Nanopartículas de albumina conjugada com corante próximo ao infravermelho e carregadas com artesunato como agente fotoquimo teranóstico direcionado a tumor de alta eficiência

Resumo

Aqui, um agente teranóstico multifuncional direcionado ao tumor foi sintetizado usando um método fácil, combinando quatro materiais clinicamente aprovados:artesunato (Arte), albumina sérica humana (HSA), ácido fólico (FA) e indocianina verde (ICG). Os nanocompósitos obtidos (NPs FA-IHA) mostraram uma excelente estabilidade foto e fisiológica. O ICG no FA-IHA NPs foi usado não apenas para imagens de fluorescência no infravermelho próximo (NIR), mas também para terapia fototérmica e fotodinâmica (PTT-PDT) sob uma única irradiação NIR. Além disso, a irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) pode desencadear a liberação de Arte que mostrou efeito quimioterápico aprimorado. Por meio de imagens de fluorescência, a captação celular e o acúmulo de tumor de NPs de FA-IHA foram observados in vitro e in vivo, analisados por microscopia confocal e imagem de fluorescência NIR em camundongos com xenoenxerto de tumor. Com base nos resultados do diagnóstico, FA-IHA NPs 24 horas após a injeção e combinados com irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) poderia suprimir com eficiência o crescimento do tumor por meio de uma terapia de combinação de fotoquimio, sem recorrência do tumor in vitro e in vivo. Os resultados obtidos sugeriram que os NPs de FA-IHA são agentes fotoquimio teranósticos promissores para tradução clínica futura.

Histórico

Nessas últimas décadas, a fotoquimioterapia guiada por imagem (IGPC) despertou grande interesse de muitos pesquisadores, visto que é uma estratégia promissora para realizar uma terapia tumoral personalizada [1, 2]. O IGPC permite a localização exata do tumor e traça o fármaco in vivo, garantindo uma terapia eficaz e reduzindo os efeitos colaterais [3, 4]. Para ser eficaz, o IGPC deve ter as seguintes características:(i) um agente teranóstico multifuncional com funções de imagem e terapêuticas é necessário; (ii) o agente teranóstico deve ser biocompatível, estável e específico contra o tumor [5,6,7,8]. A modalidade de diagnóstico por imagem no IGPC geralmente inclui imagens de ressonância magnética, imagens fotoacústicas e imagens de fluorescência [9,10,11,12,13,14]. Devido à alta sensibilidade, resolução temporal favorável e alta relação sinal / fundo, a imagem por fluorescência foi geralmente aplicada para pesquisa básica e na prática clínica [15, 16].

Os métodos de fotoquimioterapia incluem principalmente terapia fototérmica (PTT), terapia fotodinâmica (PDT) e quimioterapia. Como a irradiação no infravermelho próximo (NIR) é a mesma, a função PTT e PDT podem ser integradas em uma só, possibilitando a destruição seletiva e eficiente do tumor por meio de um feixe de laser. No entanto, foi relatado que a terapia fototérmica e fotodinâmica (PTT-PDT) tem frequentemente a limitação de uma supressão tumoral incompleta, que pode gerar potencialmente uma recidiva do tumor [17,18,19]. A quimioterapia, um método de tratamento amplamente utilizado contra o câncer, pode matar efetivamente as células tumorais através da administração sistêmica, embora a toxicidade para as células normais próximas devido à sua não especificidade limite sua aplicação [20,21,22]. Portanto, a combinação IGPC pode ser uma ótima estratégia para superar as limitações acima.

Com o desenvolvimento da nanomedicina, agentes teranósticos IGPC foram desenvolvidos, incluindo indocianina verde (ICG), nanopartículas à base de metal, nanomateriais de carbono e nanomateriais de polímero [23,24,25,26,27]. Entre eles, o ICG foi aprovado pelo FDA, e seu uso na prática clínica é relatado para detectar débito cardíaco, função hepática, fluxo sanguíneo e angiografia oftálmica [28, 29]. Além disso, o ICG tem alta eficiência de absorção na região NIR, induzindo assim um alto efeito PTT-PDT sob uma única irradiação NIR [30]. No entanto, as seguintes desvantagens, como instabilidade em solução aquosa, depuração rápida no corpo, tendência ao autobranqueamento e falta de direcionamento, dificultam seriamente sua aplicação extensiva [31, 32]. Para superar essas limitações, as moléculas de ICG livres são geralmente transportadas por veículos, incluindo micelas, nanopartículas de polímero e nanoestruturas de proteínas automontadas, para formar nanocompósitos [33, 34]. Embora trabalhos relacionados estejam disponíveis, nanocompósitos baseados em ICG mais biocompatíveis e novos ainda são necessários para imagens e fototerapia in vivo.

Neste trabalho, relatamos um agente IGPC direcionado que covalentemente conjugou ácido fólico (FA) e ICG com nanopartículas de albumina de soro humano (HSA) que também encapsulou o fármaco artesunato anticâncer (Arte) (NPs FA-IHA). Foi relatado que o AF liga nanopartículas para aumentar sua eficiência de captação celular por meio de endocitose mediada por receptor [17]. HSA é uma proteína endógena. Por causa de sua boa biocompatibilidade, não tóxico e não imunogenicidade, HSA se tornou um dos transportadores mais interessantes para entregar drogas anticâncer insolúveis [12, 17, 31]. Arte, uma droga natural extraída da Artemisia annua , provou ser uma eficácia significativa no tratamento de vários tipos de câncer, como câncer de fígado, câncer de pulmão e câncer de mama [35]. Os NPs de FA-IHA preparados consistiam nesses quatro materiais clínicos aprovados e mostraram grande biocompatibilidade e estabilidade. Como um nanocompósito teranóstico multifuncional, o ICG foi aplicado como um agente de imagem de fluorescência NIR e agente de fototerapia devido às suas propriedades PTT-PDT. Arte foi altamente carregado nos NPs e liberado pela irradiação NIR para quimioterapia. Guiado pelos resultados de imagem NIR, o alto efeito da combinação alvo IGPC foi demonstrado tanto in vitro quanto in vivo. De acordo com nossos resultados, acreditamos que os NPs de FA-IHA podem ser um potencial agente teranóstico versátil na entrega controlada de drogas e fototerapia combinacional dirigida por imagem orientada a tumor.

Métodos

Materiais

Hidrocloreto de N- (3-dimetilaminopropil) -N '-etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida (NHS) e artesunato (Arte, ≥ 99%) foram obtidos de Sigma-Aldrich (EUA). 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e o Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foram adquiridos de Aladdin (Shanghai, China). NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ –COOH e NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ -FA foram comprados da Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi’an, China). Meio DMEM e solução salina tampão de fosfato (PBS) foram fornecidos pela Gibco BRL (NY, EUA). O derivado Sulfo-NHS de ICG (ICG-NHS) foi comprado de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japão).

Síntese e caracterização de NPs FA-IHA

O artesunato foi dissolvido em DMSO e depois adicionado a 15 mL de água. Adicionou-se 10 mg de pó de HSA à solução anterior e agitou-se ligeiramente durante 3 h à temperatura ambiente. Após agitação, a mistura foi processada por reticulação com 150 μL de glutaraldeído a 0,5%. A fim de remover os reagentes químicos redundantes, a mistura foi dialisada contra água destilada (MW cut off =8.000-12.000 Da) por 1 dia, resultando em nanocompósitos de HSA carregados com Arte (Arte-HSA).

Para ativar os grupos carboxílicos de HSA, os reagentes químicos EDC e NHS foram adicionados à solução Arte-HSA. Depois disso, a mistura foi reagida com NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ -FA por 3 h a 4 ° С. A seguir, o ICG-NHS foi adicionado à mistura sob leve agitação durante 30 min à temperatura ambiente. As nanopartículas de HSA conjugadas com FA e ICG purificadas (FA-ICG-HSA @ Arte, FA-IHA NPs) foram obtidas por diálise em água desionizada durante 24 h. A quantidade de Arte e ICG carregados foi detectada por um espectrofotômetro UV-vis. A eficiência de carregamento =W1 / W2 × 100%, em que W1 representa o peso de Arte ou ICG em NPs FA-IHA e W2 é o peso de Arte ou ICG adicionado.

A microscopia eletrônica de transmissão (Hitachi, Tóquio, Japão) foi usada para detectar a morfologia das amostras. Um Zetasizer (Zetasizer 3000; Malvern Instruments, Worcestershire, UK) foi usado para medir o tamanho e o potencial zeta das amostras. Um espectrofotômetro UV-vis (UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japão) foi aplicado para medir os espectros de absorbância. O laser de onda contínua de comprimento de onda único de 808 nm (Beijing Laserwave Optoelectronics Technology Co. Ltd) foi aplicado para conduzir experimentos fototérmicos, e a temperatura foi detectada por um termômetro termopar (Fluke, EUA).

Liberação Arte Térmica e Acionada por pH

Para determinar a liberação de Arte térmica e disparada por pH, FA-IHA NPs (50 μg / mL) foi dividido em três grupos:(a) pH 6,5, (b) pH 7,4 e (c) pH 6,5 com irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² , Pulso de 1 min) em pontos de tempo selecionados durante 36 h. A quantidade liberada de Arte foi determinada de acordo com a absorção de UV-vis de Arte a 287 nm no sobrenadante.

Detecção de produção de oxigênio singlete

1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) foi usado para detectar o oxigênio singlete. 15 μL de solução de acetonitrila DPBF foram adicionados em solução de ICG ou FA-IHA NPs (1,0 mL, 10 μg / mL) e bem misturados, seguido por 5 min de irradiação (808 nm, 1,0 W / cm ² ) Os espectros de absorção de UV-vis foram registrados em diferentes pontos de tempo, e a diminuição da taxa de absorção em 410 nm é proporcional à produção de oxigênio singlete.

Cultura celular e captação celular

As células HepG2 foram adquiridas da American Type Culture Collection e em 25 cm ² frasco de cultura de células, respectivamente, com meio de cultura DMEM pela adição de 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (FBS). As células HepG2 foram mantidas a 37 ° C em 5% CO ₂ atmosfera.

Para observar a captação celular, as células HepG2 foram cultivadas com ICG livre, NPs de IHA e NPs de FA-IHA (com 0,05 mg / mL de ICG) por 6 h. Depois disso, o PBS foi usado para lavar as células tratadas por três vezes. As células foram então fixadas com 200 μL de glutaraldeído e coradas com DAPI por 10 min. Os sinais de fluorescência das nanopartículas nas células foram detectados usando um microscópio confocal de varredura a laser (FV300, Olympus, Japão).

Para avaliar ainda mais a captação celular, foi aplicado um citômetro de fluxo (FCM, BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). Conforme descrito acima, as células tratadas com ICG-, IHA NPs- e FA-IHA NPs livres foram lavadas três vezes com PBS e digeridas por tripsina-EDTA. As células suspensas foram introduzidas diretamente no FCM para analisar a taxa de captação celular.

Geração de ROS intracelular

As células HepG2 foram cultivadas em placas de 12 poços com uma densidade de 2 × 10 ⁵ células por mililitro e incubadas por 24 h, seguido pela adição de 1 mL de várias amostras, incluindo (1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA-NPs, (4) ICG livre, (5) IHA- NPs e (6) solução de NPs FA-IHA. Após mais uma incubação por 12 h, as células foram irradiadas por 5 min (808 nm, 1,0 W / cm ² ), seguido por um tratamento com DCFH-DA (5 μg / mL) por mais 30 min. Finalmente, as células foram lavadas minuciosamente com PBS, e a produção de ROS intracelular foi detectada quantitativamente usando um citômetro e qualitativamente com uma microscopia de fluorescência inversa Leica.

Foto-quimioterapia de tumor in vitro

As células HepG2 foram semeadas em placas de 96 poços (2 × 10 ⁴ células por poço) para incubação de 24 h. ICG, Arte, IHA NPs e NPs FA-IHA livres (com 0, 5, 10, 20 e 30 μg / mL de Arte) foram adicionados às células. Após uma incubação de 6 horas, os meios antigos foram descartados. As células tratadas foram irradiadas com ou sem um laser de 808 nm (1,0 W / cm ² , 5 min) e cultivadas nas próximas 24 h. A viabilidade celular foi medida por um ensaio CCK-8 clássico de acordo com o protocolo.

A fim de confirmar ainda mais as células vivas e mortas após o tratamento NIR, as células tratadas foram co-coradas por calceína-AM / PI. As células HepG2 foram pré-semeadas em placas de 35 mm a uma densidade de 1 × 10 ⁶ células por placa e foram tratadas com PBS, PBS + NIR, FA-IHA NPs ou FA-IHA NPs + NIR. Após 6 h de incubação, as células foram irradiadas por 5 min por laser de 808 nm (1 W / cm ² ) e cultivadas nas próximas 24 horas. As células foram coradas com calceína-AM / PI por 30 min, lavadas com PBS para remover o excesso de solução de corante e, em seguida, fotografadas usando um microscópio confocal de varredura a laser (calceína-AM lex =488 nm, lem =515 nm; PI lex =535 nm , lem =617 nm).

Modelo animal e imagens de fluorescência in vivo

Ratinhos nus Balb / c foram obtidos do Centro de Ciência Animal de Laboratório da Província de Guangdong e usados sob protocolos aprovados pela Guangzhou Medical University. A fim de estabelecer tumores subcutâneos HepG2, 1 × 10 ⁶ As células HepG2 (em 100 μL de PBS) foram injetadas na parte de trás do camundongo nu Balb / c.

Camundongos portadores de tumor ( n =5) foram fotografadas por um sistema IVIS Spectrum disponível comercialmente (Caliper LifeSciences, EUA) antes e em 10 min, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h após a injeção intravenosa de ICG livre, IHA NPs e FA- NPs IHA.

Terapia combinatória de fotoquimio para tumor in vivo

Camundongos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em grupos diferentes ( n =5) e foram tratados por PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA NPs + NIR e FA-IHA NPs + NIR (com igual dose de Arte livre), respectivamente. Laser NIR de cinco minutos (808 nm, 1 W / cm ² ) foi usado para irradiar a região do tumor 24 h (dia 0) e 48 h (dia 1) após a injeção intravenosa dessas amostras. As imagens térmicas e a temperatura dos camundongos irradiados foram registradas. Durante o tratamento, o tamanho do tumor foi registrado a cada 4 dias e calculado de acordo com a equação:volume =(comprimento do tumor) × (largura do tumor) ² / 2. Os resultados foram apresentados pelo volume relativo do tumor, que era o volume do tumor dividido pelo volume inicial do tumor. Após o tratamento, os principais órgãos, incluindo coração, fígado, baço, pulmões e rins daqueles camundongos em grupos PBS e FA-IHA NPs + NIR foram colhidos, fixados em formalina a 4%, incluídos em parafina, corados com H&E e registrados por um microscópio digital.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização de NPs FA-IHA

A Figura 1 ilustra o uso esquemático de NPs FA-IHA e sua aplicação para fototerapia combinacional direcionada a tumor guiada por imagem. Os agentes teranósticos multifuncionais FA-IHA NPs foram preparados por meio de um método de automontagem simples e biocompatível. O ICG conjugado foi empregado como um agente de imagem de fluorescência NIR e agente de fototerapia por suas propriedades PTT-PDT. Além disso, a Arte carregada exerceu o efeito quimioterápico.

A imagem TEM de NPs FA-IHA mostra uma estrutura esférica monodispersa com um diâmetro de aproximadamente 131,2 nm (Fig. 2a). Este diâmetro hidrodinâmico foi confirmado como 131 ± 2,3 nm de comprimento em água, solução salina tampão de fosfato (PBS) e meio celular (Fig. 2b), de acordo com a análise DLS. O potencial zeta de 131,2 ± 2,12 também foi detectado como - 29,2 ± 1,13 mV nesses três meios (Fig. 2c). Além disso, o diâmetro de NPs de FA-IHA não teve alteração significativa ao longo de 7 dias nestes três meios (Fig. 2d). Estes resultados indicaram que os NPs de FA-IHA preparados tinham uma boa estabilidade, provavelmente devido ao revestimento de PEG e HSA. O espectro de UV-vis-NIR de FA-IHA NPs exibiu o pico de absorção de Arte e ICG (Fig. 2e), demonstrando a existência de Arte e ICG em FA-IHA NPs. A taxa de carregamento de Arte foi de 98,6 ± 3,1% e a taxa de carregamento de ICG foi de 56,9 ± 2,4%. A Figura 2f mostra que os NPs de FA-IHA tinham uma propriedade de fluorescência semelhante em comparação com ICG livre.

Incentivado pela forte absorção óptica de NIR de NPs de FA-IHA, a propriedade fototérmica de NPs de FA-IHA foi avaliada. Água, ICG livre e NPs FA-IHA (com concentração de ICG igual) foram irradiados com um laser de 808 nm (1 W / cm ² ) A temperatura dos NPs FA-IHA e ICG livre aumentou aproximadamente 36 ° C dentro de 5 min de irradiação (Fig. 3a), enquanto a água deu um incremento de temperatura inferior a 4 ° C, demonstrando que as nanopartículas contidas em ICG têm fototérmica significativa efeito e têm potencial para a terapia do câncer. Além disso, Arquivo adicional 1:A Figura S1 mostra as curvas de aquecimento fototérmico de NPs FA-IHA sob 5 min de irradiação a laser de 808 nm com 0,5, 1 e 1,5 W / cm ² , indicando que a intensidade ideal do laser é 1 W / cm ² . Os testes de fotoestabilidade em NPs FA-IHA e ICG livre foram realizados. O ICG livre mostrou uma diminuição significativa da temperatura após cinco ciclos em comparação com os NPs de FA-IHA (Fig. 3b). A Figura 3c mostra a alteração da intensidade de absorção de NPs de ICG e FA-IHA livres antes e depois de cinco ciclos de irradiação NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) Os resultados sugeriram que a intensidade de absorbância em 808 nm de ICG livre diminuiu após cinco ciclos de irradiação NIR, enquanto os NPs de FA-IHA mantiveram a intensidade de absorbância original. Além disso, comparamos a estabilidade de fluorescência de NPs de ICG e FA-IHA livres (Fig. 3d). Após 30 dias de armazenamento a 4 ° C, a intensidade de fluorescência dos NPs FA-IHA em 800 nm foi de 0,72 em comparação com sua intensidade inicial de 1, enquanto a fluorescência de ICG livre caiu para 0,12 em comparação com sua intensidade inicial, devido à agregação induzida -fotobranqueamento [36]. Estes resultados indicaram que o ICG covalentemente conjugado era mais estável do que o ICG livre, provavelmente devido à auto-montagem de HSA e PEG protegendo o ICG da agregação induzida pelo ambiente interno, como calor ou luz. Assim, esses resultados sugeriram que os NPs de FA-IHA tiveram excelente efeito fototérmico e estabilidade fototérmica.

Em seguida, uma sonda 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) específica para ROS foi usada para detectar a produção de ROS por NPs de FA-IHA após irradiação NIR. Como mostrado na Fig. 4a, FA-IHA NPs produziram uma quantidade significativa de ROS (0,58 na absorbância padrão) dentro de 5 min de irradiação NIR em comparação com ICG livre (0,35), o que pode ser atribuído à terapia de combinação de FA-IHA NPs.

Sob irradiação de laser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) e condição de pH, o desempenho de liberação foi investigado (Fig. 4b). Como contraste, sem irradiação NIR, FA-IHA NPs mostraram 11,61% e 34,2% de liberação de Arte sob pH 7,4 e pH 6,5, respectivamente, enquanto sob irradiação NIR por seis vezes, FA-IHA NPs mostraram um total de 68,4% de liberação de Arte em pH 6,5, sugerindo que a irradiação NIR e a condição ácida podem desencadear significativamente a liberação de Arte de NPs FA-IHA. A irradiação NIR e a liberação de droga responsiva ao ácido foram provavelmente devido à expansão induzida pelo calor de nanopartículas de HSA e, além disso, em ambiente ácido, o H ⁺ poderia alterar a carga superficial de HSA que altera o equilíbrio hidrofílico / hidrofóbico das nanopartículas [37, 38].

Captação celular e detecção de ROS intracelulares

Graças às propriedades de fluorescência de ICG, a captação de NPs de FA-IHA foi observada diretamente em células HepG2 por meio de um microscópio de fluorescência. Como mostrado na Fig. 5a, após o tratamento das células com NPs de FA-IHA, o citoplasma mostrou fluorescência ICG vermelha mais forte do que a observada em células tratadas com NPs de ICG e IHA livres. Além disso, a taxa de captação de células de NPs de FA-IHA foi quantificada por FCM como 52,3%, que era maior do que a de NPs de IHA (25,2%) e ICG livre (3,9%) (Fig. 5b). Os resultados demonstraram que o FA conjugado facilitou as nanopartículas para direcionar os receptores de FA em células tumorais e, assim, aumentar a captação de células de NPs de FA-IHA [39, 40, 41].

Usando um microscópio de fluorescência, observamos a atividade fotodinâmica intrínseca de células tratadas com NPs Arte-, ICG- e FA-IHA com ou sem irradiação NIR. Uma sonda ROS 2, diacetato de 7-diclorodihidrofluoresceína foi usada para visualizar a produção de ROS celular. Os resultados mostraram que os NPs de FA-IHA podem induzir uma produção de ROS significativamente aumentada em comparação com outras amostras após 5 min de irradiação NIR (Fig. 6a). Os valores fluorescentes correspondentes são mostrados na Fig. 6b.

Terapia combinatória de fotoquimio tumoral in vitro

A Figura 7a mostra a mudança de temperatura das células tratadas com PBS-, ICG- livre, IHA NPs- e FA-IHA NPs (com concentração de ICG igual) após 5 min de irradiação NIR (1,0 W / cm ² ) A temperatura das células tratadas com NPs FA-IHA apresentou o maior aumento ( ΔT =31 ° C) em comparação com as células tratadas com PBS-, ICG- livre e IHA NPs. A viabilidade das células tratadas com Arte, IHA NPs e FA-IHA NPs em diferentes concentrações por 24 h sem irradiação NIR diminuiu com o aumento da concentração, enquanto ICG livre nessas concentrações não mostrou qualquer citotoxicidade (Fig. 7b). Enquanto isso, o carreador de fármaco FA-IH NPs (FA-IHA NPs sem Arte) também não mostrou citotoxicidade significativa (Arquivo adicional 1:Figura S2). Em contraste, após a irradiação NIR (1,0 W / cm ² , 5 min), morte celular dependente da concentração significativa foi observada em células tratadas com ICG livre, NPs de IHA e NPs de FA-IHA (Fig. 7c). O efeito foi particularmente significativo em células tratadas com NPs de FA-IHA. O excelente efeito anticâncer pode ser atribuído pela fotoquimioterapia combinacional direcionada, como o efeito quimioterápico do Arte liberado e o efeito terapêutico PTT-PDT do ICG. Além disso, a citotoxicidade de NPs FA-IHA com ou sem irradiação NIR foi investigada por coloração dupla calceína-AM / PI. As células tratadas com NPs FA-IHA e irradiação estavam quase completamente mortas em comparação com outros grupos tratados (Fig. 7d).

Imagem de fluorescência in vivo

Como mostrado na Fig. 8a e b 0,1 h após a injeção de ICG livre, IHA NPs e FA-IHA NPs, um forte sinal de fluorescência pode ser visto em todo o corpo dos camundongos com tumor. Os sinais de fluorescência aumentaram na região do tumor com o aumento do tempo, atingindo o pico 24 horas após a injeção. Os sinais de fluorescência do tumor no grupo de NPs de FA-IHA foram os mais altos em comparação com os grupos de NPs de ICG e IHA em todos os pontos testados (Fig. 8b), indicando que os NPs de FA-IHA podem se acumular altamente na região do tumor devido ao FA -efeito direcionado ao tumor induzido. Além disso, a biodistribuição nos principais tecidos, incluindo coração, fígado, baço, pulmões e rins, foi conduzida por uma análise quantitativa de fluorescência ex vivo 24 horas após a injeção. Em todos os grupos testados, fortes sinais de fluorescência foram detectados no tecido hepático (Fig. 8c), indicando que a principal conversão metabólica desses compostos segue uma via hepática. Esses resultados demonstraram que os NPs de FA-IHA podem se acumular seletivamente em tumores in vivo, provavelmente induzidos pelo efeito direcionado aos FA [37].

Terapia combinatória de fotoquimio de tumor in vivo

Como mostrado na Fig. 9a e b, a temperatura do tumor nos camundongos com tumor após o tratamento com PBS, ICG livre, IHA NPs e FA-IHA NPs 24 h após a injeção sob 5 min de irradiação NIR (1 W / cm ² ) foi gravado por um termovisor. Um aumento de aproximadamente 22,1 ° C na região do tumor foi detectado no grupo tratado com FA-IHA NPs, que foi o mais alto do que nos outros grupos. Após dois ciclos de irradiação NIR (dia 0 e dia 2), o grupo FA-IHA NPs + NIR exibiu uma supressão de crescimento tumoral significativa sem recidiva (Fig. 9c), enquanto os grupos tratados com PBS, Arte, FA-IHA NPs, PBS + NIR, ICG + NIR e IHA NPs + NIR não exibiram nenhuma indicação clara de supressão tumoral. Além disso, após 90 dias, os camundongos no grupo FA-IHA NPs + NIR mostraram 100% de taxa de sobrevivência (Fig. 9d). Estes resultados indicam que os NPs de FA-IHA com irradiação NIR tiveram uma excelente eficácia terapêutica tumoral in vivo, provavelmente devido à terapia de fotoquimioterapia ativa direcionada e combinada.

Finalmente, a coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi usada para avaliar a toxicidade dos NPs de FA-IHA. As imagens de seção não mostraram lesões histológicas significativas em comparação com o grupo tratado com PBS (Fig. 10), indicando que os NPs de FA-IHA tinham toxicidade negligenciável, o que era provavelmente devido à segurança dos ingredientes dos NPs de FA-IHA, sendo benéficos para seu uso futuro na prática clínica.

Conclusões

Em conclusão, um agente teranóstico multifuncional foi preparado, conjugando covalentemente FA e ICG, e encapsulando Arte para fototerapia combinacional direcionada a tumor guiada por imagem in vitro e in vivo. The prepared FA-IHA NPs showed excellent colloidal- and heat-stabilities and fluorescence property. Under NIR irradiation, FA-IHA NPs showed great photothermal effect which could trigger Arte release and produce much more ROS after NIR irradiation than free ICG that exhibited photodynamic performance. The conjugated FA facilitated a highly efficient cellular uptake and tumor accumulation in vitro and in vivo. Moreover, the highly effective anticancer efficacy of FA-IHA NPs combined active targeting thermal drug chemotherapy, such as PTT-PDT therapy, which was demonstrated in vitro and in vivo. Overall, the results obtained indicated that FA-IHA NPs might be a promising tumor-targeted system feasible for future nanomedicine applications.

Abreviações

Arte:: Artesunate
FA:: Folic acid
HSA:: Human serum albumin
ICG:: Indocyanine green
NIR:: Próximo ao infravermelho
PDT:: Terapia fotodinâmica
PEG:: Polietileno glicol
PTT:: Terapia fototérmica

Observação do efeito Hall extrínseco de rotação inversa induzida por foto em um gás de elétron bidimensional GaAs / AlGaAs Efeito da bicamada CeO2 − x / ZnO e ZnO / CeO2 − x heteroestruturas e polaridade de eletroformação nas propriedades de comutação da memória não volátil

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias