Nanopartículas de Óxido de Níquel Verde-Sintetizadas a partir de Gengibre e Alho Mostram Forte Desempenho Antibacteriano e Catalítico

Resumo

Nanopartículas (NPs) fito-sintetizadas com toxicidade química reduzida têm sido foco global e tornaram-se componente essencial da nanotecnologia recentemente. Preparamos NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente (gengibre e alho) para substituir agentes bactericidas e catalíticos sintéticos na indústria têxtil. NPs foram caracterizadas usando espectroscopia ultra-violeta visível (UV-Vis), difração de raios X (DRX), espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de raios X dispersiva em energia (EDS), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A síntese de NPs foi confirmada por DRX e UV-Vis com forte absorção a 350 nm com tamanho variando entre 16–52 nm para gengibre e 11–59 nm para alho. Microscopia eletrônica de varredura e transmissão confirmaram pleomorfismo com NPs de formato cúbico e mais esféricas. Além disso, quantidades exatas de extratos de alho e gengibre (1:3,6 ml) incorporadas para sintetizar NPs de NiO foram confirmadas com sucesso por FTIR. NPs reduzidas fitoquimicamente por alho apresentaram atividade bactericida aumentada contra Staphylococcus aureus multirresistente a drogas (MDR) em concentrações crescentes (0,5, 1,0 mg/50 μl) e também degradaram eficientemente corante azul de metileno (MB). Conclusivamente, NPs de NiO verde-sintetizadas são ativadores iminentes para resolver resistência a drogas bem como agente catalítico ambientalmente amigável que pode ser adotado em escala industrial.

Introdução

Nanotecnologia matéria influência com pelo menos uma dimensão de tamanho 1–100 nm que fornece capacidade de engenhar material controlando seu tamanho [17]. NPs devido às suas propriedades químicas, físicas e biológicas únicas em vários campos, incluindo medicina, atingiram grande atenção. Suas propriedades podem ser facilmente alteradas mudando tamanho em escala nanométrica [47].

Níquel (Ni) e nanopartículas de óxido de níquel (NiO) têm grande importância devido às suas propriedades magnéticas, catalíticas e eletrônicas particulares em tecnologia de energia, magnetismo, biomedicinas e eletrônica [9, 26, 35]. NiO com ampla lacuna de banda de 3,6 a 4,0 eV e estrutura de rede cúbica tem potencial devido a semicondutor tipo p. Estas NPs com alta estabilidade química, propriedades de supercapacitância, capacidade de transferência de elétrons e eletrocatálise estão sendo usadas em biomedicinas e atividades fotocatalíticas, anti-inflamatórias e antibacterianas [8, 10, 11, 45]. O surgimento de doenças infecciosas, especialmente resistentes a antibióticos (MDR), devastou a saúde pública mundial. Geralmente, cepas bacterianas patogênicas Gram-positivas (G +ve) e Gram-negativas (G −ve) estão entre as maiores ameaças à saúde pública.

Na indústria de laticínios, mastite bovina é uma doença problemática maior com grande impacto econômico caracterizada por mudanças químicas, microbiológicas e físicas no leite, enquanto mudanças patológicas em tecidos glandulares da úbere [6, 19]. Etiologia de mastite inclui agentes infecciosos, i.e., bactérias, vírus e fungos e mais importantes são bactérias, divididas em dois grupos: maiores (Streptococci, Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes e Coliform) e patógenos menores (Corynebacterium bovis e Staphylococci coagulase-negativos) [25]. O surgimento de cepas bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas multirresistentes a drogas representa ameaça significativa à saúde pública [23, 32].

Zingiber officinale (gengibre) é ingrediente importante em Ayurveda e Unani, e medicina herbal chinesa é tratada para várias doenças como anti-náusea, auxílio digestivo, reumatismo e distúrbios de sangramento devido à ampla diversidade de óleos voláteis como zingiberol, monoterpeno, sesquiterpeno e hidrocarbonetos sesquiterpênicos [12, 13, 43]. No entanto, Allium sativum (alho) contém componentes organossulfurados, i.e., grupos alil sulfeto, aliina, ajoene, cisteína alil e alicina, e outros como vitaminas, fosfolipídios, flavonoides, aminoácidos e ácidos graxos que orientam suas propriedades médicas [14, 24]. Visamos avaliar ação bactericida de NPs de óxido metálico de Ni reduzidas fitoquimicamente contra MDR (S. aureus), um isolado de mastite bovina, e este será o primeiro relatório do Paquistão na área de pesquisa veterinária sobre o agente acima mencionado.

Métodos

O estudo atual visou investigar a ação bactericida de NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente contra MDR (S. aureus), um isolado de mastite bovina.

Materiais

Nitrato de níquel [Ni(NO₃)₂], hidróxido de sódio (NaOH), azul de metileno (MB) e borohidreto de sódio (NaBH₄) de grau analítico foram adquiridos da Sigma-Aldrich®, e raízes frescas de gengibre e alho foram coletadas do mercado local. Raízes foram secas à sombra para atingir peso constante para processamento adicional. Discos de antibióticos foram adquiridos da Bioanalyse® (Turquia). Meios de crescimento bacteriano usados foram de grau analítico pela TM Media, (Titan Biotech Ltd, Índia).

Preparação de Extratos Aquosos

Raízes de gengibre e alho foram pulverizadas em pó fino usando moedor elétrico e preservadas em recipientes plásticos. Pó de raízes moídas foram misturados com quantidade controlada de água destilada-DIW (1:10) sob agitação vigorosa a 70 °C por 30 min. Extratos foram resfriados, filtrados por papel filtro Whatman No.1, e armazenados a 4 °C (Fig. 1) até uso posterior.

Esquema de síntese de extração de gengibre e alho e NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente

Síntese Verde de NPs de NiO

Extratos aquosos de gengibre e alho de várias razões (1,2, 1,8, 2,4, 3,0, 3,6 e 4,2 ml) foram adicionados a nitrato de níquel (0,1 M) sob agitação contínua. pH 12 da solução agitada foi mantido usando NaOH (2 M) a 90 °C por 2 h. Os precipitados formados foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 min, lavados com DIW, e secos durante a noite em estufa de ar quente a 90 °C ilustrado na Fig. 1.

Caracterização

Máximos de absorção (ƛ_max) de NPs sintetizadas foram escaneados por espectrofotômetro UV-Visível (Genesys 10 S) de 200–800 nm comprimentos de onda. Composição de fase e informação estrutural foram analisadas por difração de raios X (DRX) BUNKER D2 phaser com faixa 2θ de (10–80°) equipado com radiações Cu Kα1 de λ = 1,540 Å. Grupos funcionais de NPs de NiO verde-sintetizadas foram registrados usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR). Tamanho, forma e análise elementar de NPs foram analisados por microscópio eletrônico de emissão de campo (FESEM) e microscopia eletrônica de transmissão Hitachi H7100FA (MET). Composição da amostra com lacunas de banda correspondentes foram investigadas por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS).

Isolamento e Identificação de S. aureus MDR

Isolamento de S. aureus

Amostras de leite bovino clinicamente positivas coletadas de hospitais veterinários e fazendas do setor privado e público em Punjab, Paquistão, foram cultivadas em ágar sangue de ovelha 5% e incubadas a 37 °C por 24–48 h. Colônias características obtidas foram further estriadas em ágar sal de manitol (MSA) TM Media (Titan Biotech Ltd, Índia) em triplicata para isolar S. aureus purificado.

Identificação de S. aureus MDR

Identificação de colônias bacterianas foi feita através de características morfológicas, coloração de Gram e procedimentos bioquímicos (teste de coagulase e catalase) conforme descrição do manual de bacteriologia determinativa de Burgey.

Susceptibilidade a antibióticos de colônias características foi avaliada por teste de difusão de disco baseado em diretrizes do Comitê Nacional para Padrões de Laboratório Clínico (NCCLS) para isolamento de S. aureus MDR. Discos de antibióticos contendo oxitetraciclina (30 μg), tilosina (30 μg), gentamicina (10 μg), ciprofloxacina (5 μg) e trimetoprim + sulfametoxazol (1,25 μg + 23,75 μg) aplicados assepticamente em ágar Mueller-Hinton (MHA) TM Media (Titan Biotech Ltd, Índia) 1 × 10⁸ UFC/ml foram mantidos a 37 °C por 24 h [7]. Bactéria encontrada resistente a mínimo três antibióticos foi declarada MDR [28].

Atividade Antimicrobiana

Potencial de ação antimicrobiana in vitro de NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente foi avaliado por método de difusão em poço de ágar em dez isolados representativos de S. aureus MDR coletados de leite mastítico. Placas de Petri foram esfregadas com 1,5 × 10⁸ UFC/ml (padrão 0,5 McFarland) S. aureus MDR em MSA. Poços de 6 mm diâmetro foram formados usando perfurador de cortiça estéril. Várias concentrações de extratos aquosos individuais de gengibre, alho e NPs de NiO verde-sintetizadas (reduzidas fitoquimicamente) foram aplicadas. Extratos aquosos foram usados em concentrações de (10 mg/100 μl) e (50 mg/100 μl) e NiO (0,5 mg/50 μl) e (1,0 mg/50 μl). Ciprofloxacina (0,005 mg/50 μl) foi usada como controle positivo e DIW como controle negativo (50 μl).

Análise Estatística

A eficácia antimicrobiana foi calculada em termos de tamanho de zona de inibição (mm), e diâmetros de zonas de inibição foram analisados estatisticamente por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando SPSS 20.

Catálise

Para avaliação catalítica de NiO sintetizado por extrato, borohidreto de sódio aquoso recém-preparado (300 μl) foi misturado com 3 ml solução de azul de metileno (0.03 × 10⁻³ M). Subsequentemente, 300 μl amostra coloidal de concentração desejada foi adicionada às soluções. Cor azul claro de corante azul de metileno (MB) desapareceu representando degradação do corante a leucometileno azul como mostrado na Fig. 2. A absorção foi notada entre 200–800 nm usando espectrofotômetro UV-Vis.

Diagrama esquemático para redução catalítica de MB a LMB por NPs verde-sintetizadas

Resultados e Discussão

Propriedades ópticas de NiO reduzido fitoquimicamente por extratos aquosos de gengibre e alho entre 200–600 nm são apresentadas na Fig. 3a, b. A absorbância máxima (λ_max) em NPs de NiO foi observada em torno de 350 nm (1:3,6 ml) que aumentou com concentração de extratos acompanhada por desvio para azul. Picos de absorção de extratos de gengibre e alho apareceram em torno de 275 e 280 nm, respectivamente. Mudança de cor abrupta em misturas de reação foi vista de vinho tinto para verde claro após incorporação de extratos de raiz. Alargamento de pico indicou aglomeração de partículas e transição eletrônica de banda de valência para banda de condução com concentração de extrato em NiO como revelado por fortes bandas de absorção [20]. Portanto, na Fig. 3a, b resultados mostraram diminuição na absorção de NPs sintetizadas com aumento ou diminuição de volume de extrato além do valor otimizado (1:3,6 ml). A lacuna de banda foi calculada usando gráfico de Tauc (Eq. 1).

$$ \left(\alpha hv\right)=B{\left( hv-{E}_g\right)}^{\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$2$}\right.} $$ (1)

a–d Espectros de absorção de NPs de NiO verde-sintetizadas com gengibre (a) e extrato de alho (b). Lacuna de banda de NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre (c) e alho (d) respectivamente

Onde α é o coeficiente de absorção, h é a constante de Planck, B é uma constante, υ é conhecida como frequência de fóton, e E_g é a lacuna de banda de energia. A lacuna de banda estimada de NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre e alho de um gráfico de (αhʋ)^1/2 contra energia de fóton (hʋ). A interceptação de uma tangente ao eixo x foi registrada, que fornece energias de lacuna de banda das amostras como mostrado na Fig. 3c, d. As variações nas energias de lacuna de banda foram determinadas sobre dopagem de gengibre em NiO de 4,15 a 3,1 eV e com alho de 3,5 a 3,0 eV respectivamente (Fig. 3c, d).

Cristalinidade, tamanho e composição de fase de NPs de NiO foram confirmados por DRX como mostrado na Fig. 4 a, b. Os picos em valores 2θ 37,10°, 43,32°, 62,81° e 76,51° correspondem a (111), (200), (220) e (311) (cartão JCPDS no: 00-047-1049) (Fig. 4a, b) referenciados por [30]. Intensidade do pico indica NiO hexagonal e cúbico de face centrada (fcc) com tamanho médio 32,9 nm calculado por D = 0,9λ/βcosθ para gengibre e 29,92 nm para alho NiO-NPs reduzidos fitoquimicamente. Os picos alargados indicam presença de espaços de oxigênio e desordem de rede local na amostra [38]. Vários fitoquímicos de gengibre (flavonoides, alcaloides, taninos e saponinas) e extratos aquosos de alho (alicina, alil sulfeto, aliina, ácidos graxos, glicolipídios, fenólicos, aminoácidos e flavonoides) atuando como agentes de capping são responsáveis pelo tamanho médio de cristalito de NPs de óxido metálico [14, 46].

Padrão DRX de diferentes concentrações de NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre (a) e alho (b) e NiO padrão (c)

Os espectros FTIR registrados de NiO biossintetizado a partir de raízes de gengibre e alho são mostrados na Fig. 5 a, b. Absorção ampla elaborada a 3380 cm⁻¹ corresponde a OH e alargamento de pico indica grupo carbonila com frequência de alongamento de amina (N-H) [50]. Absorção aguda a 2313 cm⁻¹ indica vibrações de alongamento de CO₂ seja aéreo ou CO₂ dentro de grãos de NP. Absorção rápida de CO₂ atmosférico indica maior área de superfície do material [18]. Absorção ampla a 1629 cm⁻¹ corresponde a alongamento de anel aromático C=C e picos agudos a 1392 e 1064 cm⁻¹ correspondem a vibrações de alongamento de aminas alifáticas C–N [48]. Os picos intensos a 978 cm⁻¹ confirmaram frequência de alongamento metal-oxigênio de NiO [44].

Espectros FTIR com extrato de gengibre para NiO (a) e alho (b)

Os desvios de pico observados após bio-redução de NiO como 2535–2313, 1828–1629 e 1585–1392 cm⁻¹ indicam fitoquímicos, terpenoides, flavonoides, polióis e proteínas tendo grupos funcionais cetonas, álcoois, ácidos carboxílicos e aminas responsáveis por quelatação e capping em bio-redução [42].

Morfologia de superfície e tamanho de NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente foram determinados usando microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo e transmissão como apresentado na Fig. 6a–f. As NPs de NiO mostraram pleomorfismo com formato cúbico e mais esférico (< 50 nm) com leve aglomeração [40]. A aglomeração de NPs poderia ser evidente da adesão de polímero e interação magnética entre as partículas [49].

a–f Imagem de MEV de NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre (a) e alho (b). Imagem de MET de NiO reduzido fitoquimicamente com gengibre (c) e alho (d) e distribuição de tamanho de NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre (e) e alho (f)

Análise elementar e outras características de NPs de NiO sintetizadas foram descritas por espectroscopia de raios X dispersiva em energia (EDS) que confirmou fases puras de NiO como mostrado na Fig. 7a, b. Os espectros EDS confirmaram três picos diretamente relacionados à alta pureza de Ni presente nas amostras testadas entre 1 e 10 kV. As porcentagens de peso atômico observadas através dos espectros para Ni, O, C e Zn são 54,69, 27,81, 18,06 e −0,55, respectivamente.

a, b Espectro EDS de NPs de NiO verde-sintetizadas

XPS está mostrando espectros C1s, O1s e Ni2p de NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente na Fig. 8a–d que sugere natureza química e estados de ligação das amostras sintetizadas. Os picos mais intensos a 284,8 e 286,2 eV demonstram espectro C1s (Fig. 8b) correspondendo a C–C e C–OH/C–O–C [21]. O pico O1s a 530,8 eV (Fig. 8c) pode ser atribuído a grupos hidroxila de átomos de oxigênio, átomos de oxigênio adjacentes a vacâncias de níquel, ou átomos de carbono ligados a oxigênio C=O [1, 15, 37]. A contribuição localizada a 532,2 eV atribui-se a átomos de oxigênio em moléculas de água absorvidas (NiOH) [31, 41]. O espectro Ni2p contendo picos Ni2p3/2 e Ni2p1/2 pode ser separado usando função Gaussiana-Lorentziana em cinco componentes (Fig. 8d). Os picos mais intensos a 872,72 e 855,82 eV pertencem a Ni2p1/2 e Ni2p3/2 com picos satélites correspondentes 879,36 e 861,57 eV, respectivamente [16]. A separação spin-órbita entre Ni (2p1/2) e Ni (2p3/2) e nível de núcleo de NPs de NiO é 17,28 eV que corresponde bem com relatos anteriores [33, 34].

a–d Levantamento XPS de partículas reduzidas fitoquimicamente (a), orbitais C1s (b), espectros O1s de NiO (c), e Ni2p (d)

A ação antimicrobiana/bactericida de extratos de raiz de gengibre e alho e NPs de NiO verde/fitoquimicamente reduzidas foi avaliada usando ensaio de difusão em poço de ágar via medição de zona de inibição (mm) como mostrado na Fig. 9a–d e Tabela 1. Os resultados retrataram forte relação entre concentração de NP e zonas de inibição (mm). Zonas de inibição significativas (mm) (P < 0,05) foram registradas para amostra 1 (1,2 ml:1), 2 (1,8 ml:1), 3 (2,4 ml:1), 4 (3 ml:1), 5 (3,6 ml:1) e 6 (4,2 ml:1) variando (3–4,9 mm) e (3,05–5,2 mm) em baixas e altas concentrações NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente por gengibre (Fig. 9c, d), enquanto (3,15–5,3 mm) e (3,75–5,9 mm) NPs reduzidas fitoquimicamente com alho contra S. aureus MDR (Fig. 9e, f). Extrato aquoso de raiz de gengibre retratou eficácia zero (Fig. 9a), e raízes de alho mostraram zonas de inibição de 2,65 e 5 mm em baixas e altas concentrações, respectivamente (Fig. 9b). Todos os resultados foram comparados a controle negativo DIW (0 mm) e controle positivo ciprofloxacina (12,55 mm). No geral, NPs de NiO reduzidas fitoquimicamente com alho mostraram ação bactericida aumentada significativa (P < 0,05) contra S. aureus MDR.

a–f Atividade antimicrobiana in vitro de extrato aquoso de gengibre (a), alho (b), e NPs de NiO fitoquimicamente sintetizadas por extrato de gengibre em doses baixas e altas (c, d) e alho (e, f)

A diferença em tolerância a estresse oxidativo depende de vários fatores como área de superfície, morfologia e tamanho de partícula de nanomaterial sintetizado desempenhando papel inferencial no potencial de ação antibacteriana [29, 36]. Uma interação eletrostática entre cepas bacterianas e materiais nanoescalados resulta geração de espécies reativas de oxigênio encontradas responsáveis por morte de célula bacteriana [2,3,4,5, 22]. Duas reações encontradas possíveis para reação de nanomaterial com cepas bacterianas incluindo forte interação de cátions Ni²⁺ com partes carregadas negativamente de célula bacteriana resultando em colapso, enquanto segunda reação resulta em excitação eletrônica de banda de valência para banda de condução sob irradiação de superfície de NiO com luz. Reação eletrônica adicional com O₂ gera radicais O⁻₂ resultando em produção de H₂O₂. A produção de ·OH ocorreu sob reação de h⁺ com água. Assim, resultando espécies O⁻₂· e ·OH desempenharam papel significativo na quebra de moléculas de lipídio ou proteína presentes na superfície externa de célula bacteriana [39].

Atividade Catalítica

Figura 10 a–e demonstrando redução catalítica de MB na presença de extratos de raiz e NPs de NiO verde/fitoquimicamente reduzidas à temperatura ambiente. Figura 10 a mostra potencial catalítico de NPs de NiO sintetizadas por rota convencional enquanto (Fig. 10b, c) representa potencial catalítico de extratos aquosos de raiz de gengibre e alho. Capacidade catalítica de NPs reduzidas fitoquimicamente é representada na Fig. 10d, e. É óbvio que NiO e extratos de raiz de plantas não são nano-catalisadores eficientes pois consumiam 15, 21 e 38 min para redução de azul de metileno (Fig. 10a–c). NPs reduzidas fitoquimicamente com gengibre mostraram degradação rápida (λ_max = 8 min) com conversão eficiente de MB a leucometileno azul (Fig. 10d). NPs de NiO mediadas por alho mostraram padrão similar de 100% redução de corante em 5 min (Fig. 10e).

a–e Atividade catalítica de NiO (a), extrato de gengibre (b), extrato de alho (c), NiO reduzido fitoquimicamente por gengibre (d), e NPs reduzidas por alho (e)

NPs verde/fitoquimicamente reduzidas realizam degradação catalítica significativa de corante transferindo elétrons de espécies doadoras (BH₄) para aceitadoras (MB) e estabilizam sistema reduzindo energia de ativação [27]. Os dados revelaram NPs verdes como nano-catalisadores eficientes comparados a NPs convencionais e extrato individual.

Conclusão

NPs de NiO com extratos de raiz de gengibre e alho serviram como excelentes agentes bactericidas e catalíticos. Incorporação de extrato de raiz tendo grupos fitoquímicos resultou em síntese bem-sucedida de NPs de NiO revelada por FTIR. Os picos de DRX confirmaram rede hexagonal e cúbica de face centrada (fcc) de NiO e MEV confirmou pleomorfismo com morfologia cúbica e mais esférica de NPs com tamanho médio 16–52 (dopagem gengibre) e 11–59 nm (dopagem alho). No entanto, análise elementar revelou natureza química e estados de ligação analisados por EDS e XPS e apresentou porcentagem real de níquel e oxigênio, enquanto análise UV verificou picos de absorção diferença na faixa 350 nm e introduziu desvio para azul em maiores quantidades de dopantes. NiO reduzido fitoquimicamente por alho em alta concentração foi encontrado mais potente comparado a NPs reduzidas por gengibre contra S. aureus MDR bem como reduziu MB eficientemente. Assim, NiO verde/fitoquimicamente reduzido de extratos de raiz de alho pode ser adotado em medicina avançada como substituto de resistência a antibióticos e em indústrias têxteis como agente catalítico sem risco ambiental.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

EDS:

Espectroscopia de raios X dispersiva em energia

fcc:

Cúbico de face centrada

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

G +ve:

Gram positivo

G –ve:

Gram negativo

JCPDS:

Comitê conjunto sobre padrões de difração de pó

MB:

Azul de metileno

Ni:

Níquel

NiO:

Óxido de níquel

nm:

Nanômetro

NPs:

Nanopartículas

MEV:

Microscopia eletrônica de varredura

MET:

Microscopia eletrônica de transmissão

UV-Vis:

Espectroscopia ultra-violeta visível

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X

DRX:

Difração de raios X