Fe (II) e MOF revestido com ácido tânico como transportador de artemisinina para fornecimento de íons ferrosos para melhorar o tratamento do câncer de mama triplo-negativo

Resumo

A supressão do desenvolvimento do tumor por indução da ferroptose pode fornecer um remédio potencial para o câncer de mama triplo-negativo, que é sensível ao desequilíbrio oxidativo intracelular. Recentemente, a artemisinina (ART) e seus derivados foram investigados como potenciais agentes anticâncer para o tratamento de cânceres altamente agressivos por meio da indução de ferroptose por clivagem mediada por ferro da ponte de endoperóxido. Devido à sua pobre solubilidade em água e limitado conteúdo de ferro intracelular, é um desafio para futuras aplicações em terapia antitumoral. Aqui, desenvolvemos nanocarreador de fornecimento ferroso para ART com base em ácido tânico (TA) e íon ferroso (Fe (II)) revestido na estrutura de imidazolato zeolítico-8 (ZIF) com ART encapsulado (TA-Fe / ART @ ZIF ) por meio de automontagem orientada por coordenação. Experimentos de liberação de drogas mostraram que a ART não foi quase liberada em pH 7,4, enquanto 59% da ART foi liberada em pH 5,0 após 10 h, demonstrando a excelente liberação desencadeada por pH. Enquanto isso, um alto nível de ROS e MDA intracelular, acompanhado com diminuição de GSH e GPX4, exibiu um sistema de nano-fármaco recém-desenvolvido com ferroptose acentuadamente aumentada. Em comparação com a monoterapia, os experimentos de inibição de tumor in vitro e vivo demonstraram maior eficiência de supressão tumoral de TA-Fe / ART @ ZIF. Este trabalho fornece uma nova abordagem para aumentar a potência da nanomedicina ferroptótica e novas direções para a terapia TBNC.

Introdução

A ferroptose, um subtipo recém-descoberto de morte celular, pode resultar no acúmulo de hidroperóxidos lipídicos (LPO) dependentes de ferro, levando a danos na estrutura e integridade celular [1,2,3]. Evidências emergentes implicam que a ativação da ferroptose por várias moléculas pequenas é uma abordagem eficaz para a supressão do tumor em vários modelos experimentais de câncer e criou grandes expectativas para o potencial da ferroptose como uma nova terapia anticâncer [4,5,6]. O câncer de mama triplo-negativo (TNBC) é o subtipo mais agressivo de câncer de mama sem terapias direcionadas e frequentemente associado à recorrência do tumor, metástase à distância e resistência à terapia [7]. Estudos anteriores apontaram que o antiporter xCT cistina / glutamato é altamente expresso em numerosas células TNBC, desempenhando um papel importante na manutenção dos níveis de glutationa (GSH) e equilíbrio redox [8]. A redução do conteúdo intracelular de GSH pode tornar as células TNBC sensíveis à ferroptose, matando assim as células tumorais [8]. Notavelmente, a ferroptose também pode contornar a resistência do TNBC à apoptose programada de rotina [9]. Portanto, estratégias ou medicamentos baseados na indução de ferroptose podem ter potencial terapêutico para o tratamento clínico do TNBC refratário.

Artemisinina (ART), uma lactona sesquiterpênica que contém um grupo peróxido, foi isolada da planta tradicional chinesa Artemisia annua e demonstrou uma atividade antitumoral desejável em várias linhas de células cancerosas [10, 11]. Cada vez mais evidências mostram que as células cancerosas contêm significativamente mais ferro intracelular do que as células normais, enquanto a clivagem mediada pelo ferro da ponte de endoperóxido permite que a ART cause seletivamente a morte celular em várias linhas de células cancerosas [12, 13]. A atividade antitumoral dependente de íons de ferro tem atraído uma atenção crescente na ferroptose regulada por ART [13]. Mecanicamente, a ART pode induzir a degradação lisossomal da ferritina de maneira autofagia independente, aumentando os níveis celulares de íons ferrosos e sensibilizando as células para ferroptose [11].

No entanto, se a ART induz ferroptose no TNBC ainda não está claro. Além disso, uma série de fatores, como baixa solubilidade em água e disponibilidade insuficiente de íons ferrosos intracelulares, limitam a aplicação posterior da ART na terapia antitumoral [13]. Espera-se que os nano-complexos de ART sejam usados com sucesso como um sistema de entrega de nano-drogas prospectivo para drogas antitumorais baseadas em ART [14,15,16]. Nos últimos anos, estruturas metal-orgânicas (MOFs), uma classe de material polimérico poroso, está atraindo a atenção devido às demonstrações de seus grandes tamanhos de poros, altas áreas de superfície aparente e absorção seletiva de pequenas moléculas [17,18,19]. Como representante dos materiais do tipo MOF, a estrutura do imidazolato zeolítico (ZIF-8) é amplamente utilizada no desenvolvimento de nanofármacos com características de responsividade ao pH, alta carga de drogas e boa biocompatibilidade [20,21,22,23 ] Além disso, a capacidade de incorporar uma superfície ajustável no MOF permite o controle das propriedades da superfície e sua dotação de multifuncionalidades [24, 25]. A montagem supramolecular de um revestimento de coordenação metal-fenólico na superfície MOF recentemente atraiu interesse devido às propriedades desejáveis, como desmontagem responsiva a estímulos, estabilidade coloidal e biocompatibilidade [26, 27]. Os materiais de coordenação metal-fenólica no MOF podem ser um veículo ideal para fornecer a ART hidrofóbica.

Inspirados por isso, desenvolvemos o nanossistema ZIF-8 encapsulado por coordenação de íon ferroso-ácido tânico encapsulando ART (TA-Fe / ART @ ZIF) para regular a ferroptose em células TNBC, que é demonstrado na Fig. 1. ZIF-8 foi selecionado como um nano-portador para encapsular ART devido à sua boa biocompatibilidade e liberação responsiva ao pH. O revestimento de coordenação íon ferroso-TA foi imobilizado na superfície do ART @ ZIF com o objetivo de estabilidade de dispersão e fornecimento de íons ferrosos (Fe (II)). Após a internalização do nanossistema preparado nas células, a degradação ácida dos veículos facilitaria a liberação de ART e o acúmulo de Fe (II). A suprarregulação dos níveis de Fe (II) nas células iria decompor o ART em radicais por meio da clivagem da ponte endoperóxido mediada por ferro, intensificando marcadamente os efeitos da ferroptose. Conclusivamente, a descoberta da ferroptose mediada por TA-Fe / ART @ ZIF pode oferecer novas perspectivas para o desenvolvimento de novos tratamentos contra o TNBC.

Material e métodos

Reagentes

Artemisinina (99%), 2-metilimidazol (98%), nitrato de zinco (ZnNO ₃; 98%), Ta (98%), sulfato ferroso (FeSO ₄; 98%), e o metanol anidro foram fornecidos pela Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China).

Fabricação de nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF

Para a preparação de nanopartículas de ART @ ZIF, 200 mg de ART foram dissolvidos em 1 mL de metanol anidro e 2 g de 2-metilimidazol (o solvente era 8 mL de metanol absoluto) foram adicionados lentamente à solução de ART obtida. Sob agitação magnética, 0,2 g de nitrato de zinco (o solvente era 1 mL de metanol absoluto) foi adicionado lentamente. Finalmente, o volume da solução foi ajustado para 15 mL e agitado por 10 min para obter uma solução branca clara. Após centrifugação a 10.000 rpm, a amostra foi lavada três vezes com metanol. O sobrenadante era para medir o conteúdo de ART, enquanto o precipitante era liofilizado para obter o estado sólido para uso posterior.

Para a preparação de nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF, solução de TA (40 mg / mL em água desionizada, 2 mL) foi adicionada lentamente à solução de ART @ ZIF (10 mg / mL, 4 mL). Após agitação por 20 min, 5 mg / mL de FeSO ₄ foi adicionado lentamente à solução anterior. Após agitação repetida durante 30 min, foi obtida uma solução púrpura escura. Finalmente, o precipitado foi coletado por centrifugação a 10.000 rpm. O precipitado foi lavado três vezes com água desionizada e liofilizado para obter o TA-Fe / ART @ ZIF para uso posterior.

Caracterização

TEM (JEM-1230; JEOL, Tóquio, Japão) foi usado para determinar a composição morfológica e elementar de cada parte da nanopartícula. O espalhamento de luz dinâmico e o potencial zeta (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Malvern, UK) foram usados para avaliar o tamanho de partícula e a estabilidade elétrica das nanopartículas. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Alemanha) e análise termogravimétrica foram utilizadas para analisar a composição dos constituintes das nanopartículas. As medições espectroscópicas de fotoelétrons de raios X (XPS) foram feitas usando um PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). A composição elementar do material TA-Fe / ART @ ZIF foi realizada usando EDX (Carl Zeiss Model:Neon-40).

Medição de eficiência de encapsulamento e capacidade de carga

Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) foi usado para medir a quantidade de ART no sobrenadante. A carga de droga e as taxas de encapsulamento de ART podem ser calculadas da seguinte forma:
$$ {\ text {Drug}} \, {\ text {carregando}} \, (\%) =\ frac {{{\ text {Real}} \, {\ text {quantidade}} \, {\ text {of}} \, {\ text {drug}} \, {\ text {encapsulado}} \, {\ text {in}} \, {\ text {NPs}}}} {{{\ text {Quantidade} } \, {\ text {of}} \, {\ text {NPs}}}} \ times 100 \% $$$$ {\ text {Entrapment}} \, {\ text {eficiência}} \, \% =\ frac {{{\ text {Real}} \, {\ text {quantidade}} \, {\ text {of}} \, {\ text {drug}} \, {\ text {encapsulado}} \, {\ text {in}} \, {\ text {NPs}}}} {{{\ text {Inicial}} \, {\ text {of}} \, {\ text {quantidade}} \, {\ text {of}} \, {\ text {drug}} \, {\ text {used}}}} \ times 100 \% $$

Liberação in vitro e resposta ao pH de nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF

A membrana de diálise tratada envolvida com 2 mg de nanopartículas foi colocada em 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com pH de 7,4 e 5,0, respectivamente, e agitada continuamente a 37 ° C. A solução fora da membrana de diálise foi amostrada 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h e 10 h após o início do experimento. O conteúdo de ART na solução tampão foi medido usando HPLC.

Cultura de células

As linhas celulares MDA-MB-231 e L929 foram adquiridas da American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ umidade em meio RPMI-1640 (Solarbio, Pequim, China), que foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cyclone, Utah, EUA), 100 µg / mL de piruvato de sódio, penicilina e estreptomicina (Solarbio Pequim, China).

Teste de toxicidade celular in vitro

A viabilidade celular foi determinada usando ensaio de brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) de acordo com procedimentos da literatura [28, 29].

Células MDA-MB-231 e células L929 foram cultivadas em meio de células padrão em placas de 96 poços (5.000 células por poço) e incubadas em 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 h. O fluido no poço foi descartado e 100 μL por poço do meio sem soro com PBS e diferentes concentrações de ART, TA-Fe / ZIF, TA-Fe / ART @ ZIF, deferoxamina (DFO, MedChemExpress, Shanghai, China ), N-benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp (O-Me) fluorometil cetona (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China) e ferrostatina-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China) foram adicionados ao 96 -bem placas. Após 48 h, 10 μL de MTT (5 mg / mL) foram adicionados e incubados por mais 4 h. Finalmente, um marcador enzimático automático (BioTek Instruments Inc., EUA) foi usado para medir a absorbância em cada poço. Os resultados foram expressos como a porcentagem de viabilidade celular.

Ensaio de coloração com calceína-acetoximetil (Calceína-AM)

As células MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de 24 poços (2 × 10 ⁴ células por poço) e incubadas por 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com diferentes concentrações de nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF por 24 h. Após o descarte do meio, as células foram coradas com Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) no escuro a 4 ° C por 20 min e observadas em microscópio de fluorescência invertida (Olympus, Tóquio, Japão).

Citometria de fluxo para apoptose

As células MDA-MB-231 foram colocadas em uma placa de seis poços a uma densidade de 2,5 × 10 ⁵ células por poço nas mesmas condições. Após o tratamento com PBS, ART, TA-Fe / ZIF e TA-Fe / ART @ ZIF foram aplicados por 24 horas. Posteriormente, as células foram centrifugadas e coletadas da placa de seis poços. Após a coloração dupla com iodeto de propídio e anexina-V (kit Annexin V ‐ FITC; Beckman Coulter, Marseille, França), a citometria de fluxo foi usada para detectar.

Ensaio de determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) in vitro

O conteúdo de ROS nas células foi realizado usando uma sonda de fluorescência de ROS (diacetato de dicloro-di-hidro-fluoresceína (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). As células MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de seis poços (2,5 × 10 ⁵ células por poço) e incubadas em 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 h. O fluido dos poços foi descartado e as células foram tratadas da seguinte forma:grupo controle em branco (meio sem soro), grupo controle positivo e grupo experimental (diferentes concentrações de nanopartículas). Após incubação durante 8 h a 37 ° C, DCFH-DA a 0,1% foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas durante 30 min. As células que não respondem a DCFH-DA foram removidas com PBS e observadas sob um microscópio de fluorescência invertida (Olympus, Tóquio, Japão).

Determinação do conteúdo de Malondialdeído (MDA) e GSH

O kit de ensaio MDA (método TBA; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) e o kit de ensaio GSH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) foram usados para medir os níveis intracelulares de MDA e GSH. Após tratamento com PBS, ART, TA-Fe / ZIF e TA-Fe / ART @ ZIF, as células MDA-MB-231 foram coletadas e contadas. O conteúdo intracelular de MDA e GSH foi determinado de acordo com as instruções fornecidas nos kits.

Análise de Western Blot

As células MDA-MB-231, que foram tratadas com diferentes nanopartículas, foram lisadas com tampão de lise RIPA. Após a determinação da concentração de proteína, as proteínas de diferentes amostras foram separadas usando gel de SDS-PAGE 10% e transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose carregada com as proteínas da amostra foi bloqueada por solução de proteína BSA a 0,5% por 1 h, e a membrana de nitrocelulose e os anticorpos primários foram incubados por 24 h a 4 ° C. Lavamos os anticorpos primários da membrana de nitrocelulose com TBST e continuamos a colocá-los com os anticorpos secundários correspondentes em temperatura normal por 2 h. Após a lavagem dos anticorpos secundários na membrana de celulose, a membrana de nitrocelulose foi usada uma solução quimioluminescente e observada sob o sistema de imagem em gel.

Experimento anti-tumor in vivo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Weifang Medical University. Ratos nus fêmeas saudáveis (idade:4 semanas; peso:13-17 g; Vital River, Pequim, China) foram administrados com 5 × 10 ⁶ Células MDA-MB-231 em 150 µl de solução salina tamponada com fosfato. Quando o volume do tumor aumentou para 70-120 mm ³ , os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Cada grupo de camundongos foi tratado separadamente com PBS, ART (20 mg / kg), TA-Fe / ZIF (80 mg / kg) e TA-Fe / ART @ ZIF (100 mg / kg). Cada camundongo foi tratado por injeção intraperitoneal a cada três dias. Após 14 dias, todos os ratos foram mortos. Os tecidos tumorais e órgãos importantes foram coletados para coloração com hematoxilina e eosina.

Análise estatística

Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. Todos os dados foram analisados estatisticamente por meio do software SPSS versão 22.0 (IBM Corp., Armonk, EUA). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. P valores <0,05 denotam significância estatística.

Resultados e discussão

Caracterizações de nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF

Primeiro, as nanopartículas ART @ ZIF foram sintetizadas à temperatura ambiente a partir de metanol, acetato de zinco, 2-metilimidazol e ART de acordo com os procedimentos da literatura [30]. Filmes supramoleculares estáveis de metal-polifenol foram então rapidamente formados em torno dos modelos ART @ ZIF por vórtice TA e íons ferrosos. Em comparação com as nanopartículas magnéticas relatadas [31,32,33], o TA-Fe / ART @ ZIF foi preparado por meio do método de automontagem, formatando a membrana TA-Fe na superfície do MOF sem envolvimento de reação química ou hidrotérmica. Mais importante ainda, o nano-portador TA-Fe / ART @ ZIF pode ser desencadeado por baixo pH, para liberar ART e Fe (II), que é posteriormente catalisado pelo endoperóxido de ART para gerar radicais livres centrados em C, ferroptose marcadamente intensificada . A eficiência de encapsulação, medida por HPLC com o sobrenadante da primeira centrifugação, foi de 66,7%. O sobrenadante foi obtido pelas nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF, e a carga de fármaco calculada de ART foi de 11,4%. De acordo com a espectroscopia FTIR (Fig. 2a), picos de absorção característicos de ART, ou seja, a ligação carbonila a 1.738 cm ^-1 e a ponte peroxy em 724 cm ⁻¹ [34], foram observados em nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF, indicando que ART foi encapsulado com sucesso nas nanopartículas. Em seguida, os resultados da análise termogravimétrica revelaram que o ART foi completamente abolido quando a temperatura foi aumentada para aproximadamente 400 ° C (Fig. 2b). Em comparação com as nanopartículas de TA-Fe / ZIF, verificou-se que o ART é responsável por 7,1% do peso total das nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF, o que é basicamente consistente com os resultados da análise de HPLC.

Os resultados do TEM mostraram que ZIF-8 e ART @ ZIF exibiram uma configuração hexágono uniforme semelhante e a distribuição do tamanho de partícula foi determinada a aproximadamente 100 nm (Fig. 3a, b). As nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF exibiram uma configuração esférica e a distribuição de tamanho de partícula foi de 150 nm. Comparado com o ART @ ZIF completo, o TA-Fe / ART @ ZIF revestido com Fe (II) e TA demonstrou uma estrutura núcleo-concha convencional óbvia e o tamanho da membrana TA-Fe foi de aproximadamente 30 nm (Fig. 3a). Além disso, realizamos análise de mapeamento elementar de área das nanopartículas formadas. O mapeamento elementar de área confirmou que a periferia das nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF foi circundada pelo elemento Fe, indicando que Fe (II) e TA foram encobertos com sucesso (Fig. 3b). As medições XPS foram feitas para investigar a composição elementar da superfície e a interação no composto TA-Fe / ART @ ZIF. O amplo espectro de XPS de TA-Fe / ART @ ZIF é representado no arquivo adicional 1:Fig. 1s. Os principais picos que aparecem em torno de 285, 408, 531, 737 e 1036 eV foram relacionados a C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p e Zn 2p, respectivamente, demonstrando a formação do nanocompósito TA-Fe / ART @ ZIF . Além disso, as imagens de mapeamento EDS do TA-Fe / ART @ ZIF são mostradas no arquivo adicional 1:Fig. 2s. Verifica-se claramente que os picos correspondentes a elementos como carbono (C), nitrogênio (N), oxigênio (O), ferro (Fe) e zinco (Zn), estão em boa concordância com o espectro XPS. Ao aumentar a quantidade de Fe (II), descobrimos que o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF foi aumentado (Arquivo adicional 1:Fig. 3s). Para confirmar ainda mais o revestimento, medimos o potencial zeta de várias nanopartículas. A camada de formação TA-Fe (II) nas partículas ART @ ZIF deslocou a superfície zeta de potencial de + 21 mV para - 19,5 mV devido à natureza ácida do TA (arquivo adicional 1:Fig. 4s). Como a literatura anterior relatou [30], os grupos polifenóis abundantes na estrutura TA não apenas conferem a capacidade de revestimento do substrato, mas também são capazes de se coordenar com íons de metal de transição (Fe, Zn) para formar o complexo metal-fenólico. Quando Zn ²⁺ e Hmim são misturados para formar uma solução, uma massa de Zn ²⁺ os íons se coordenariam na superfície das partículas ART @ ZIF; assim, o potencial zeta de ART @ ZIF é + 21 mV. Os grupos fenólicos de TA (pKa 8,5) foram desprotonados negativamente e podem, portanto, interagir com o Zn carregado positivamente ²⁺ , promovendo o crescimento do filme TA – Fe na superfície ART @ ZIF. Como a liberação de medicamentos favorece os portadores, a estabilidade é um fator importante para sua aplicação medicamentosa. A estabilidade das nanopartículas foi demonstrada pela dispersão em PBS por uma semana. Conforme mostrado no Arquivo Adicional 1:Fig. 5s, o tamanho de partícula apresentou tamanho e estabilidade desejáveis ao longo do tempo de estudo.

Liberação e citotoxicidade de TA-Fe / ART @ ZIF In Vitro

Em seguida, a fim de estudar se TA-Fe / ART @ ZIF tinha comportamento de decomposição responsivo ao pH, examinamos a liberação de ART de nanopartículas em condições neutras e ácidas. Conforme mostrado na Fig. 4a, nas condições ácidas, as nanopartículas podem liberar rapidamente aproximadamente 58% da ART em 1 h. No entanto, em condições neutras, as nanopartículas podem liberar apenas lentamente uma pequena quantidade de ART. Além disso, durante o tratamento da solução externa da membrana de diálise com hidróxido de sódio, a solução do grupo pH =5,0 foi reagida com hidróxido de sódio para produzir um precipitado branco considerável. No entanto, esse fenômeno não foi observado no grupo pH =7,4.

De acordo com nossa hipótese, o precipitado branco é um precipitado de hidróxido de zinco formado pela dissociação de íons de zinco e álcalis das nanopartículas em condições ácidas. Coletivamente, essa evidência mostra com sucesso que nossas nanopartículas têm a capacidade de se dissociar em condições ácidas.

No projeto do nanossistema TA-Fe / ART @ ZIF, as estruturas TA-Fe (II) e ZIF são ablacionadas para liberar o ART e o Fe (II) encerrados sob as condições ácidas do microambiente tumoral. A suprarregulação dos níveis de Fe (II) nas células iria decompor o ART em radicais por meio da clivagem da ponte endoperóxido mediada por ferro, intensificando marcadamente os efeitos da ferroptose. Consequentemente, os ensaios de MTT foram conduzidos para estudar a citotoxicidade do nanossistema para células MDA-MB-231 e células L929. Em comparação com ART, as nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF mostraram maior citotoxicidade para células MDA-MB-231 (Fig. 4b) e baixa citotoxicidade para células normais (Fig. 4c). As nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF inibiram a atividade das células MDA-MB-231 em 53,9%, enquanto o ART na mesma concentração inibiu apenas 24,1% de todas as células. Os resultados experimentais da coloração com calceína-AM confirmaram que a quantidade de células MDA-MB-231 viáveis desceu gradualmente com o aumento da concentração de nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF (Fig. 4d).

TA-Fe / ART @ ZIF Enhanced ROS Generation in MDA-MB-231 Cells

A ART é conhecida por exercer sua atividade anticâncer por meio da geração de ROS produzidas pela clivagem mediada por ferro da ponte de endoperóxido [35, 36]. Portanto, examinamos a eficiência do TA-Fe / ART @ ZIF para induzir a geração de ROS pela sonda de diacetato de 2 ′, 7′-diclorodi-hidrofluoresceína (DCHF-DA) [37]. Como mostrado na Fig. 5, o sinal de fluorescência ligeiramente mais forte foi observado em células tratadas com ART e TA-Fe / ZIF em comparação com grupos não tratados, indicando que os íons ART e Fe (II) podem induzir a geração de ROS. Em contraste, a exposição de forte sinal de fluorescência ao nano-fármaco TA-Fe / ART @ ZIF é encontrada nas células como uma evidência do rendimento de ROS desejado, que é gerado pela clivagem do endoperóxido de ART mediado por Fe (II). O nanossistema preparado nas células seria degradado e faria acúmulo de Fe (II), geração de ROS notavelmente aprimorada. O efeito anticâncer da ART e seus derivados tem sido atribuído à sua capacidade de induzir apoptose por vários processos celulares, que vão desde a resposta a danos no DNA, macroautofagia do processo catabólico mediado por lisossoma e estresse oxidativo [13, 35, 38]. E também foi relatado que a clivagem mediada por ferro da ponte de endoperóxido na ART pode afetar o equilíbrio oxidativo intracelular para ferroptose em muitos tipos de células cancerosas [11]. Esta indução de ferroptose baseada no desequilíbrio oxidativo pode ser ainda mais amplificada com a adição de Fe (II). Enquanto o Fe (II) ativa a ART, ele também pode reagir com o peróxido de hidrogênio intracelular para gerar radicais livres hidroxila por meio da reação de Fenton, que aumenta o efeito indutor de apoptose da ART nas células tumorais.

TA-Fe / ART @ ZIF induziu apoptose e ferroptose em células MDA-MB-231

Enquanto isso, para investigar a morte celular e o papel do Fe (II), utilizamos o quelante de ferro deferoxamina, o inibidor da apoptose Z-VAD-FMK e o inibidor da ferroptose ferrostatina-1 para resgatar essas células. Como previsto, a deferoxamina, um eliminador de Fe (II), obviamente poderia bloquear a morte celular, sugerindo o importante papel do Fe (II). Além disso, a taxa de sobrevivência de células MDA-MB-231 foi significativamente melhorada por apoptose e inibidor de ferroptose de 31,4% para 56,3% e 76,0%, respectivamente (Fig. 6a), destacando a importância da apoptose e ferroptose em TA-Fe / ART Nanopartículas @ZIF mediaram a morte celular. Além disso, empregamos ensaio baseado em Anexina V-FITC por citometria de fluxo, para determinar quantitativamente o grau de apoptose. Os resultados afirmam que as nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF podem induzir apoptose em 21,8% das células MDA-MB-231 (Arquivo adicional 1:Fig. 6s). Esta percentagem foi superior à registada para ART, implicando que a apoptose está envolvida nas nanopartículas TA-Fe / ART @ ZIF mediadas, mas não é a causa principal.

Uma característica comum da ferroptose é a peroxidação lipídica endógena [39]. O MDA, um produto da peroxidação lipídica [40], foi investigado para avaliar o grau de ferroptose. Os resultados mostraram que as nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF tinham níveis de MDA aproximadamente 2,5 vezes maiores do que o grupo de controle (Fig. 6b). Isso foi presumido devido à presença de Fe (II) enriquecido com nanocarreador e a correspondente elevação dos níveis de radicais lipídicos. Como um dos principais componentes antioxidantes nas células, o GSH intracelular é reduzido acompanhado de ferroptose [41]. Considerando o papel importante do GSH na ferroptose, avaliamos o nível de GSH intracelular após o tratamento com nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF. GSH diminuiu significativamente em comparação com células tratadas com veículo (Fig. 6c). Isso forneceu fortes evidências para o esgotamento de GSH e desequilíbrio de oxidação, que foi centrado na ativação de ART mediada por Fe (II) por nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF. Em seguida, Western blotting foi realizado para entender o impacto das nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF na atividade do GPX4 [42]. Observamos que as nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF causaram uma inibição mais significativa da atividade de GPX4 do que a ART (Fig. 6d). Esses dados também concordam bem com a maior extensão de depleção de GSH.

Experimento anti-tumor in vivo

Avaliamos a eficácia antitumoral de nossas nanopartículas para células MDA-MB-231 in vivo pela inibição de tumores de xenoenxerto subcutâneo em camundongos nus portadores de tumor. Durante o tratamento de 14 dias, em relação a outros grupos, as nanopartículas de TA-Fe / ART @ ZIF podem inibir significativamente o crescimento de tumores de xenoenxerto MDA-MB-231 como resultado da geração abundante de ROS através da reação Fe (II) -ART (Fig. . 7a). Além disso, não houve diversidade significativa de peso corporal em todos os grupos experimentais (Fig. 7b), manifestando que o TA-Fe / ART @ ZIF teve efeitos colaterais desprezíveis. Para estudar ainda mais o efeito terapêutico, o tumor e outros tecidos normais foram examinados por coloração H&E após serem tratados por 14 dias. Como mostrado na Fig. 8, TA-Fe / ART @ ZIF causou a maior região de morte celular no tecido tumoral, enquanto não houve dano óbvio e apoptose nos tecidos normais. No geral, esses resultados demonstraram que a terapia mediada por TA-Fe / ART @ ZIF não só levou à eficácia anticâncer, mas também tem um baixo nível de toxicidade aguda sistemática na terapia mediada por SFT-MB.

Conclusão

Em resumo, a ferroptose oferece um remédio potencial para os tratamentos com TNBC, uma vez que tem vantagens exclusivas para superar as barreiras inevitáveis da terapia prevalente atualmente. Aqui, nós projetamos um nanocarreador de fornecimento ferroso para ART baseado em TA – Fe (II) revestido nas nanopartículas ZIF com ART encapsulado por meio de automontagem orientada por coordenação para ferroptose aprimorada. O nano-portador poderia ser dissolvido no microambiente ácido fraco para liberar ART e Fe (II), o que é ainda causado por um alto nível de ROS e MDA intracelulares, acompanhado com diminuição de GSH e GPX4, levando a potente inibição do crescimento tumoral e anticâncer eficácia in vitro e in vivo. Este trabalho fornece uma nova abordagem para aumentar a potência da nanomedicina ferroptótica e novas direções para a terapia TBNC. A biocompatibilidade e os mecanismos abrangentes de ferroptose induzida por TA-Fe / ART @ ZIF devem ser garantidos para investigação posterior.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

MOF:: Estruturas metal-orgânicas
TNBC:: Câncer de mama triplo-negativo
ART:: Artemisinina
TA:: Ácido tânico
ZIF:: Framework-8 de imidazolato zeolítico
TA-Fe / ART @ ZIF:: Ácido tânico e íon ferroso revestido na estrutura-8 de imidazolato zeolítico com artemisinina encapsulada
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
LPO:: Hidroperóxidos lipídicos
GSH:: Glutationa
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
FTIR:: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
HPLC:: Cromatografia líquida de alta performance
PBS:: Salina tamponada com fosfato
MTT:: Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio
DFO:: Deferoxamina
Fer-1:: Ferrostatina-1
Z-VAD-FMK:: N-Benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp (O-Me) fluorometil cetona
Calcein-AM:: Calceína-acetoximetil
DCFH-DA:: Diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína
MDA:: Malondialdeído
BSA:: Albumina sérica bovina
TBST:: Tween com solução salina tamponada com Tris
SDS-PAGE:: Eletroforese em gel de poliacrilamida
GPX4:: Glutationa peroxidase 4

Um fotodetector duplo de quatro quadrantes baseado em silício preto nanômetro aprimorado próximo ao infravermelho Síntese in situ de nanopartículas de prata em fibra de poliacrilonitrila enxertada amino e sua atividade antibacteriana

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