Avaliação de toxicidade de nanopartículas de PEG-PCCL e investigação preliminar sobre seu efeito antitumoral de carregamento de paclitaxel

Resumo

A eficiência do tratamento único de drogas quimioterápicas convencionais é desagradavelmente reduzida pelas barreiras fisiológicas dos tumores. A este respeito, as nanopartículas tornaram-se atraentes para atingir esse propósito médico de terapia direcionada contra o câncer por meio da distribuição de agentes antitumorais na área necessária. Um novo distribuidor de droga, poli (etilenoglicol) carboxil-poli (ε-caprolactona) (PEG-PCCL), foi relatado como sendo altamente hidrofílico e estável, enquanto pouco se sabe sobre sua toxicidade orgânica. Este estudo se concentrou em avaliações de toxicidade sistêmica de PEG-PCCL. A farmacocinética do PEG-PCCL carregado com PTX (PEG-PCCL / PTX) e seu efeito antitumoral foram investigados preliminarmente. No presente trabalho, o PEG-PCCL foi caracterizado por analisador de tamanho de partícula a laser e microscopia eletrônica de transmissão. A citotoxicidade foi investigada pelo teste de MTT, ensaio de infiltração de LDH, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão. Testes de hemólise, flebite e toxicidade de órgãos foram realizados para demonstrar a biocompatibilidade e biotoxicidade aguda. Camundongos com tumor H22 foram usados ​​para avaliar a farmacocinética das micelas de PEG-PCCL / PTX e seu efeito antitumoral. Os resultados mostraram que o tamanho das nanoesferas de PEG-PCCL foi de 97 ± 2,6 nm. O tratamento com PEG-PCCL mostrou pouca citotoxicidade e boa biocompatibilidade, e não exibiu toxicidade para órgãos. A eficiência de carregamento de PTX foi de 49,98%. O estudo farmacocinético em camundongos com tumor H22 revelou que o PEG-PCCL / PTX tem maior estabilidade e liberação mais lenta do que o PTX sozinho. Juntos, esses resultados sugerem que a nanoesfera PEG-PCCL tem pouca toxicidade para os organismos e é um candidato potencial de veículo de droga biocompatível para drogas hidrofóbicas.

Introdução

A tendência de aumento da incidência de câncer continua junto com o aumento do envelhecimento da população nas últimas décadas [1]. A eficácia da quimioterapia convencional em cânceres tem sido limitada, pois apenas uma pequena porção da dose total atinge o local do tumor, o restante da qual é distribuído por tecidos saudáveis, resultando em efeitos negativos, especialmente neutropenia e cardiomiopatia [2]. As nanopartículas representam uma plataforma potencial para a entrega de drogas quimioterápicas devido às suas características físicas e químicas únicas [3]. Como resultado, efeito colateral reduzido e eficácia terapêutica aumentada podem ser alcançados. Poli (etilenoglicol) (PEG) e metoxi poli (etilenoglicol) (MePEG) / poli (ɛ-caprolactona) (PCL) à base de copolímeros são supostamente nanopartículas orgânicas promissoras usadas em sistemas de distribuição de drogas (DDSs), e já foram aprovado pelo FDA. Essas nanopartículas possuem características fáceis de controlar, como biocompatibilidade, biodegradabilidade e termossensibilidade [4]. Alguns polímeros diblocos e triblocos têm sido investigados em aplicações biomédicas, como PCL nanosfera [5], PEG-PCL-PEG [6,7,8] e PCL-PEG-PCL [9] hidrogel. Os blocos de PCL compõem um núcleo hidrofóbico encapsulando drogas hidrofóbicas, enquanto os blocos de PEG formam uma concha hidrofílica, que faz nanoestruturas micelares núcleo-concha. Esses polímeros diblocos e triblocos atraem considerável atenção devido às características como estrutura estável, duração prolongada na circulação sanguínea e direcionamento passivo por meio de permeação aprimorada e efeito de retenção [10]. No entanto, ainda existem desafios controversos de polímeros orgânicos, incluindo toxicidade, baixa carga útil de drogas, vazamento indesejado de drogas e eliminação pelo sistema reticuloendotelial [11,12,13].

Em comparação com os polímeros mencionados acima, PEG-PCCL, aquele que é adicionalmente carboxil covalentemente modificado na caprolactona e foi preparado e caracterizado em nossos estudos anteriores [14, 15], mostra maior hidrofilicidade e melhor estabilidade por meio do efeito da ligação de hidrogênio . Além dos resultados das características físico-químicas, poucos dados foram relatados envolvendo o estudo de toxicidade in vivo e in vitro de portadores poliméricos. No entanto, modelos preditivos e métodos padrão validados requerem um conjunto de regras de design envolvendo o ensaio de toxicidade de nanopartículas.

Dado isso, focamos aqui na avaliação da toxicidade aguda in vivo e in vitro de PEG-PCCL qualitativa e quantitativamente, apesar de seus atributos favoráveis ​​de alta tolerância e biodegradabilidade in vivo. Uma nanopartícula amplamente utilizada em pesquisas biomédicas, a Polieterimida (PEI), foi eleita como controle positivo. Paclitaxel (PTX) é um medicamento anticâncer de primeira linha [16], especialmente um quimioterápico otimizado para câncer de ovário e câncer de pulmão de células não pequenas, e foi listado na Lista de medicamentos essenciais da Organização Mundial de Saúde . Com o desenvolvimento da nanotecnologia, o carregamento de PTX em nanopartículas é considerado uma solução potencial para a entrega de drogas específicas ao local sob a circunstância de tratamento de cooperação multidisciplinar [17, 18]. Neste estudo, PEG-PCCL carregado com PTX foi usado para examinar a farmacocinética e seu efeito antitumoral in vivo em modelo de camundongo portador de tumor hepático H22.

Métodos

Materiais, células e animais

ε-caprolactona (ε-CL, Alfa Aesar, EUA), poli (etilenoglicol) (PEG, Mn =1000, Fluka, EUA), diisocianato de hexametileno (HMDI, Aldrich, EUA), Paládio sobre carvão (pd / c, Sigma , EUA), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Hyclone, EUA), brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT, Sigma, EUA), albumina de soro bovino (BSA , BR, BoAo Co. Ltd., China) sem purificação adicional. Todos os materiais eram de grau analítico de reagente.

Camundongos Balb / C machos (7–8 semanas de idade, 20–25 g de peso) e coelho da Nova Zelândia (2,5–3,0 kg de peso) foram adquiridos das empresas de biotecnologia Chengdu DaShuo (Sichuan, China) com o Certificado de Qualidade nº SCXK2013– 24 Os animais foram mantidos em um ambiente livre de patógenos específicos padrão com comida suficiente e água da torneira. Os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Ministério da Ciência e Tecnologia da China, 2006). Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética para Animais de Laboratório do Centro Médico da China Ocidental da Universidade de Sichuan.

Células de hepatocarcinoma H22 de camundongo (H22), células de rim embrionário humano (HEK293T) e células de carcinoma de hepatoma (Hep G2) foram obtidas do Departamento de Imunologia, Escola de Ciências Médicas Básicas e Medicina Legal da China Ocidental, Universidade de Sichuan. HEK293T e Hep G2 foram cultivados em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Hyclone, UT, EUA), suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) (Hyclone, UT, EUA) e antibióticos (penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 U / mL) a 37 ° C em 5% de CO2.

Preparação de PEG-PCCL e Micélulas PEG-PCCL carregadas com PTX

PEG-PCCL e PTX-NPs foram fornecidos por nosso cooperador, Professor Liu da Escola de Microeletrônica e Eletrônica de Estado Sólido da Universidade de Ciência Eletrônica e Tecnologia da China. Os copolímeros de dibloco PEG-PCCL foram sintetizados pela polimerização de abertura de anel de ɛ-CL na presença de homopolímero de PEG com os catalisadores de paládio sobre carvão como o diagrama de fluxo abaixo (Fig. 1). Os copolímeros PEG-PCCL obtidos foram purificados e mantidos em sacos herméticos até o uso.

O diagrama de fluxo de síntese do dipolímero PEG-PCCL

Para carregar PTX em nanopartículas de PEG-PCCL, dispersão sólida, uma técnica simples e valiosa sem solvente orgânico venenoso [19] foi realizada após o PEG-PCCL ter sido preparado. Em seguida, a solução foi evaporada a 60 ° C sob pressão reduzida. Após a evaporação do álcool, foram obtidos copolímeros homogêneos. PTX foi encapsulado por transportadores poliméricos na forma amorfa. A coevaporação foi dissolvida em água a 65 ° C para produzir solução de PTX-NPs, que foi filtrada com um filtro de 0,22 nm para obter uma solução clarificada e estéril. O pó de PTX-NPs foi obtido a partir da solução liofilizada de um sistema de liofilização. A eficiência de aprisionamento (EE) de PTX foi determinada com o método de centrifugação em minicoluna [20]. As concentrações de PTX incorporadas em PEG-PCCL (C _I ) ou o fármaco total em dispersões de PEG-PCCL (C _T ) foram analisados ​​por HPLC. EE (%) =(C _I / C _T ) × 100%.

Caracterização

O tamanho de partícula e o potencial zeta de PEG-PCCL foram medidos com analisador de tamanho de partícula a laser (Malvern Nano-ZS 90). Microscopia eletrônica de transmissão (TEM, H-6009IV, Hitachi, Japão) foi usada para avaliar a morfologia do PEG-PCCL. Especificamente, a solução de nanopartículas foi colocada em uma grade de cobre coberta com nitrocelulose, e então as amostras foram coradas com ácido fosfotúngstico e secas em temperatura ambiente.

Ensaios de citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio de infiltração de MTT e LDH em Hep-G2 e HEK293T. A metabolização do MTS foi quantificada em células intactas de acordo com o procedimento do MTT [21]. As suspensões celulares foram preparadas por tripsina / EDTA (HyClone, UT, EUA). Um total de 0,4 × 10 ⁴ as células foram semeadas em placas de 96 poços (Corning, MA, EUA). As placas foram incubadas por 12 h para permitir que as células se fixassem na superfície de plástico das placas de cultura. Em seguida, o meio foi removido e 200 μl de meio de cultura fresco ou meio contendo diferentes concentrações de PEG-PCCL (de 0 a 1 mg / mL) foram adicionados aos poços. Nenhum FCS foi adicionado ao meio durante o período de exposição de 24 horas. A taxa de sobrevivência foi determinada por parâmetros de citotoxicidade e foi apresentada pela equação:Taxa de sobrevivência (%) =(DO _T / OD _C ) × 100. Aqui, OD _T e OD _C referem-se ao valor de absorbância (medido com o leitor de espectrofotômetro a 570 nm) de células tratadas com nanopartículas de PEG-PCCL ou PEI e de células não tratadas, respectivamente.

O vazamento de LDH no meio de cultura foi examinado usando o kit de ensaio de LDH (Biotech, China). Todas as medições espectrométricas de grupos tratados com nanopartículas foram corrigidas por um controle livre de células. Para o estudo morfológico, células HepG2 foram semeadas e expostas da mesma forma que nos ensaios de citotoxicidade. As células foram fixadas em paraformaldeído 4% e observadas ao microscópio eletrônico de transmissão (TEM).

Ensaios de apoptose

A apoptose foi determinada por coloração dupla com anexina V-FITC e PI [22]. Resumidamente, as células HepG2 foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 4 × 10 ⁴ células / poço e tratadas com PEG-PCCL (0,5 mg / mL) e PEI (0,5 mg / mL) por 48 h. Em seguida, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria três vezes seguido por incubação com Anexina V-FITC por 15 min e coloração PI por mais 15 min a 4 ° C no escuro. As células coradas foram observadas em microscópio de fluorescência (Olympus Co. Ltd., Tóquio, Japão) em 30 min.

Ensaio de hemocompatibilidade

A hemocompatibilidade de PEG / PCCL foi avaliada de acordo com o teste de hemólise in vitro de hemácias (RBC) relatado anteriormente [23]. As amostras de sangue dos camundongos foram coletadas e os eritrócitos foram dissolvidos em PBS (solução de RBC a 2%). Solução salina fisiológica, PEI ou PEG-PCCL de 0,5 mg / ml foram misturados com a solução de RBC a 2%. Um controle de hemólise positivo foi preparado pela adição de igual volume de suspensão de eritrócitos e água destilada. Após a mistura ter sido mantida por 1 e 3 h a 37 ° C e então centrifugada a 2.000 r / min por 5 min, os sobrenadantes foram detectados com um leitor de microplaca (Bio-Rad, CA, EUA) a 570 nm. A porcentagem de hemólise foi calculada pela equação:hemólise% =(OD _T –OD _NC ) / (OD _PC –OD _NC ) × 100. Aqui, OD _T , OD _NC e OD _PC referem-se aos valores de absorbância da amostra, controle negativo e controle positivo, respectivamente. Além disso, a hemólise in vivo foi avaliada pela contagem do número de hemácias da amostra de sangue coletada pela veia caudal de camundongos tratados com solução salina normal, PEI (20 mg / kg) ou PEG-PCCL (20 mg / kg) por 3 h.

Flebite de coelho

As veias de ambas as orelhas de coelhos foram utilizadas para comparar a infiltração de células inflamatórias e a degeneração epidérmica [24, 25]. Os coelhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos; cada um recebeu 1 ml de solução salina fisiológica ou 0,5 mg / ml de PEG-PCCL pela veia auricular. Coelhos foram mortos por overdose de hidrato de cloral (4%, Sigma, EUA) 24 horas após a infusão das nanopartículas. Duas amostras de veias da orelha, incluindo a região de 10-15 mm da ponta do cateter proximal e distalmente, foram obtidas. Essas veias foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4%. Em seguida, secções transversais de parafina foram preparadas e coradas com hematoxilina e eosina (HE). O exame histopatológico foi realizado às cegas. Os achados foram graduados de acordo com os critérios mostrados na tabela que foram baseados nos de Kuwahara [17] com o acréscimo de degeneração epidérmica.

Testes de função hepatorrenal

Após 7 dias de administração de PEG-PCCL (0,5 mL, 20 mg / kg) em camundongos, as amostras de sangue foram extraídas do plexo venoso orbital (2 mL) e imediatamente centrifugadas a 1300 g, 4 ° C. O sobrenadante foi retirado. Em seguida, os parâmetros bioquímicos séricos [26], incluindo aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (ALP), bilirrubi, creatinina, ácido úrico e albumina foram avaliados usando analisador bioquímico automático animal (Dri-Chem 3000 , Fuji Photo, Tóquio, Japão), que são indicadores indiretos da função hepática e renal.

Exame histopatológico

As alterações histopatológicas do pulmão, fígado e rim foram examinadas com coloração H&E em 24 h, 48 h e 7 dias após a injeção de PEG-PCCL, solução PEI ou solução salina normal (0,5 mL, 20 mg / kg) por meio de camundongos veia da cauda. Esses órgãos foram obtidos após o sacrifício de animais. A seção de histopatologia e a coloração H&E foram realizadas conforme descrito em outro lugar [26]. As alterações histopatológicas foram observadas em microscópio de luz e registradas em câmeras variadas (Leica, Co. Ltd., Alemanha).

Concentração de sangue

A concentração sanguínea de PTX foi calculada usando espectrofotômetro (LAMBDA 950, PerkinElmer, China). Amostras de sangue foram retiradas da órbita de camundongos a 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 h após o tratamento. O sobrenadante (100 μL) foi coletado após centrifugação a 1300 g por 10 min. A concentração de PTX em cada amostra de sangue foi determinada com espectrofotômetro a 760 nm.

Modelos e tratamento de tumor em camundongo

Suspensão de células H22 (0,25 mL, 4 × 10 ⁶ células / camundongo) foi injetado intraperitonealmente em camundongos Balb / C no dia 0. Quando a ascite se formou (no dia 3 ~ 5), camundongos com tumor foram divididos aleatoriamente em três grupos ( n =5) e o tratamento foi iniciado. Os camundongos foram injetados com solução salina normal, PEG-PCCL / PTX (20 mg / kg) ou PTX (10 mg / kg) por via intraperitoneal em um volume de 0,5 mL nos dias 3 e 10 para avaliar a eficácia antitumoral. O perímetro abdominal (AP) foi medido todos os dias para calcular a porcentagem aumentada de AP (IPAP) conforme a seguinte formulação:IPAP =( P _n - P ₀ ) / P _n . No dia 10, os camundongos sobreviventes foram sacrificados por deslocamento cervical e as ascites foram coletadas e pesadas. O tempo de sobrevivência dos camundongos foi observado até o dia 20. Camundongos portadores de tumor foram executados no ponto final com sinais de angústia, incluindo alta taxa respiratória, arrepios de pelos, postura arqueada, atividade reduzida e formação progressiva de ascite [27]. A atividade antitumoral foi avaliada de forma abrangente por dias de sobrevivência, perímetro abdominal e volume de ascite. Os ratos foram alimentados em condições laboratoriais padrão.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com SPSS 19.0 (IBM, NY, EUA). Cada tratamento experimental foi repetido independentemente por pelo menos três vezes. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). A análise de variância (ANOVA) foi empregada para a análise estatística. O grau de cada achado de flebite foi analisado pelo teste de soma de postos de Wilcoxon. O teste de Dunnett foi usado para comparar as intervenções individuais. A significância estatística foi indicada em P <0,05.

Resultados

Morfologia, Diâmetro e Potencial Zeta de PEG-PCCL

Os resultados do analisador de tamanho de partícula a laser mostraram que o diâmetro médio do PEG-PCCL foi de 97 ± 2,6 nm. Os resultados de TEM de PEG-PCCL (Fig. 2) revelaram que o PEG-PCCL tinha formas esféricas e uniformes na solução. O potencial zeta médio de PEG-PCCL foi - 18,4 mV. O método de centrifugação em minicoluna mostrou que o EE% foi de 55,98%.

A característica da imagem PEG-PCCL:TEM. As barras de escala eram de 100 nm

Citotoxicidade

A citotoxicidade do PEG-PCCL foi avaliada por comparação com PEI, um veículo típico em nanoescala, em linhagens celulares HEK293T e Hep-G2. Dentro da faixa de concentração (de 0 a 1 mg / mL) de PEG-PCCL ou PEI, a viabilidade de ambas as células HEK293T (Fig. 3a) e células tumorais (Hep-G2) (Fig. 3b) desceu em uma concentração dependente maneiras. As células embrionárias pareceram mais sensíveis na concentração de 0,25 mg / mL, enquanto as células tumorais acima de 1 mg / mL. Em comparação com PEI, PEG-PCCL mostrou menos citotoxicidade, especialmente em concentrações mais elevadas, ou seja, 0,75 e 1 mg / mL ( P =0,023). O ensaio de LDH mostrou que a taxa de mortalidade tanto em células embrionárias quanto em células tumorais aumentou com o tempo de exposição; (i) foi de 19 e 42% em 24 e 48 h, respectivamente, a 0,5 mg / mL de PEG-PCCL (Fig. 3c) menor do que o de PEI. (ii) As células tumorais mostraram uma taxa de morte ligeiramente inferior (32%) no momento de 48 h, quando as células foram expostas a PEG-PCCL em comparação com PEI ( P =0,037) (Fig. 3d).

A citotoxicidade de PEG-PCCL em comparação com PEI. a , b O ensaio de MTT mostrou a taxa de sobrevivência de 293 T e concentração de HepG2 de forma dependente em comparação com o grupo controlado negativo (PEI). c , d Ensaio de vazamento de LDH de 293 T e HepG2 expondo a PEG-PCCL e PEI após 48 h. * P <0,05 versus grupo PEI

SEM

As imagens de microscopia eletrônica de células Hep-G2 intactas e células tratadas com nanopartículas de PEG-PCCL foram mostradas na Fig. 4. Em células Hep-G2 intactas, havia microvilosidades abundantes (Mv) em cada superfície, e o núcleo (N) era localizado mais em direção às bases do que à porção apical. Numerosas mitocôndrias (Mt), complexo de Golgi (Go) e retículo endoplasmático rugoso (RER) foram distribuídos no citoplasma. Em células tratadas com PEG-PCCL, as vesículas pinocitóticas estavam definitivamente aumentadas. Não foram observadas alterações histopatológicas significativas e as organelas arredondadas N e citoplasmáticas, incluindo Mt, RER e Go, estavam intactas.

Micrografias eletrônicas. a , b Células HepG2 normais. c , d Células tratadas com nanopartículas de PEG-PCCL por MEV (microscópio eletrônico de varredura). A seta escura aponta para as vesículas pinocitóticas

Apoptose

A diminuição significativa da viabilidade celular pode ser correlacionada às características de tamanho de partícula, química de superfície e concentração [28], o que despertou nosso interesse nos mecanismos subjacentes à morte celular observada em células HepG2. Para determinar se a morte celular foi atribuída a apoptose ou necrose, as células HepG2 foram tratadas com PEI ou PEG-PCCL para anexina V e co-coloração com PI. Conforme observado ao microscópio de fluorescência (Fig. 5), as células tratadas com PEI ou PEG-PCCL mostraram apoptose mais precoce em comparação com o grupo de controle em branco, conforme indicado pela fluorescência verde corada por anexina V. As células tratadas com PEI exibiram apoptose mais potente do que aquelas de PEG-PCCL, que estava de acordo com o resultado anterior do ensaio MTT.

A coloração com FITC-Anexina V representou a apoptose celular. As células HepG2 incubadas com nanopartículas a uma concentração de 0,5 mg / mL por 48 h e, em seguida, co-coradas com iodeto de propídio (vermelho) e anexina V (verde) foram fotografadas em × 40

Biocompatibilidade

Hemólise

Como as nanopartículas biocompatíveis são projetadas para fins de aplicações endovasculares, as investigações de hemocompatibilidade e citotoxicidade endotelial são necessárias. O teste in vitro mostrou que, durante as 3 horas de observação, a hemólise aumentou com o tempo, no qual o PEG-PCCL exibiu uma razão de hemólise menor do que a solução salina normal (Fig. 6a). O teste in vivo revelou tendência semelhante. Em contraste, PEI causou hemólise severa tanto in vitro quanto in vivo (Fig. 6b).

Razão de hemólise e contagem de células (× 10 ⁹ / L) de amostra de sangue em 3 h. In vitro ( a ) in vivo ( b ) * P <0,05 versus grupo de controle negativo

Flebite de coelho

O exame histopatológico (fig. 7) ilustrou endotélio vascular intacto, sem necrose de condrócitos na cartilagem auricular. Observou-se pequeno edema da parte proximal da veia. Em relação à perda de células endoteliais venosas e infiltração de células inflamatórias, a co-infusão (Tabela 1) dos grupos tratados com PEG-PCCL após 12 e 24 h tendeu a aumentar, mas a melhora não foi estatisticamente significativa ( P > 0,05).

Fotomicrografias da veia auricular após infusão de 24 h coradas por H&E. a , b Grupo de infusão com solução salina normal. c , d Grupo de infusão com PEG-PCCL. As agulhas representam a cartilagem auricular. (Imagem esquerda × 10, imagem direita × 40)

Toxicidade de órgãos

Para avaliar a toxicidade aguda de PEG-PCCL nos órgãos principais, o exame histopatológico no pulmão, fígado e rim foi realizado após a administração intravenosa de PEG-PCCL a 0,5 mg / mL por 3 dias em camundongos ( n =5). Solução salina normal e PEI foram usados ​​como controles. Os resultados mostraram que a PEI causou inflamação discreta e espessura do interstício lobular e cariiocinose de hepatócitos (fig. 8). Embora, em comparação com o grupo de solução salina normal, nenhuma alteração histopatológica aparente tenha sido observada em todos os órgãos examinados no grupo tratado com PEG-PCCL (Fig. 7); a função hepatorrenal foi examinada para confirmação adicional de sua não toxicidade (Tabela 2).

O H&E tingindo imagens microscópicas de luz do pulmão, fígado e rim. As imagens são coletadas de camundongos administrados por via intravenosa com NS, PEI e PEG-PCCL. As agulhas representam a cariocinose do hepatócito. (Imagens das colunas da esquerda, × 10; imagens das colunas da direita × 40)

Estudo Farmacocinético

O estudo farmacocinético foi realizado após injeção intravenosa de 10 mg / kg de PTX de Taxol® ou 20 mg / kg de PEG-PCCL / PTX (PP + PTX) (taxa de carga de 50%). O pico da concentração plasmática (Cmax) foi de 312 ± 2,59 μg / mL (PTX) e 283 ± 2,79 μg / Ml (PP + PTX). O tempo de concentração máxima (Tmax) e a área sob a curva de concentração plasmática-tempo foram 0,54 ± 0,20 h, 52,00 ± 4,30 μg h / mL e 4 ± 1,22 h, 282,21 ± 21,08 μg h / mL para PTX e PTX-NPs , respectivamente. A curva de concentração de sangue-tempo foi mostrada na Fig. 9.

A curva de concentração de sangue-tempo. Em camundongos, após administração intravenosa de PTX ou PP + PTX. ( n =6)

Efeito do PEG-PCCL / PTX em ratos com tumor

Para investigar o efeito antitumoral de PEG-PCCL / PTX in vivo, (i) a porcentagem aumentada de perímetro abdominal (IPAP) de camundongos portadores de tumor H22 foi calculada diariamente (Fig. 10a). No dia 3, a ascite começou a se formar e o IPAP de cada grupo aumentou dramaticamente, no qual o grupo PP / PTX e o grupo PTX, em comparação com o grupo NS, apresentaram aumento mais lento com o tempo. (ii) A ascite foi coletada no dia 10 e o volume foi medido (Fig. 10b). Em comparação com o grupo NS, o volume de ascite do grupo PTX e do grupo PP / PTX foi significativamente reduzido ( P =0,0005 e P =0,0052), onde o grupo PP / PTX exibiu um volume menor do que o grupo PTX ( P =0,0138). (iii) a sobrevivência de cada grupo foi observada por 20 dias a partir do dia 0. O grupo PP / PTX e o grupo PTX tiveram uma vida útil mais longa e uma taxa de sobrevivência mais alta do que o grupo NS.

O efeito antitumoral de PP / PTX em camundongos com tumor H22. a Camundongos Balb / C ( n =5) foram injetados intraperitonealmente com PP / PTX ou PTX no dia 3. b Ascites de cada grupo ( n =5) foram coletados no dia 10. c A sobrevivência de cada grupo ( n =10) foi observada diariamente. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001

Discussão

Muitos polímeros, incluindo PEI, têm sido sugeridos como transportadores de drogas químicas e biofarmacêuticas para uma conjugação apropriada. O PEI é um polímero catiônico amplamente investigado e tem sido considerado o padrão ouro em ensaios relacionados à eficiência de transfecção [29]. No entanto, os efeitos colaterais (por exemplo, citotoxicidade) impedem a aplicação de PEI em uso médico. Para pesquisar um material baseado em nano mais seguro e eficaz, preparamos com sucesso um novo candidato para administração de drogas; PEG-PCCL é caracterizado por alta hidrofilicidade e estabilidade favorável devido ao efeito da ligação de hidrogênio. O objetivo principal do estudo foi avaliar a toxicidade in vivo e in vitro do PEG-PCCL, o que abre uma janela potencialmente terapêutica para o tratamento do câncer.

Uma vez que a permeabilidade aumentada e o efeito de retenção são considerados como mecanismos de entrega seletivos para o tumor, as drogas de tamanho nanométrico têm recebido atenção considerável [30, 31]. As nanopartículas com diâmetro menor têm melhor imunocompatibilidade [32] e menor absorção pelo fígado, maior tempo de circulação sanguínea e maior biodisponibilidade [33]. Nossos dipolímeros são de tamanhos apropriados (97 ± 2,6 nm) (Fig. 2) para permear em e para fora do vaso sanguíneo do tumor, bem como evadir o sistema imunológico do hospedeiro, enquanto os polímeros catiônicos com o potencial zeta positivo foram relatados como tóxicos [34]. Essa toxicidade de PEG-PCCL com potencial zeta negativo deveria ser evitada de maneira ideal. De fato, nas avaliações de toxicidade no presente estudo, houve pouca preocupação com a toxicidade do PEG-PCCL. Resultados semelhantes também foram relatados por outro laboratório [35,36,37].

Os experimentos in vitro revelaram uma propriedade livre de toxicidade para PEG-PCCL. Conforme observado em MEV (Fig. 4), (i) vesículas pinocitóticas reconhecidas por seta escura indicaram uma endocitose responsável [38]. (ii) Núcleo completo e organelas intactas (Mt, RER e Go) mostraram pouca citotoxicidade e boa biocompatibilidade de PEG-PCCL em nível celular. No ensaio de MTT e ensaio de vazamento de LDH (Fig. 3), PEI e PEG-PCCL levaram a uma tendência semelhante de viabilidade celular de uma forma dependente da dose e do tempo em células 293 T e células HepG2 embora, PEG-PCCL exibiu menor citotoxicidade, especialmente em uma concentração mais elevada ( P <0,05). Esses resultados sugerem que a ligação covalente de carboxila não aumenta a toxicidade extra. A hemólise in vitro é amplamente aceita como um método útil e confiável para avaliar a compatibilidade sanguínea com NP. No teste de hemólise in vitro, o PEG-PCCL mostrou menor taxa de hemólise do que a solução salina normal (Fig. 6a). Isso pode ser devido ao potencial negativo do PEG-PCCL que protege as células sanguíneas. O teste de hemólise in vivo revelou tendência semelhante. Em contraste, PEI exibiu hemólise grave. Coletivamente, as nanopartículas de PEG-PCCL são hemocompatíveis, uma vez que não exibiram qualquer efeito hemolítico nem no modelo in vitro nem no modelo in vivo (Fig. 6b).

A natureza inócua do PEG-PCCL foi ainda comprovada por experimentos in vivo. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ O ₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.

Nanoestruturas de ouro em crescimento para absorção celular seletiva de forma Funções duplas do dispositivo V / SiOx / AlOy / p ++ Si como seletor e memória