Nanopartículas Teranósticas Foto-Quimioterápicas Direcionadas a Tumor de Alta Eficiência: Artesunato Carregado, ICG-Conjugado em Albumina Sérica Humana

Resumo

Relatamos uma plataforma teranóstica específica para tumor que combina quatro agentes clinicamente aprovados — artesunato (Arte), albumina sérica humana (HSA), ácido fólico (FA) e verde de indocianina (ICG) — em uma única nanopartícula (NPs FA-IHA). Estas nanopartículas exibem excepcional estabilidade foto- e físico-química. O ICG confere fluorescência no infravermelho próximo (NIR) para imagem e capacidades terapêuticas fototérmica (PTT) e fotodinâmica (PDT) sob um único laser de 808 nm. Concurrentemente, a irradiação de 808 nm desencadeia liberação controlada de Arte, amplificando a eficácia quimioterápica. Estudos in vitro e in vivo demonstram captação celular rápida e acúmulo seletivo no tumor, verificado por microscopia confocal e imagem NIR em camundongos xenoenxertados HepG2. Uma única sessão de irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm²) combinada com NPs FA-IHA suprime completamente o crescimento tumoral sem recorrência. Estes achados estabelecem NPs FA-IHA como plataforma promissora para tradução clínica de foto-quimioterapia guiada por imagem.

Introdução

A foto-quimioterapia guiada por imagem (IGPC) emergiu como estratégia atraente para oncologia personalizada, unindo localização precisa do tumor com tratamento multimodal enquanto minimiza danos colaterais (1-4). Uma plataforma IGPC bem-sucedida deve ser: (i) multifuncional, integrando modalidades diagnósticas e terapêuticas; (ii) biocompatível, estável e seletiva para tumor (5-8). Imagem por fluorescência, devido à sua alta sensibilidade e resolução temporal favorável, é comumente empregada para guiamento em tempo real (9-16).

Terapia fototérmica (PTT) e terapia fotodinâmica (PDT) podem ser unificadas sob irradiação NIR, entregando calor e espécies reativas de oxigênio (ROS) para ablar células tumorais (17-19). No entanto, monoterapia frequentemente falha em erradicar doença residual, levando a recaída (17-19). Quimioterapia convencional oferece citotoxicidade sistêmica mas sofre de não-especificidade e toxicidades associadas (20-22). Assim, IGPC, que combina fototerapia localizada com quimioterapia direcionada, promete superar estas limitações.

A nanomedicina produziu uma variedade de teranósticos IGPC, incluindo verde de indocianina (ICG), nanopartículas baseadas em metal, nanomateriais de carbono e sistemas poliméricos (23-27). ICG, um corante NIR aprovado pelo FDA, é amplamente usado clinicamente para débito cardíaco, função hepática e angiografia oftálmica (28-29). Sua forte absorção a 800 nm facilita PTT-PDT eficiente. No entanto, ICG livre é instável, limpa rapidamente da circulação, auto-degrada e carece de especificidade tumoral (31-32). Encapsulamento em transportadores como micelas, polímeros ou nanoestruturas proteicas melhorou seu desempenho, mas a necessidade de compostos baseados em ICG mais biocompatíveis e direcionados persiste (33-34).

Aqui, projetamos um agente IGPC direcionado a tumor ligando covalentemente FA e ICG a nanopartículas de HSA, encapsulando simultaneamente Arte — um composto antimalárico natural com atividade anticancerígena comprovada contra cânceres de fígado, pulmão e mama (35). As NPs FA-IHA resultantes aproveitam a captação mediada por receptor FA, a excelente biocompatibilidade da HSA e o poder terapêutico dual do ICG e Arte. Este construto multifuncional oferece imagem NIR, PTT-PDT e quimioterapia de liberação controlada, posicionando-o como plataforma versátil para tradução clínica.

Métodos

Materiais

Reagentes incluíram EDC, NHS e Arte (≥ 99%) da Sigma-Aldrich; DAPI e CCK-8 da Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH e NH₂-PEG₂₀₀₀-FA da Xi'an Ruixi; DMEM e PBS da Gibco; ICG-NHS da Dojindo. Todos os químicos foram usados como recebidos.

Síntese e Caracterização das NPs FA-IHA

Arte foi dissolvido em DMSO, então adicionado a 15 mL de água. HSA (10 mg) foi introduzido e agitado por 3 h à temperatura ambiente, seguido de reticulação com 150 µL de glutaraldeído 0,5%. A mistura foi dialisada contra água destilada (PMCO 8-12 kDa) por 24 h para produzir Arte-HSA. Ativação dos grupos carboxila da HSA com EDC/NHS foi seguida de conjugação com NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 h, 4 °C) e subsequente ligação de ICG-NHS (30 min, TA). NPs FA-ICG-HSA@Arte (NPs FA-IHA) finais foram purificadas por diálise de 24 h em água desionizada. Eficiências de carregamento de Arte e ICG foram quantificadas por espectroscopia UV-vis (carregamento % = W₁/W₂ × 100%).

Morfologia foi avaliada por TEM (Hitachi). Tamanho hidrodinâmico e potencial ζ foram medidos por DLS (Malvern Zetasizer). Espectros de absorbância foram registrados em espectrofotômetro UV-vis Shimadzu. Respostas fototérmicas foram medidas usando laser CW de 808 nm (1 W/cm²) com temperatura monitorada por termopar Fluke. Fotostabilidade e longevidade de fluorescência foram avaliadas ao longo de 5 ciclos e 30 dias, respectivamente.

Liberação de Arte Induzida por Térmico e pH

NPs FA-IHA (50 µg/mL) foram incubadas a pH 6,5, pH 7,4 e pH 6,5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², pulso de 1 min) por 36 h. Liberação de Arte foi quantificada por UV-vis a 287 nm no sobrenadante.

Detecção de Produção de Oxigênio Singlete

DPBF (15 µL) foi misturado com 1 mL de 10 µg/mL ICG ou NPs FA-IHA e irradiado (808 nm, 1 W/cm², 5 min). Redução de absorbância a 410 nm ao longo do tempo refletiu geração de oxigênio singlete.

Cultura Celular e Captação Celular

Células HepG2 (ATCC) foram cultivadas em DMEM com 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C, 5% CO₂. Para estudos de captação, células foram incubadas com ICG livre, NPs IHA ou NPs FA-IHA (0,05 mg/mL ICG) por 6 h, lavadas, fixadas, coradas com DAPI e imageadas por microscopia confocal. Citometria de fluxo quantificou taxas de internalização.

Geração de ROS Intracelular

Células HepG2 (2 × 10⁵ células/mL) foram tratadas com PBS, Arte, NPs FA-HA, ICG livre, NPs IHA ou NPs FA-IHA por 12 h, então irradiadas (808 nm, 1 W/cm², 5 min). DCFH-DA (5 µg/mL) foi adicionado por 30 min, seguido por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência para avaliar níveis de ROS.

Foto-Quimioterapia Combinatória In Vitro

Células HepG2 (2 × 10⁴ células/poço) foram tratadas com ICG livre, Arte, NPs IHA ou NPs FA-IHA (Arte 0-30 µg/mL) por 6 h, então irradiadas (808 nm, 1 W/cm², 5 min) ou não tratadas. Viabilidade celular foi medida por CCK-8 após 24 h. Coloração vivo/morto (calceína-AM/PI) confirmou citotoxicidade via imagem confocal.

Modelo Animal e Imageamento de Fluorescência In Vivo

Camundongos Balb/c nude (n=5) foram injetados subcutaneamente com 1 × 10⁶ células HepG2. Imageamento IVIS Spectrum (Caliper) rastreou fluorescência NIR a 10 min, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h pós-injeção intravenosa de ICG livre, NPs IHA ou NPs FA-IHA.

Foto-Quimioterapia Combinatória In Vivo

Camundongos foram randomizados em seis grupos (n=5): PBS, Arte, NPs FA-IHA, ICG + NIR, NPs IHA + NIR, NPs FA-IHA + NIR (dose igual de Arte). Irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 min) foi aplicada a 24 h e 48 h. Volumes tumorais foram registrados a cada 4 dias e expressos relativos à linha de base. Pós-tratamento, órgãos principais foram colhidos para histologia H&E.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização das NPs FA-IHA

A Figura 1 descreve esquematicamente o design e fluxo de trabalho terapêutico das NPs FA-IHA. As nanopartículas foram montadas via método simples e biocompatível, integrando ICG para imagem NIR e fototerapia, e Arte para ação quimioterápica.

Representação esquemática do uso de NPs FA-IHA para foto-quimioterapia combinatória guiada por imagem e direcionada a tumor in vitro e in vivo

Microscopia eletrônica de transmissão revelou partículas monodispersas, esféricas (~131,2 nm). Espalhamento dinâmico de luz confirmou diâmetro hidrodinâmico de 131 ± 2,3 nm em água, PBS e meio de cultura, com potencial ζ estável de -29,2 ± 1,13 mV. Tamanho permaneceu inalterado por 7 dias, indicando robusta estabilidade coloidal conferida pelo revestimento PEG e HSA. Espectros UV-vis exibiram picos característicos de Arte e ICG, confirmando carregamento bem-sucedido (Arte 98,6 ± 3,1%, ICG 56,9 ± 2,4%). Espectros de fluorescência corresponderam ao ICG livre, confirmando propriedades fotofísicas preservadas.

a Imagem TEM de NPs FA-IHA. b, c Distribuição de tamanho e potencial ζ de NPs FA-IHA em água, meio celular e PBS. d Variação de tamanho de NPs FA-IHA em água, meio celular e PBS. e Espectros de absorbância de ICG livre, Arte e NPs FA-IHA. f Espectros de fluorescência de ICG livre e NPs FA-IHA

Avaliação fototérmica mostrou que NPs FA-IHA (conteúdo igual de ICG) elevaram a temperatura em ~36 °C em 5 min sob irradiação 808 nm (1 W/cm²), enquanto ICG livre mostrou elevação similar e água mal aumentou (<4 °C). Testes de fotostabilidade revelaram que NPs FA-IHA mantiveram absorbância ao longo de cinco ciclos de irradiação, enquanto ICG livre perdeu intensidade, ressaltando o efeito protetor da conjugação covalente e encapsulamento HSA/PEG. Longevidade de fluorescência por 30 dias a 4 °C mostrou redução de 28% para NPs FA-IHA versus queda de 88% para ICG livre, destacando fotostabilidade superior.

a Curvas de aquecimento fototérmico de água, ICG e NPs FA-IHA sob irradiação laser 808 nm 5 min (1 W/cm²). b Variações de temperatura de ICG e NPs FA-IHA após cinco ciclos contínuos de irradiação 5 min. c Mudança de absorbância de NPs FA-IHA a 780 nm antes e depois de cinco ciclos de irradiação. d Mudança de fluorescência de ICG e NPs FA-IHA por 30 dias

Ensaios DPBF demonstraram que NPs FA-IHA produziram 58% do rendimento padrão de oxigênio singlete em 5 min de exposição NIR, superando ICG livre (35%). Este aumento reflete o efeito sinérgico da fototerapia dual.

a Absorbância DPBF normalizada na presença de ICG, NPs FA-IHA e amostra em branco sob irradiação laser 808 nm (1 W/cm²). b Cinética de liberação de Arte de NPs FA-IHA sob pH 7,4 e pH 6,5 com ou sem irradiação laser NIR, respectivamente

Sob condições ácidas (pH 6,5) e irradiação NIR, a liberação de Arte de NPs FA-IHA aumentou de 11,6% (pH 7,4) para 68,4% (pH 6,5 + NIR). Os gatilhos duplos — expansão térmica da HSA e alteração de carga de superfície mediada por prótons — facilitam liberação controlada de fármaco (37-38).

Captação Celular e Detecção de ROS Intracelular

Imagem confocal revelou fluorescência vermelha de ICG pronunciada em células HepG2 tratadas com NPs FA-IHA, superando ICG livre e NPs IHA. Citometria de fluxo quantificou taxa de captação de 52,3% para NPs FA-IHA, marcadamente maior que NPs IHA (25,2%) e ICG livre (3,9%) — clara indicação de direcionamento mediado por receptor FA (39-41).

a Imagens fluorescentes confocais de células HepG2 após incubação com ICG livre, NPs IHA e NPs FA-IHA. Cores vermelha e azul representam fluorescência de ICG e núcleos corados com DAPI, respectivamente. b Medição por citometria de fluxo de intensidades de fluorescência de ICG em células HepG2 após incubação com ICG livre, NPs IHA e NPs FA-IHA

Produção de ROS, avaliada com DCFH-DA, foi significativamente maior em células tratadas com NPs FA-IHA após 5 min de irradiação NIR comparado a todos os outros grupos, confirmando atividade fotodinâmica aprimorada (Figura 6a,b).

a Imagens de fluorescência de produção de ROS em células cancerosas tratadas com vários fármacos, e b intensidade fluorescente correspondente: (1) PBS, (2) Arte, (3) NPs FA-HA, (4) ICG livre + NIR, (5) NPs IHA + NIR, e (6) NPs FA-IHA + NIR

Foto-Quimioterapia Combinatória In Vitro

NPs FA-IHA alcançaram o maior aumento de temperatura (~31 °C) entre todos os tratamentos após 5 min de exposição NIR, correlacionando com desempenho fototérmico superior (Figura 7a). Sem irradiação, Arte, NPs IHA e NPs FA-IHA exibiram citotoxicidade dependente de concentração, enquanto ICG livre permaneceu inerte. Pós-irradiação, viabilidade celular caiu dramaticamente no grupo NPs FA-IHA, atribuível a efeitos sinérgicos quimio-fototérmicos. Coloração calceína-AM/PI confirmou morte celular quase completa em NPs FA-IHA + NIR, enquanto outros grupos mantiveram células viáveis (Figura 7d).

a Curvas de mudança de temperatura de PBS, ICG livre, NPs IHA e NPs FA-IHA em placas de 96 poços após 5 min de irradiação NIR. b, c Viabilidade celular de células tratadas com ICG livre, Arte, NPs IHA e NPs FA-IHA sem ou com irradiação laser 808 nm (5 min, 1 W/cm²), respectivamente. d Imagens de dupla coloração calceína-AM/PI de células após tratamento com PBS (controle), PBS + NIR, NPs FA-IHA e NPs FA-IHA + NIR, respectivamente

Imageamento de Fluorescência In Vivo

Imageamento IVIS revelou forte fluorescência de corpo inteiro dentro de 10 min pós-injeção de todas as formulações. Fluorescência tumoral atingiu pico a 24 h, com NPs FA-IHA exibindo o maior sinal em todos os pontos de tempo, confirmando acúmulo tumoral dirigido por FA (Figura 8b). Análise ex vivo de órgãos a 24 h mostrou captação hepática predominante em todos os grupos, consistente com vias de depuração hepática (Figura 8c).

a Imagens de fluorescência representativas de camundongos portadores de tumor após injeção intravenosa com ICG livre, NPs IHA e NPs FA-IHA. Círculos tracejados pretos indicam região tumoral. b Análise quantitativa in vivo do sinal de fluorescência nas regiões tumorais de camundongos tratados com ICG livre, NPs IHA e NPs FA-IHA em função do tempo de injeção. c Sinal de fluorescência de órgãos principais incluindo coração, fígado, baço, pulmões e rim

Foto-Quimioterapia Combinatória In Vivo

Imageamento térmico a 24 h pós-injeção sob irradiação NIR mostrou o maior aumento de temperatura (~22,1 °C) para NPs FA-IHA, confirmando conversão fototérmica potente (Figura 9a,b). Duas sessões de irradiação (dia 0 e dia 2) levaram a regressão tumoral completa no grupo NPs FA-IHA + NIR, sem recaída por 90 dias e taxa de sobrevivência de 100%, enquanto todos os outros grupos falharam em alcançar supressão sustentada (Figura 9c,d). Exame histológico revelou nenhuma patologia orgânica significativa no grupo NPs FA-IHA + NIR, ressaltando toxicidade sistêmica insignificante (Figura 10).

a Temperaturas da região tumoral em camundongos portadores de tumor após injeção intravenosa de PBS, ICG, NPs IHA e NPs FA-IHA a 24 h sob 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm²). b Imagens térmicas de camundongos portadores de tumor após injeção intravenosa de PBS, ICG, NPs IHA e NPs FA-IHA a 24 h sob 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm²). c Perfil de crescimento de xenoenxerto HepG2 após injeção intravenosa de PBS, Arte, ICG, NPs IHA e NPs FA-IHA com ou sem 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm²). d Taxa de sobrevivência de camundongos portadores de tumor após injeção intravenosa com PBS, Arte livre, ICG, NPs IHA e NPs FA-IHA com ou sem 5 min de irradiação NIR (808 nm, 1 W/cm²)

Secções de tecido coradas H&E de órgãos principais, incluindo coração, fígado, baço, pulmões e rim de camundongos tratados com PBS e NPs FA-IHA

Conclusões

Projetamos uma nanopartícula teranóstica multifuncional que conjuga covalentemente FA e ICG enquanto encapsula Arte dentro de HSA. As NPs FA-IHA demonstram robusta estabilidade coloidal e fototérmica, preservam fluorescência NIR e liberam Arte sob irradiação NIR. Direcionamento mediado por receptor FA resulta em alta captação celular e acúmulo tumoral, permitindo um ataque sinérgico fototérmico-fotodinâmico-quimioterápico que erradica tumores in vitro e in vivo sem recorrência. Estes resultados posicionam NPs FA-IHA como plataforma altamente promissora para tradução clínica de foto-quimioterapia guiada por imagem e direcionada a tumor.

Abreviações

Arte:

Artesunato

FA:

Ácido fólico

HSA:

Albumina sérica humana

ICG:

Verde de indocianina

NIR:

Infravermelho próximo

PDT:

Terapia fotodinâmica

PEG:

Polietileno glicol

PTT:

Terapia fototérmica