Nanopartículas de albumina carregadas de resveratrol com circulação sanguínea prolongada e biocompatibilidade aprimorada para terapia de tumor pancreático direcionada altamente eficaz

Resumo

A albumina sérica humana (HSA) é uma proteína intrínseca e um importante transportador que transporta substâncias endógenas e exógenas através das membranas celulares. Aqui, projetamos e preparamos nanopartículas de HSA carregadas com resveratrol (RV) conjugando RGD (arginina-glicina-aspartato) por meio de uma "ponte" de polietilenoglicol (PEG) (HRP-RGD NPs) para terapia de tumor pancreático direcionado altamente eficaz. Os NPs HRP-RGD possuem um tamanho médio de 120 ± 2,6 nm com uma distribuição estreita, uma forma esférica homodispersa, uma eficiência de encapsulamento de RV de 62,5 ± 4,21% e uma taxa de liberação máxima de RV de 58,4,2 ± 2,8% em pH 5,0 e 37 ° C. A biocompatibilidade in vitro de RV é melhorada após o revestimento com HSA e PEG. Imagens de fluorescência confocal mostram que HRP-RGD NPs têm a maior taxa de captação celular de 47,3 ± 4,6% em comparação com HRP NPs e HRP-RGD NPs com bloqueio de RGD livre, atribuindo a um efeito mediado por RGD. Um ensaio do kit-8 de contagem de células (CCK-8) indica que os NPs HRP-RGD sem RV (NPs HP-RGD) quase não têm citotoxicidade, mas os NPs HRP-RGD são significativamente mais citotóxicos para células PANC-1 em comparação com o RV livre e HRP NPs de maneira dependente da concentração, mostrando morfologia apoptótica. Além disso, com um revestimento formulado de PEG e HSA, os NPs HRP-RGD prolongam a circulação sanguínea de RV, aumentando aproximadamente 5,43 vezes (t _1/2 ) Após a injeção intravenosa em camundongos com tumor, o conteúdo de NPs HRP-RGD no tecido tumoral foi provado ser aproximadamente 3,01 e 8,1 vezes maior do que o de NPs HRP e RV livre, respectivamente. Com base nesses resultados, os NPs HRP-RGD foram usados ​​em um estudo anticâncer in vivo e demonstraram o melhor efeito de supressão do crescimento tumoral de todos os medicamentos testados, sem recidiva, alta biocompatibilidade in vivo e sem toxicidade sistêmica significativa ao longo de 35 dias de tratamento. Esses resultados demonstram que os NPs HRP – RGD com circulação sanguínea prolongada e biocompatibilidade melhorada têm altos efeitos anticâncer com aplicações futuras promissoras na terapia do câncer.

Histórico

O câncer de pâncreas representa uma doença devastadora com menos de 6 meses de sobrevida mediana e apenas 5 anos de sobrevida de 6% [1]. O tratamento clínico tradicional para o câncer de pâncreas é a excisão cirúrgica, radioterapia e quimioterapia [2, 3]. No entanto, esses métodos podem ser limitados por efeitos colaterais graves, como a disseminação de células cancerosas após excisão incompleta, toxicidade grave para células normais durante a radioterapia e baixas taxas de sobrevivência [4]. Embora baixos efeitos-alvo e altos efeitos colaterais também tenham limitado a utilidade de drogas anticâncer na quimioterapia, cada vez mais novos agentes quimioterápicos estão sendo desenvolvidos. Além das drogas sintéticas, muitos extratos de ervas chinesas são eficazes contra certos tipos de câncer. O resveratrol (RV), um extrativo natural de vegetação como a uva e a soja [5], tem atuado amplamente na agregação plaquetária e inibindo a vasodilatação, além de reduzir a viscosidade sanguínea [6, 7]. E nas últimas décadas, também foi descoberto que tem grandes efeitos anticâncer em alguns tipos de câncer, como fígado, mama e câncer de ovário [8, 9]. No entanto, a utilização de RV como uma droga anticâncer em potencial tem algumas desvantagens para outras aplicações clínicas, como baixa solubilidade, baixa circulação sanguínea e falta de seletividade [4, 10].

Sob a premissa de proteger a integridade estrutural da droga, a estratégia de encapsulamento atraiu o interesse de muitos pesquisadores, que se demonstrou ser eficaz na superação de algumas das desvantagens acima mencionadas em comparação com as drogas convencionais "gratuitas" [11]. Por exemplo, pode melhorar a baixa solubilidade e baixa biodisponibilidade, diminuir a depuração renal rápida, bem como aumentar a seletividade das células [12]. Atualmente, muitos métodos de encapsulação, como por lipossomas, nanopartículas de base polimérica, hidrogéis e albumina sérica são usados ​​[13,14,15,16]. Entre esses métodos, o uso de albumina sérica tornou-se um dos transportadores mais estimulantes para a distribuição de drogas anticâncer insolúveis. A albumina sérica humana (HSA), uma proteína endógena não tóxica, não apresenta imunogenicidade e possui grande biocompatibilidade [17]. Tem sido amplamente utilizado como um carreador de proteína macromolecular para entrega de drogas [18]. Assim, o HSA é capaz de melhorar a solubilidade de drogas lipofílicas. Além disso, a presença de grupos carboxílicos e amino funcionais na superfície facilita a funcionalização da superfície para nanopartículas de albumina [19, 20]. Por exemplo, via ligação covalente, a superfície das nanopartículas de albumina pode ser decorada com corantes de fluorescência, moléculas alvo e RNA funcional [21, 22]. Além disso, pode ser prontamente funcionalizado com polímeros hidrofílicos, como o PEG, para prolongar a circulação sanguínea [23].

Neste estudo, HSA é usado para encapsular RV lipofílico como um nanodármaco que é funcionalizado de superfície com uma molécula de alvejamento de tumor, arginina-glicina-aspartato (RGD) por meio de uma "ponte" de PEG (HRP-RGD NPs). Os NPs HRP – RGD preparados demonstram grande biocompatibilidade in vitro e in vivo e circulação sanguínea prolongada. A captação celular e a biodistribuição tumoral in vivo também foram avaliadas para validar seu potencial de direcionamento em células PANC-1. Além disso, a eficácia anticâncer direcionada dos NPs HRP-RGD foi investigada in vitro e in vivo. Esses resultados indicam que os NPs HRP-RGD podem ser uma nanoplataforma versátil para potenciais agentes terapêuticos de tumor para aplicação de quimioterapia direcionada.

Métodos

Materiais

Albumina sérica humana (HSA, pó liofilizado, ≥96%), resveratrol (RV, ≥99%), 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), Arg – Gly – Asp (RGD, ≥97%), ácido 3- (2-piridilditio) propiônico N éster -hidroxissuccinimida (SPDP), corante Hoechst 33258 e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foram obtidos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ –COOH foi comprado da Seebio Biotech Inc. (Xangai, China). N -Succinimidil S -acetiltioacetato (SATA) foi adquirido de Pierce Biotech Inc. (Rockford, IL, EUA). DMSO, solução de Tripsina-EDTA, tampão de fosfato (PBS), soro fetal bovino (FBS), solução de penicilina-estreptomicina e meio DMEM foram adquiridos da Sigma.

Síntese de Nanopartículas HSA – RV

Nanopartículas de HSA-RV foram sintetizadas por um método simples de dessolvatação [24]. Em detalhe, 6 mg de RV foi dissolvido em DMSO para ser 1 mg / mL e foi misturado com 10 mg de HSA em 1 mL de água sob agitação leve, formando coacervatos endurecidos após agitação por 6 h sob temperatura ambiente, e então foi processado por cruz -ligação com 0,5% de glutaraldeído (100 μL). Posteriormente, os solventes orgânicos foram removidos por diálise em água por 1 dia, resultando nas nanopartículas de HSA-RV. Nanopartículas de HSA em branco foram preparadas como mencionado acima, exceto que DMSO sem RV foi misturado com solução de HSA por 6 h.

Síntese e caracterização de NPs HRP – RGD

Nanopartículas de HSA – RV foram conjugadas com HS – PEG – RGD pelo reticulador tradicional SPDP, conforme descrito na literatura [25]. Em resumo, 20 mg de NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ –COOH foi tratado com 2 mg de SATA por 3 h e purificado por dessalinização. O SATA – PEG resultante foi adicionado a um peptídeo RGD de 10 mg e EDC de 8 mg por 3 h. O PEG-RGD protegido por SATA foi então reagido com 1 mL de hidroxilamina em fosfato de sódio por 3 h. Depois de purificado por dessalinização, foi dado o HS – PEG – RGD. Em seguida, o HS-PEG-RGD obtido foi conjugado com nanopartículas de HSA-RV por meio de ligações dissulfeto. Resumidamente, os grupos amino das nanopartículas de HSA – RV foram primeiramente ativados por SPDP e então foram ressuspensos em 10 mL de PBS e reagiram com excesso de HS – PEG – RGD ou HS – PEG por 24 h. A solução resultante foi repetida, lavada por PBS e filtrada através de um filtro Millipore (100 kDa) para remover qualquer PEG-RGD remanescente e outros solventes orgânicos, resultando em NPs HRP-RGD. A morfologia e o tamanho das nanopartículas foram detectados por microscopia eletrônica de varredura (SEM, Philips XL-30 FEG, Eindhoven, Holanda) e um sistema Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido), respectivamente. Os espectros de absorção foram adquiridos por um espectrofotômetro UV-Vis (UV1800, Shimadzu, Japão). Os espectros de fluorescência foram registrados por um espectrômetro de fluorescência (F-4500, Hitachi, Japão).

Carregamento e liberação de drogas

Seis miligramas de RV foram dissolvidos em DMSO para serem 1 mg / mL e foram misturados com 10 mg de HSA em 1 mL de água sob agitação leve, formando coacervatos endurecidos após agitação por 6 h sob temperatura ambiente e, em seguida, foi processado por reticulação com 0,5% de glutaraldeído (100 μL). Posteriormente, os solventes orgânicos e o RV livre foram removidos por meio de diálise em água por 1 dia. O dialisado foi usado para quantificar o RV livre por espectrômetro de UV-Vis a 306 nm de acordo com uma curva de calibração. A quantidade de medicamento em NPs HRP-RGD foi o RV total adicionado menos a quantidade de RV livre.

A liberação de RV dos NPs HRP-RGD foi detectada por meio de uma técnica de diálise dinâmica (bolsa de diálise com um corte Mw de 8–12 kDa) em pH 5,0, 7,4 e 9,0 PBS, respectivamente, a 37 ° C. A concentração da droga foi calculada usando uma curva de calibração padrão. A eficiência de encapsulamento = W ₁ / W ₂ × 100%, onde W ₁ representa o peso do RV em NPs HRP – RGD, e W ₂ é o peso do RV adicionado. Liberação cumulativa = W _a / W _b × 100%, onde W _a representa a quantidade de RV liberada, e W _b é o RV total presente em NPs HRP – RGD.

Ensaio de hemólise in vitro

O ensaio de hemólise in vitro foi conduzido conforme descrito em trabalho anterior [26]. Em detalhes, 0,2 mL de glóbulos vermelhos (RBCs, em PBS) foram misturados com 0,8 mL de HRP-RGD NPs (em PBS) em concentrações predeterminadas (10, 50, 100 e 200 μg / mL). RBCs incubados com água desionizada ou PBS foram definidos como controle positivo ou negativo, respectivamente. Depois de incubado a 37 ° C por 3 h, o conjunto de suspensões acima foi centrifugado a 10.000 rpm por 1 min e a absorbância dos sobrenadantes a 541 nm foi monitorada por um espectrômetro UV-Vis. Razão hemolítica =(OD _t - OD _nc ) / (OD _pc - OD _nc ) × 100%, onde OD _t , OD _pc e OD _nc são a absorbância do sobrenadante da amostra de teste, controles positivo e negativo, respectivamente.

Cultura de células

Células de tumor pancreático humano PANC-1 foram adquiridas no Cell Bank of Type Culture Collection da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora umidificada (5% CO ₂ ) a 37 ° C.

Captação celular

Para captação celular, FITC foi usado para marcar os NPs HRP-RGD. As células PANC-1 aderiram a lâminas de vidro em placas de 6 poços e foram incubadas com NPs HRP, NPs HRP-RGD + bloqueio de RGD livre e NPs HRP-RGD na mesma concentração de FITC marcado por 5 h, respectivamente. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas em 0,2 mL de glutaraldeído, seguido de coloração com DAPI por 10 min. As imagens de fluorescência das células foram capturadas pelo microscópio confocal de varredura a laser (Leica TCS SP8 CARS, Wetzlar, Germany).

Além disso, as taxas de captação de HRP NPs, HRP-RGD NPs + bloqueio de RGD livre e HRP-RGD NPs na mesma concentração de FITC marcado por células PNAC-1 foram analisadas usando citometria de fluxo (FCM, FACSCalibur, FACSCanto II) através da medição da fluorescência FITC. Dez mil células foram registradas para cada análise de FCM. A fluorescência FITC foi excitada usando um laser de 488 nm.

Citotoxicidade in vitro

A citotoxicidade de NPs HP – RGD, o portador de RV, foi conduzida usando um ensaio de kit-8 de contagem de células padrão (CCK-8) (Bestbio, China). Células PNAC-1 (1 × 10 ⁵ células / mL, 0,5 mL) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h. Depois de descartar o meio antigo, meio fresco contendo 10, 50, 100 e 200 μg / mL de NPs HRP-RGD foram incubados com células PNAC-1 por 24 h. PBS foi usado para lavar suavemente as células três vezes. Uma solução de trabalho CCK-8 de 100 μL (10% CCK-8 + 90% DMEM) foi então adicionada a cada poço, seguido por incubação a 37 ° C por 0,5 h. O valor de absorvância a 450 nm foi detectado usando um leitor de microplacas (Infinite 200 Pro, Tecan, Áustria). Além disso, a eficácia anticâncer in vitro do RV (dissolvido em DMSO), NPs HRP e NPs HRP-RGD com a mesma concentração de RV contra células PNAC-1 foi avaliada pelo ensaio CCK-8 mencionado acima. Todos os experimentos foram realizados em ocasiões quádruplas. Além disso, o exame morfológico para apoptose foi detectado pela coloração Hoechst 33258. A fluorescência de Hoechst 33258 em células foi observada e registrada por microscópio confocal de varredura a laser.

Modelo Animal

Camundongos nus Balb / c, 4-5 semanas, foram adquiridos do Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Taishan Medical University Administration Office of Laboratory Animal. Modelos de xenoenxerto de tumor subcutâneo foram estabelecidos na região traseira direita de camundongos pela injeção de 1 × 10 ⁶ Células PNAC-1 por camundongo, e quando os tumores exibiam um volume de cerca de 80 mm ³ , esses ratos foram divididos aleatoriamente em grupos diferentes ( n =5) para uso posterior.

Circulação de Sangue e Biodistribuição de Tumor

Os camundongos normais foram injetados por via intravenosa com RV, HRP NPs e HRP – RGD NPs. A seguir, amostras de sangue foram coletadas em diferentes momentos do plexo orbital. Cada amostra de sangue foi dissolvida em 900 μL de tampão de lise. A concentração de RV, HRP NPs e HRP – RGD NPs no sangue foi determinada por espectros de absorbância de RV de cada amostra de sangue solubilizada por um espectrômetro UV-Vis. As concentrações da amostra são definidas como a porcentagem da dose injetada por grama de tecido (ID% / g).

A biodistribuição no tumor foi realizada em camundongos com tumor. Os tecidos tumorais foram pesados ​​e digeridos por solução de água régia durante a noite, 24 horas após a injeção intravenosa de RV, NPs de HRP e NPs de HRP-RGD, respectivamente. A concentração de RV, HRP NPs e HRP – RGD NPs no tumor foi determinada por espectros de absorbância de RV de cada tecido tumoral solubilizado por um espectrômetro UV-Vis. As concentrações da amostra são definidas como a porcentagem da dose injetada por grama de tecido (ID% / g).

Eficácia anticâncer In Vivo

Os camundongos de diferentes grupos foram injetados por via intravenosa com solução salina, RV, NPs HRP e NPs HRP-RGD (a dose igual a RV, n =5, 10 mg / kg). Durante o tratamento, os tamanhos do tumor e os pesos corporais dos camundongos com tumor foram monitorados a cada 3 dias. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula: V =(Comprimento × largura ² ) / 2. Volume relativo do tumor = V / V ₀ , onde V ₀ era o volume do tumor antes do tratamento inicial.

Exame Histológico

Camundongos nus Balb / c saudáveis ​​de diferentes grupos foram injetados por via intravenosa com solução salina (controle), RV, NPs de HRP e NPs de HRP-RGD (a dose igual a RV, n =5, 5 mg / kg). Após 35 dias, os camundongos foram sacrificados e o coração, fígado, baço, pulmão e rim foram coletados. Os principais órgãos obtidos foram fixados com paraformaldeído a 4% durante a noite. Em seguida, esses órgãos foram desidratados em sacarose 25%, seccionados em fatias de 5 μm e corados com hematoxilina e eosina (H&E). As seções coradas foram fotografadas em um microscópio de contraste de fase invertida.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de NPs HRP – RGD

De acordo com um método de dessolvatação simples [24], RV foi encapsulado por HSA, resultando em nanopartículas de HSA-RV. Depois disso, a superfície das nanopartículas de HSA – RV foi covalentemente funcionalizada com HS – PEG – RGD pelo reticulador tradicional SPDP [25], formando NPs nanocompósitos HRP – RGD. Os NPs HRP e NPs HRP – RGD mostraram distribuição de tamanho de partícula estreita e unimodal (Fig. 1a, b). Após a conjugação de RGD na superfície de NPs de HRP, o tamanho médio das nanopartículas aumentou de 113 ± 3,1 nm para 120 ± 2,6 nm. Além disso, HRP NPs e HRP – RGD NPs exibiram uma morfologia de forma esférica homodispersa (Fig. 1c, d).

Distribuição de tamanho de partícula de NPs HRP ( a ) e NPs HRP – RGD ( b ) Imagens SEM de NPs HRP ( c ) e NPs HRP – RGD ( d )

Os espectros de UV-Vis e fluorescência foram obtidos para confirmar a presença de RV em NPs HRP-RGD. Conforme mostrado na Fig. 2a, HRP NPs e HRP – RGD NPs apresentaram picos de absorbância para RV em 304 nm, indicando a presença de RV em ambas as nanopartículas. Além disso, HRP NPs e HRP – RGD NPs mostraram sinais de fluorescência de RV em um comprimento de onda de excitação de 325 nm, que é consistente com o espectro de fluorescência de RV (Fig. 2b). Esses resultados demonstram que RV retém suas propriedades ópticas após a conjugação com NPs HRP e NPs HRP – RGD.

a Os espectros de absorbância de RV, HRP NPs e HRP – RGD NPs livres. b Os espectros de fluorescência de RV, HRP NPs e HRP – RGD NPs livres

Carregamento e liberação de RV

A Figura 3a mostra a curva de mudança de eficiência de encapsulamento de RV em NPs HRP-RGD ao aumentar a concentração de RV. O máximo RV EE dos NPs HRP-RGD obtidos foi de 62,5 ± 4,21%. Além disso, como visto na Fig. 3b, os NPs HRP-RGD exibiram a maior taxa de liberação de RV de 58,4,2 ± 2,8% após 60 h a 37 ° C e pH 5,0 em comparação com a taxa de liberação obtida em pH 6,5, pH 7,4, e pH 9,0 a 37 ° C. Foi relatado que o pH normal do sangue é 7,4, enquanto o tecido tumoral é ligeiramente ácido [27]. Isso prova ser uma característica benéfica do uso de NPs HRP-RGD na terapia de tumor.

a Eficiência de encapsulação de RV em função das concentrações adicionadas de RV. b Perfil de liberação in vitro de RV de NPs HRP-RGD em pH 5,0, 6,5, 7,4 e 9,0 a 37 ° C

Biocompatibilidade In Vitro

A Figura 4a, b mostra imagens de NPs de RV e HRP-RGD dissolvidos em DMSO em PBS a 4 ° C após 7 dias. O primeiro apresenta matéria sólida como cristal acicular, enquanto o último apresenta grande quantidade de partículas esféricas micro e homodispersas, indicando a melhora da estabilidade do RV após o encapsulamento por nanopartículas de HSA. Além disso, o tamanho médio dos NPs HRP-RGD em água, DMEM, PBS e FBS quase não apresentou variação ao longo de 4 semanas (Fig. 4c), demonstrando a alta estabilidade coloidal dos NPs HRP-RGD, provavelmente atribuídos ao PEG e Encapsulamento HSA.

A imagem microscópica de a RV livre (dissolvido em DMSO) em PBS e b NPs HRP – RGD em PBS após 7 dias. c Teste de estabilidade coloidal de NPs HRP – RGD em diferentes meios (água, DMEM, PBS e FBS). d A estabilidade de fluorescência de RV em NPs HRP-RGD após 4 semanas. e Taxa de hemólise de RBCs após 1 h de incubação com NPs HRP-RGD em diferentes concentrações. A inserção mostra a fotografia de RBCs expostos a água destilada, PBS e NPs HRP – RGD com diferentes concentrações seguidas por centrifugação

As Figuras 4d mostram a estabilidade fluorescente de NPs RV e HRP – RGD em solução aquosa a 4 ° C. Após 4 semanas de armazenamento, a intensidade de fluorescência RV dos NPs HRP-RGD permaneceu mais de 96,8% de suas intensidades iniciais; no entanto, a fluorescência do RV caiu rapidamente para 12,1% de sua intensidade inicial, provavelmente devido à precipitação do RV para fora da solução [10], indicando ainda mais a estabilidade dos NPs HRP-RGD em comparação com o RV livre. Além disso, como mostrado na Fig. 4e, nenhum fenômeno de hemólise significativo foi detectado para RBCs tratados com NPs HRP-RGD abaixo de 200 μg / mL, semelhante ao do grupo tratado com PBS de controle negativo, ilustrando a excelente hemocompatibilidade dos NPs HRP-RGD . Esses resultados sugerem que o encapsulamento de HSA melhorou a estabilidade e a biocompatibilidade in vitro do RV, o que é benéfico para aplicações biomédicas.

Captação celular

HRP NPs e HRP – RGD NPs foram rotulados por FITC. Conforme mostrado na Fig. 5a, os núcleos exibiram fluorescência azul, que foram corados por DAPI. Uma intensa fluorescência verde (sinal FITC) foi observada na região perinuclear de células PANC-1 tratadas com NPs HRP-RGD, mostrando que uma quantidade suficiente de NPs HRP-RGD entrou no citoplasma. Em contraste, muito pouca fluorescência verde foi mostrada em células PANC-1 tratadas com NPs de HRP. Além disso, as células PANC-1 pré-tratadas com RGD livre também exibiram fluorescência verde suave, provavelmente atribuída ao receptor RGD na superfície PANC-1 sendo bloqueado por RGD livre. A taxa de captação celular das nanopartículas foi detectada por FCM, que foi de 16,2 ± 4,9%, 7,1 ± 5,1% e 58,5 ± 3,5% para HRP NPs, HRP – RGD NPs com bloqueio de RGD e PANC- tratado com HRP – RGD NPs 1 células, respectivamente (Fig. 5b). Esses resultados demonstram que a molécula alvo RGD pode facilitar a captação de alta eficiência de NPs HRP-RGD por células PANC-1 [28, 29].

a Imagens de fluorescência confocal de células PANC-1 após incubação com NPs HRP, NPs HRP – RGD com bloqueio de RGD e NPs HRP – RGD marcados por FITC. Verde e cores azuis representam fluorescência FITC e núcleos de células coradas com DAPI, respectivamente. Barra de escala =20 μm. b A captação celular quantitativa de células PANC-1 para HRP NPs, HRP-RGD NPs com bloqueio RGD e HRP-RGD NPs por citometria de fluxo

Citotoxicidade in vitro

A Figura 6a mostra a citotoxicidade de HP – RGD NPs com uma faixa de concentração de 0–200 μg / mL pelo ensaio CCK-8, no qual a viabilidade das células PANC-1 foi mantida acima de 90%. Foi sugerido que os níveis de NPs HP-RGD portadores de RV abaixo de 200 μg / mL não apresentavam citotoxicidade significativa. Além disso, o efeito anticâncer dos NPs HRP – RGD in vitro também foi avaliado. A Figura 6b mostra que RV livre, NPs HRP e NPs HRP-RGD em concentrações de RV variando entre 0 e 50 μg / mL induziram uma diminuição na viabilidade celular por meio de uma maneira dependente da dose. Quando comparados aos NPs RV e HRP livres, os NPs HRP-RGD podem resultar em maior declínio na viabilidade celular em todas as concentrações de teste, provavelmente devido à estabilidade e efeitos de direcionamento RGD dos NPs HRP-RGD para células PANC-1 [30, 31] . Além disso, os núcleos das células PANC-1 tratadas por RV livre, NPs HRP e NPs HRP – RGD (todos a 30 μg / mL RV) foram corados por Hoechst 33258 e observados em microscópio de fluorescência confocal. As células tratadas com NPs HRP e NPs HRP-RGD mostraram a presença de núcleos picnóticos, consistentes com células tratadas com RV (Fig. 6c-f), indicando que o tipo de morte celular é mais provavelmente apoptose [32].

a Viabilidade celular de células PANC-1 após tratamento com HP – RGD NPs por 24 h. b Viabilidades celulares de células PANC-1 após incubação com diferentes concentrações de RV, NPs HRP e NPs HRP – RGD. O núcleo de células PANC-1 tratadas com PBS ( c ), RV ( d ), NPs HRP ( e ), NPs HRP – RGD ( f ) corado por Hoechst 33258 após o tratamento por 24 h. As imagens foram gravadas em câmera digital. Barra de escala =20 μm. Setas vermelhas representam os núcleos das células picnóticas

Circulação de Sangue e Biodistribuição de Tumor

A Figura 7a mostra o tempo de circulação sanguínea de RV livre, NPs HRP e NPs HRP – RGD após injeção intravenosa em camundongos. Pode-se ver que NPs HRP e NPs HRP – RGD têm quase o mesmo tempo de meia-vida ( t _1/2 ) de 7,5 ± 0,5 he t _1/2 =6,57 ± 0,9 h, respectivamente. Enquanto o RV livre foi rapidamente removido do sistema de circulação sanguínea e t _1/2 =1,21 ± 0,09 h. Os NPs HRP-RGD prolongaram o tempo de circulação sanguínea de RV, aumentando aproximadamente 5,43 vezes ( t _1/2 ) Além disso, 24 h após a injeção com as nanopartículas, o conteúdo de RV no tecido tumoral do grupo tratado com NPs HRP-RGD foi aproximadamente 3,01 e 8,1 vezes maior do que nos grupos tratados com NPs HRP e RV livre , respectivamente (Fig. 7b). Estes resultados indicam que o encapsulamento de HSA e PEG poderia prolongar o tempo de circulação para diminuir a eliminação de RV e mostrar um desempenho de acumulação seletiva significativa no tecido tumoral [33, 34], provavelmente devido à permeabilidade e retenção aumentadas (EPR) e ao direcionamento de RGD efeito [35].

a Curvas de circulação sanguínea de RV livre, NPs de HRP e NPs de HRP-RGD em camundongos após injeção intravenosa determinada pela absorbância de RV do lisado de tecido diluído. b Conteúdo de RV no tumor 24 horas após o tratamento com RV, NPs HRP e NPs HRP – RGD. c O volume relativo do tumor de camundongos com tumor após a injeção intravenosa de solução salina (controle), RV, HRP NPs e HRP-RGD NPs. d Peso corporal de camundongos com tumor após injeção intravenosa de solução salina (controle), RV, NPs de HRP e NPs de HRP-RGD

Eficácia anticâncer In Vivo

A Figura 7c mostra a eficiência anticâncer de RV livre, NPs HRP e NPs HRP – RGD na mesma concentração de RV após injeção intravenosa na cauda. Como controle, os camundongos foram tratados com solução salina. Os camundongos tratados com NPs HRP-RGD mostraram um crescimento tumoral significativamente suprimido e nenhuma recidiva após 35 dias de tratamento. Enquanto RV livre, os grupos tratados com NPs de HRP, semelhantes ao grupo de controle, mostraram um crescimento tumoral sempre crescente. Como esperado, o peso corporal dos camundongos em todos os grupos não diminuiu significativamente ao longo de 35 dias de tratamento (Fig. 7d). Além disso, a toxicidade sistêmica in vivo foi ainda avaliada por coloração H&E dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) após tratamentos de 35 dias (Fig. 8). Nenhuma toxicidade ou anormalidade do tecido perceptível foi encontrada nas imagens de coloração de tecido H&E correspondentes de todos os grupos testados, o que garantiu ainda mais a segurança in vivo dos NPs HRP-RGD para aplicações biomédicas.

As imagens de coloração HE representativas do coração, fígado, baço, rim e pulmão. Barra de escala =100 μm

Conclusões

Em resumo, ilustramos como os NPs HRP-RGD podem ser usados ​​como um agente terapêutico direcionado ao tumor pancreático altamente eficaz. Foi demonstrado que os NPs HRP-RGD exibiram estabilidade coloidal e biocompatibilidade melhoradas in vitro em comparação com RV livre. RGD como uma molécula alvo promoveu a captação celular altamente eficiente de NPs HRP-RGD. Com a presença de PEG e HSA, os NPs HRP – RGD mostraram um tempo de circulação significativamente prolongado que pode superar a curta circulação sanguínea do RV livre. Com base no direcionamento RGD, o conteúdo de NPs HRP-RGD no tecido tumoral foi mais do que o de NPs RV e HRP livres. Além disso, estudos in vitro e in vivo mostraram que, em comparação com NPs RV e HRP livres, os NPs HRP-RGD apresentam um excelente efeito anticâncer provavelmente induzido por apoptose. Por fim, os NPs HRP-RGD mostraram alta biocompatibilidade e nenhuma toxicidade sistêmica significativa in vivo ao longo de 35 dias de tratamento. Esses resultados demonstram que os NPs HRP-RGD podem ser um agente de quimioterapia tumoral promissor em futuras aplicações biomédicas.

Abreviações

CCK-8:

Kit de contagem de células-8

FBS:

Soro fetal bovino

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

HSA:

Albumina sérica humana

PBS:

Tampão Fosfato

PEG:

Polietileno glicol

RGD:

Arginina-glicina-aspartato

RV:

Resveratrol

Membranas compostas contendo nanopartículas de trocadores de íons inorgânicos para dessalinização eletrodialítica de glicerol Pontos quânticos de bismuto em poços quânticos de GaAsBi / AlAs recozidos