de RL variam com seus diâmetros, mostrando promoção com diâmetro menor e inibição com diâmetro maior. Certamente, mecanismo relacionado deve ser cuidadosamente investigado. Fenômeno similar foi confirmado em tolerância a salinidade de plantas [50]. Combinado com resultados acima, foi further deduzido que função de nanomateriais pode variar de espécie, e vice-versa, diferentes tipos de nanomateriais podem causar vários efeitos biológicos. No entanto, outros fatores influentes, como diferentes doses de MWCNTs [48] e até condições de crescimento de plantas, não poderiam ser facilmente descartados.

Comparado com outros nanomateriais, incluindo SWCNT, grafeno e AC com concentração idêntica, indução máxima em formação de RL e até efeitos tóxicos em crescimento de parte aérea foram observados em MWCNTs (Fig. 2). Estes podem estar relacionados às características físicas especiais de MWCNTs, um tipo de nanomateriais que têm alta condutividade elétrica, grande área de superfície específica, alta razão de aspecto e notável estabilidade térmica [65]. Efeitos tóxicos de nanomateriais têm sido amplamente relatados em pepino, repolho, cenoura, cebola etc. [66, 67].

Evidência ampla mostrou que NO, atuando como molécula de sinalização, pode regular ampla gama de processos de plantas desde adaptação ambiental a desenvolvimento e este último inclui germinação de sementes e organogênese radicular [29, 68,69,70,71,72,73]. Nosso experimento subsequente revelou que NO pode estar envolvido em formação de RL induzida por MWCNTs. Embora vários métodos para imagear produção de NO em células de plantas tenham sido aplicados, desvantagens, incluindo falta de sensibilidade e interferência por moléculas independentes de NO, podem existir em cada método [74]. Assim, três métodos responsáveis por imageamento e determinação de NO, incluindo método do reagente de Griess, LSCM e EPR, junto com aplicação de cPTIO, sequestrador de NO, foram aplicados em nossas condições experimentais. Usando três métodos, observamos que produção endógena de NO aumentada induzida por MWCNTs em mudas de tomate foi abolida por cPTIO (Fig. 5), sequestrador de NO [30,31,32]. Importantemente, este processo foi correlacionado à resposta biológica de desenvolvimento de RL induzido por MWCNTs, que foi severamente bloqueado quando cPTIO foi aplicado simultaneamente (Fig. 4).

Further avaliação destas respostas e potenciais fonte(s) de NO induzidas por MWCNTs aplicados exogenamente revelaram que produção de NO e thereafter formação de RL poderiam ser atribuídas a atividade de NR. Em plantas, produção de NO principalmente gera de NR e proteína NOS tipo mamífera [28]. No entanto, gene NOS de planta ainda não é identificado [35, 75, 76], embora alguns experimentos usando inibidores da enzima NOS mamífera forneceram alguma evidência de via dependente de L-arginina em produção de NO [36, 76]. NR é confirmado como a fonte mais importante de NO em plantas [28]. Estudos prévios mostraram que produção de NO dependente de NR funciona como sinal relacionado a nitrato envolvido na regulação de arquitetura radicular [32, 33]. Além disso, produção de NO dependente de NR foi estreitamente associada com aclimatação a frio [38], tolerância a salinidade [50], e fechamento estomático induzido por ácido abscísico [77]. Nossos resultados further revelaram que tungstato (inibidor de NR) obviamente prejudicou formação de RL induzida por MWCNTs, especialmente em comprimento de RL (Fig. 6). Por outro lado, houve apenas diminuição leve em comprimento de RL, e nenhuma diferença significativa observada em número de RL quando l-NAME (inibidor de NOS mamífero) foi usado. Consistentemente, ensaio bioquímico mostrou que atividade de NR foi aumentada obviamente por MWCNTs (Fig. 7a), paralela às mudanças em produção de NO (Fig. 5a). Acima respostas poderiam ser totalmente bloqueadas por tungstato (Fig. 7a, Arquivo Adicional 1: Figura S1). Assim, deduzimos que produção endógena de NO aumentada induzida por MWCNTs foi principalmente atribuída à via de NR. Certamente, evidência genética further deve ser investigada.

Conclusão

Em resumo, fornecemos evidência para mostrar que produção de NO induzida por MWCNTs via NR pode ser necessária para formação de raiz lateral de tomate e isto foi resumido na Fig. 8. Importantemente, achados acima fornecem insights sobre mecanismo molecular intricado de funções de MWCNTs em plantas.

Representação esquemática da proposta formação de raiz lateral de tomate induzida por MWCNTs principalmente via produção de NO dependente de NR. Papel de enzima NOS tipo mamífera foi preliminarmente descartado

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

CO:

Monóxido de carbono

cPTIO:

2-(4-Carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido sal de potássio

DAF-FM DA:

4-Amino-5-metilamino-2′,7′-difluorofluoresceína diacetato

EPR:

Ressonância paramagnética eletrônica

GO:

Óxido de grafeno

H₂:

Gás hidrogênio

H₂O₂:

Peróxido de hidrogênio

l-NAME:

N^G-Nitro-L-arginina metil éster

RL:

Raiz lateral

LSCM:

Microscopia confocal a laser

MWCNTs:

Nanotubos de carbono de múltiplas paredes

NAA:

Ácido 1-naftilacético

NO:

Óxido nítrico

NOS:

Sintase de óxido nítrico

NR:

Redutase de nitrato

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

SIMR:

Resposta morfogênica induzida por estresse

SNP:

Nitroprussiato de sódio

SWCNTs:

Nanotubos de carbono de parede única

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão

Tg:

Tungstato