Influência dos nanotubos de carbono e seus derivados nas células tumorais in vitro e parâmetros bioquímicos, composição do sangue celular in vivo

Resumo

O objetivo do trabalho proposto foi analisar a toxicidade de nanotubos de carbono oxidados (CNTox), funcionalizados por doxorrubicina (CNT-Dox) e fluoresceína (CNT-FITC) em nível celular e orgânico. O efeito citotóxico de CNTox, CNT-Dox e CNT-FITC foi analisado em células tumorais in vitro (culturas 2-D, 3-D) e em modelos de camundongos Balb2 / c in vivo. Como resultado, foi demonstrada a possibilidade de imobilização da doxorrubicina na superfície do CNT e liberação controlada da doxorrubicina (Dox) da superfície do CNT. A imobilização de Dox coincidente com a diminuição do efeito citotóxico CNT-Dox em comparação com Dox livre. A quebra das ligações peptídicas com a superfície do CNT levou à liberação de doxorrubicina e ao aumento dependente da dose do efeito citotóxico dos CNTs e Dox. O efeito citotóxico combinado de CNTs, Dox e tripsina na sobrevivência de células tumorais foi mostrado. Ao nível do organismo, foi investigado o efeito das nanoestruturas obtidas sobre o estado do sistema enzimático hepático, o metabolismo das proteínas e a composição das células sanguíneas dos animais experimentais. O modelo in vivo de influência de CNTox foi estatisticamente igual ao de controle. O CNT-Dox demonstrou menor efeito tóxico para o organismo total em comparação com a doxorrubicina pura. Desvios na composição do sangue celular indicaram um efeito tóxico geral do CNT-Dox, mas foi mais moderado em comparação com a doxorrubicina pura. A partir dos dados obtidos, concluímos que a ligação dos CNTs com a doxorrubicina permite reduzir a toxicidade da doxorrubicina nos indicadores bioquímicos gerais do sangue e violações na composição das células sanguíneas in vivo. Ao mesmo tempo, o efeito combinado de CNTs e doxorrubicina após a liberação do medicamento nos permitiu alcançar maior eficácia na supressão do crescimento tumoral in vitro.

Histórico

Uma das aplicações mais marcantes e promissoras dos nanotubos de carbono é a medicina. Nanotubos de carbono (CNTs) são caracterizados por propriedades químicas e biológicas únicas [1,2,3,4,5]. Os CNTs têm uma grande área de superfície que lhes permite anexar uma ampla gama de substâncias biológicas [6]. Além disso, os CNTs são capazes de penetrar nas membranas celulares, capilares e se acumular nas células e tecidos [7,8,9]. Os CNTs são absorvidos pelas células facilmente e promove a capacidade dos CNTs de atingir os núcleos das células e implica na possibilidade de terapia gênica [10]. É por isso que os CNTs são veículos atraentes para o transporte de proteínas, antígenos, vetores de RNA / DNA [11], vacinas e drogas para as células [12]. Particular interesse está nas perspectivas de uso de CNTs como carreador personalizado com liberação controlada de drogas para terapia anticâncer [13], antibacteriana [14] e imunológica [15]. A entrega direcionada e a liberação controlada é o problema real do uso moderno de drogas, especialmente com propriedades citotóxicas. O mecanismo exato de liberação do fármaco garante uma concentração efetiva da substância ativa no tecido-alvo com uma concentração mínima nos demais. Isso reduziria a dose do medicamento, mantendo sua eficácia e diminuindo os danos dos efeitos colaterais. Atualmente, existem várias formas de entrega intencional de drogas, como a entrega usando lipossomas [16], micelas poliméricas e dendrímeros [17], partículas biodegradáveis [18] e outras nanopartículas [19]. Mas experimentos recentes demonstraram muitos benefícios do uso de CNTs na entrega de drogas em comparação com outras nanopartículas [20, 21]. Um deles é aquele CNTs com superfície bastante grande e ativa que pode ser preenchido com a substância química desejada, variando de pequenas moléculas a proteínas, anticorpos e RNA / DNA. As extremidades abertas dos CNTs tornam o volume interno e a superfície acessíveis para funcionalização. Portanto, a grande área de superfície dos CNTs fornece muitos locais de ligação para diferentes tipos de funcionalização. Ao mesmo tempo, com as perspectivas dos CNTs, existem alguns problemas com a baixa solubilidade dos CNTs, capacidade de agregação, qualidades hidrofílicas, meia-vida longa e influência em todo o organismo [22]. De acordo com a literatura, a introdução de CNTs no corpo de animais experimentais é acompanhada de acúmulo de CNT e seus derivados nos órgãos do trato digestivo, baço, rins [23], músculos [24] e tecido pulmonar [25] . Na etapa seguinte, os CNTs influenciam na atividade de processos metabólicos e inflamatórios [25, 26], no estado do sistema imunológico [27] e na sobrevivência de animais experimentais [28]. No entanto, esses problemas são objeto de pesquisas ativas para um maior avanço no uso de nanotubos de carbono. As vantagens dos CNTs como nanovetores para distribuição de drogas foram demonstradas de forma convincente em vários estudos. Autores de [29, 30] relataram que nanotubos específicos podem ser menos prejudiciais do que nano-portadores de drogas. Também foi demonstrado que a funcionalização simples (-OH, -COOH, -NH, PEG) [31] ou encapsulamento dos CNTs [22], aumenta a solubilidade em água, melhora a biodisponibilidade e reduz a toxicidade dos CNTs. E a introdução de CNTs em camundongos com tumor transplantado pode ser eficaz contra o tecido transformado direcionado e levou à diminuição do volume do tumor e ao aumento da sobrevivência do animal [32].

Com base em investigações anteriores [33], assumimos que a substância antitumoral ativa (doxorrubicina) poderia ser imobilizada na superfície de ligações peptídicas de nanotubos de carbono. O composto resultante, nanotubos de carbono funcionalizados pela doxorrubicina (CNT-Dox), poderia reduzir as propriedades citotóxicas do CNT como a doxorrubicina (Dox). Ao mesmo tempo, a desintegração do construto tratado pode permitir a realização das propriedades citotóxicas CNT e Dox. Assim, é possível aumentar a atividade antitumoral de ambas as substâncias. Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar o efeito citotóxico do construto CNTs-Dox na presença de protease (tripsina) in vitro. Analisamos o impacto dos CNTs e seus derivados em células tumorais em modelos de células 2D e 3D, in vitro. O outro objetivo foi investigar a influência dos compostos obtidos (CNTs, CNTox e CNT-Dox) na atividade do sistema enzimático hepático, turnover de proteínas e na composição sanguínea celular in vivo. Assim, os autores realizaram uma estimativa complexa da toxicidade, biodisponibilidade e eficácia do uso dos NTCs e seus derivados contra tumores do trato gastrointestinal.

Métodos

A linha celular de carcinoma de adenocarcinoma de cólon caucasiano de grau II (HT29) foi usada como modelo de célula experimental em sistema 2D (monocamada) e 3D (esferóide) in vitro. A linha foi adquirida do Banco de linhas celulares e tecidos de animais Instituto Kavetsky de patologia experimental, oncologia e radiobiologia NAS Ucrânia. As células foram manipuladas em condições padrão de cultura de células (95% de umidade, 5% de CO ₂ no ar; 37 ° C) em meio DMEM completo com 10% de FBS sob o nível de contenção de laboratório 2.

Síntese, oxidação e funcionalização do CNT

Os nanotubos de carbono de paredes múltiplas iniciais (MWCNTs) foram obtidos por deposição química de vapor (propileno e hidrogênio com Mo / Fe / Al ₂ O ₃ como catalisador). MWCNTs sintetizados tinham 10–30 camadas, diâmetro interno 5–15 nm, diâmetro externo 10–60 nm, comprimento 20–500 μm, área de superfície específica 120 m ² / ge densidade aparente 5-50 g / l [33].

A purificação de MWCNTs do metal / catalisador foi realizada por tratamento de HF. A eliminação do carbono amorfo dos nanomateriais de carbono foi realizada por oxidação ao ar a 450–500 ° C. A amostra bruta contendo MWCNTs reagiu com o oxigênio do ar e criou dióxido de carbono ou monóxido de carbono. Alguma quantidade de depósito de carbono foi obtida após a dissolução de HF (aqua) do suporte do catalisador ter sido oxidada no ar a 450–500 ° C. Um reator tubular de quartzo com fluxo de ar foi usado para este procedimento por 130-150 min. Analisamos e descrevemos as características físicas e químicas dos MWCNTs obtidos em trabalho anterior [33].

A espectroscopia eletrônica de varredura (SEM) de MWCNTs (JEOL SL6060LA, Japão) foi usada para determinar as características estruturais dos MWCNTs. Após a imobilização dos ligantes, a morfologia não foi alterada.

Oxidação de MWCNTs

Na próxima etapa, os nanotubos de carbono purificados (CNTs) foram oxidados em HNO 70% ₃ a 99 ° C por 4 h e depois lavado com água destilada e NH 10% ₄ Solução OH por 12 h. Como resultado, os óxidos de nanomateriais de carbono MWCNTox (CNTox) foram sintetizados. Depois disso, os CNTs foram lavados três vezes com dH ₂ O para pH neutro. Os sítios ácidos na superfície do CNT foram regenerados com solução de HCl 0,1 M. Os CNTs-ox oxidados resultantes foram separados por centrifugação, enxaguados extensivamente e ressuspensos em dH ₂ Ó água.

Preparação de Partículas CNT-Dox

A tarefa da próxima etapa foi imobilizar o cloridrato de Dox (Dox, Teva Nederland B.V, Holanda) na superfície das partículas de MWCNTs. Para funcionalizar as superfícies dos CNTs oxidados (200 mg) por amino contendo Dox-lactose mono-hidratada, eles foram incubados com agente de ligação bifuncional - N-ciclohexil-N ′ - (2 morfolinoetil) carbodiimida meto-p-toluenossulfonato (C 1011, Sigma Aldrich , EUA) durante 15 min em temperatura ambiente (Fig. 1a). Depois disso, 100 mg de mono-hidrato de DOX-lactose foram adicionados a 10 ml de tampão de fosfato 0,15 M pH 6,5 a cada material de nanocarbono. A mistura foi deixada reagir a 30 ° C durante 24 h. Em tais condições, ligações covalentes entre Dox e CNTs foram formadas (Fig. 1b). A composição foi coletada por centrifugação a 10.000 rpm 15 min e lavada com dH ₂ O três vezes. Os sobrenadantes foram usados para detecção da concentração de DOX livre por espectrofotômetro. A imobilização de FITS na superfície de CNT foi fornecida pelo esquema mostrado na Fig. 2a, b.

a Esquema de reação dos CNTs com carbodiimida. b Esquema de funcionalização dos CNTs pela doxorrubicina

a Esquema de reação dos CNTs com a uréia. b Esquema de funcionalização dos CNTs por FITC

Preparação de suspensões estáveis de MWCNTs

A suspensão coloidal de MWCNTs foi realizada em duas etapas. No primeiro estágio, os nanomateriais de carbono foram submetidos a tratamento ultrassônico em tampão de fosfato salino (PBS) usando um dispersor ultrassônico UZDN — 2 T. Os modos de processamento foram I =10 mA, R =22 kHz, duração - 30 min. Na segunda etapa, o hidrossol resultante foi disperso por centrifugação à temperatura ambiente. O processo inclui vários ciclos de centrifugação. Assim, a fração SWCNTs de dissolução hidrofílica foi selecionada dessa forma. Antes de adicionar à suspensão as células cultivadas, as soluções de MWCNTs foram esterilizadas por ebulição durante 30 min. Derivados de CNTs (CNT-Dox e CNT-FITC) foram esterilizados por concentração de 100 vezes de PSGA (Penicilina:Estreptomicina:Gentamicina:Anfotericina).

Potencial Zeta de Suspensões de Nanotubos

O potencial zeta das amostras foi medido por espalhamento de luz eletroforética (M3-PALS). Para as medições, foi utilizado o analisador Zetasizer Nano ZS, fabricado pela Malvern Instruments (Malvern, Reino Unido). As experiências foram realizadas a 25 ° C com sete repetições. Para medir as amostras, um eletrodo submersível universal (Universal Dip Cell) ZEN1002 e cuvetes de poliestireno (DTS001), uma fonte de luz - um laser H-Ne 633 nm, foram usados.

Espectroscopia FTIR

A composição química dos nanomateriais obtidos foi investigada por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Os espectros de IV foram determinados pelo espectrômetro FTS 7000e Varian FTIR. As amostras para análise foram preparadas moendo em um moinho uma mistura de ~ 1 mg de CNTs e 150 mg de KBr espectralmente puro. As amostras foram preparadas usando uma prensa com uma força de pressão de 3,0-3,5 × 10 ³ kg / cm ² . As amostras foram desidratadas por aquecimento a uma temperatura de 600 ° C por 60 min. Os espectros pré-disparo de KBr foram obtidos preliminarmente, depois foram subtraídos dos espectros das amostras. Todos os espectros foram analisados de acordo com o catálogo de Identificação Espectrométrica de Compostos Orgânicos [34]. Para comparação, foram utilizadas amostras de MWCNTs oxidados (CNT-O), MWCNTs funcionalizados por doxorrubicina (CNT-D) e MWCNTs funcionalizados por marcador fluorescente (CNT-F). Todos os processos e condições, de amostras e concentração, foram iguais para os três materiais.

Ensaio colorimétrico de liberação de doxorrubicina da superfície de CNTs

Para avaliar a quantidade de Dox livre após a imobilização em CNMs e a eficácia da liberação de Dox, a capacidade de Dox livre de fluorescência em um comprimento de onda de 495 nm foi usada [35]. A concentração ativa de Dox em cloridrato de Dox foi de 16,7% w / w . Para o propósito de desenhar as linhas de calibração, Dox Teva 20 mg / ml com dez diluições para 8 × 10 ⁻³ mg / ml foi usado. Em seguida, a fluorescência de Dox livre foi medida no sobrenadante dos complexos DOX com CNTs por leitor de placa espectrofotométrica Multiscan (Labsystem, Finlândia).

Concentração de grupos funcionais em CNT-DOX, partículas CNT-FITC

Para imobilizações Dox, 1 g de MWCNTs em 1 ml dH ₂ O foi usado. A quantidade de Dox-TEVA foi de 100 mg (16,7 mg de Dox ativo) em 1 ml de dH ₂ O. A quantidade de Dox livre no sobrenadante após a reação foi de 0,37 mg ou 2,2% das substâncias ativas. Assim, concluímos que 16,23 mg de DOX foi imobilizado em 1 g de CNTox. Para FITC, a porcentagem de imobilização foi baixa. Em seguida, 8,35 mg de FITC foram imobilizados em 1 g de CNTox em 1 ml de dH ₂ O. A eficácia da funcionalização foi de 1,62% w / w para CNT-DOX e 0,84% w / w para CNT-FITC. Outros cálculos das concentrações de CNT-Dox e CNT-FITC são baseados nestes dados.

Ensaio citotóxico de derivados de CNT em modelos celulares 2-D e 3-D

A citotoxicidade de Dox, CNTs, CNT-FITC e CNT-Dox foi avaliada contra células tumorais HT29 usando ensaio de MTT. Teste de MTT baseado na conversão de sais de 3- [4,5-dimetltiazol-2] -2,5-difeniltetratetrazólio em cristais de formazan pelas enzimas oxidorredutase mitocondrial dependentes de NAD (P) H em células vivas. O protocolo foi descrito por T. Mosmann [36]. Em resumo, 1 × 10 ⁴ HT29 foram semeados em placas de 96 poços e cultivados em meio de cultura completo por 12 h. Em seguida, o meio de cultura atual foi substituído por meio de cultura contendo CNTox (amostra # 1), MWCNTs (amostra # 2), CNT-Dox (amostra # 3), Dox (amostra # 4) e CNT-FITC (amostra # 5) . As concentrações das amostras # 1, 2, 3, 5 foram de 12,5–25–50–100–200 μg / ml, a concentração de estoque da amostra # 4 foi de 20 μg / ml, concentração final de 1 a 10 μg / ml. As células foram cultivadas em meio completo e utilizadas como controle. Após 24 h de incubação, as células foram analisadas com MTT por ensaio colorimétrico. Para 100 μl de suspensão de células, adicionamos 20 μl de solução de MTT (5 mg / ml PBS, Sigma). Em seguida, as células foram incubadas com MTT durante 4 horas em condições padrão. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 1.500 g, durante 5 min, e o sobrenadante foi extraído. Ao todo, foram adicionados aos poços 10 μl de DMSO (Sigma) para diluição de cristais de MTT e 20 μl de glicina 25 mM. A absorvância da solução reagida foi medida a 540 nm no leitor de placas espectrofotométricas Multiscan (Labsystem, Finlândia).

Geração de esferóides tumorais multicelulares

Células HT29 esferóide tumoral multicelular (MTS) (cultura 3D) como sistema modelo de micrometástase tumoral foi cultivado por método bem estabelecido que foi descrito anteriormente [33]. Resumidamente, a suspensão de células foi contada usando azul Trypan e plantou um número igual de células (5 × 10 ⁴ células / ml). A cultura de células 3D foi mantida em meio DMEM (Sigma, EUA) com 10% de FBS (Sigma, EUA) em condições padrão (95% de umidade, 5% de CO ₂ ao ar, 37 ° C). A geração do MTS foi realizada por tecnologia desenvolvida em nosso laboratório. O cultivo das células tumorais foi mantido por 24 h em placas de 24 poços revestidas com ágar 1% em meio de cultura com 0,24% de carboximetilcelulose. Para investigar a dependência do tamanho e número de MTS na concentração e tipo de CNTs, MTS foi gerado na presença de várias concentrações de CNTs. Antes da geração de MTS para as culturas de células, a solução de CNTs em PBS foi adicionada em cultura até a concentração final, conforme descrito anteriormente para o ensaio de MTT. O cultivo posterior foi conduzido durante 48 h em uma rotação constante das placas no agitador orbital (80 rpm). No estágio seguinte, micro imagens foram tiradas pelo método de “campo escuro”. No geral, mais de 120 imagens foram feitas. Em seguida, o volume de todos os MTS, que estavam nos arquivos, foi calculado com o uso do programa Axio Vision Rel 4.7, Zeiss. Usamos a fórmula de Rolf Bjerkvig: V =0,4 ∙ a ∙ b ² , onde os tamanhos geométricos dos esferóides ( b < a ) [37]. A visualização dos resultados foi realizada em microscópio Stemy 2000C, Zeiss.

Análise do impacto dos CNTs no sistema enzimático hepático, renovação de proteínas e na composição do sangue celular in vivo

Os procedimentos envolvendo os animais e seus cuidados estavam em conformidade com a diretriz europeia 2010/63 EU, aprovada pelos Comitês de Ética em Experimentação Animal local (Protocolo №1 21.10.2016). Para analisar a influência das substâncias obtidas no estado geral da homeostase do organismo, foi realizada uma série de experimentos in vivo. Estudos in vivo camundongos da linha Balb / 2a foram usados. Camundongos machos e fêmeas eram iguais nos grupos, com idades entre 6–8 semanas, dez para cada grupo. Os camundongos foram alojados em gaiolas com topos de arame de aço e cama de sabugo de milho e mantidos em uma atmosfera controlada com 12/12 ciclo escuro / claro, temperatura de 22 ° C ± 3 ° C e umidade de 50-70%, com acesso livre para comida e água doce. Assim, formaram-se quatro grupos de camundongos. Grupo 1:animais intactos foram tratados com 200 μl de PBS, controle. Grupo 2:camundongos foram tratados com CNTox na dose de 1,5 mg / kg. Grupo 3:camundongos foram tratados com CNT-DOX na dose de 1,5 mg / kg. E no grupo 4, os camundongos foram tratados com doxorrubicina na dose de 20 mg / kg. Os camundongos receberam CNT parenteral em 200 μl de PBS, a cada 3 dias, durante 4 semanas. A doxorrubicina foi administrada por via intraperitoneal, uma vez a cada 3 dias, na concentração de 20 mg / kg de peso corporal.

Análise bioquímica do soro

Um mês depois, os ratos foram retirados do experimento. Amostras de sangue cardíaco foram coletadas imediatamente de animais mortos. O sangue foi retirado dos animais ao mesmo tempo das 10 às 11 da manhã. Para o plasma, o sangue foi incubado por 40 min a 37 ° C e então centrifugado (20 min, 2.000 rpm). Em seguida, os parâmetros bioquímicos, proteína total, albumina, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (ALP), foram determinados no plasma com kits de diagnóstico (Cormay, Varsóvia, Polônia). Os experimentos foram realizados por protocolos de laboratório unificados no analisador bioquímico semi-automático FP-901M (Labsystems, Finlândia). A composição do sangue celular foi determinada em um analisador hematológico Mindray BC-3000 Plus, China.

Análise estatística

Para análise estatística da cultura 3D, todos os agregados de células foram classificados em grupos de acordo com o tamanho de 1 × 10 ⁻⁴ mm ³ para 1 × 10 ⁻² mm ³ com etapa em 1 × 10 ⁻³ mm ³ . Em seguida, o número de MTS em cada grupo e a mediana do volume de MTS para cada grupo foram estimados. Todas as medidas foram repetidas três vezes. Para o ensaio de microestatística normalmente distribuídas variáveis aleatórias, usamos o coeficiente de Student para pequena população. O indicado p o valor era * р ≤ 0,05 ou ** р ≤ 0,01.

Resultados e discussão

Microscopia Eletrônica de Varredura de MWCNTs

De acordo com o protocolo [38], o diâmetro médio dos CNTs foi de 10–20 nm e a área de superfície específica determinada por dessorção de argônio foi de 200–400 m ² / g. Densidade aparente dentro de 20–40 g / dm ³ . Em particular, os aglomerados na forma de tubos emaranhados com dimensões de 20–500 μm são obtidos durante uma produção de CNT industrial aplicando o método CVD (Fig. 3).

Imagens SEM de CNTs, 1) escala de 0,5 μm; 2) escala 5 μm

Potencial Zeta de Suspensões de Nanotubos

CNTox e CNT indicam estabilidade significativa à agregação, que depende diretamente do valor do potencial zeta. O CNT-DOX possui potencial zeta menor que o CNTox e o CNT, e alta reprodutibilidade da medida, o que indica a homogeneidade das partículas (Tabela 1). Um pequeno valor do potencial zeta de CNT-FITC pode indicar tamanhos de partícula significativos ou suas pequenas concentrações, conforme indicado pela alta taxa de ruído na medição.

Espectroscopia FTIR de CNTs, CNT-Dox e CNT-FITC

As ligações entre CNTox e doxorrubicina (DOX) e fluoresceína (FITC) foram estimadas com base em dados espectrais de infravermelho, conforme demonstrado na Fig. 4.

Espectros infravermelhos de CNTox (CNT-O), CNT-DOX (CNT-D), CNT-FITC (CNT-F)

A presença de uma banda forte em υ =3311 cm ⁻¹ (CNT-O) e υ =3451 cm ⁻¹ (CNT-D) atribuído às flutuações de acoplamento CON-H, bem como à presença de uma banda forte em υ =1634 cm ⁻¹ (CNT-O) e υ =1631 cm ⁻¹ (CNT-D) atribuído às vibrações de ligação O-CNH, que indica claramente o tipo de ligação amida entre CNT e Dox. Além disso, IR mostrou a absorção de ligações C-H que está localizada em 2969-2834 cm ⁻¹ e uma banda larga em 1460-1407 cm ⁻¹ do fragmento C-O-H. Assim, podemos concluir que, como resultado das reações químicas, os CNTs foram funcionalizados com um fármaco antitumoral (doxorrubicina) e um marcador fluorescente (FITC).

Citotoxicidade de CNTs em diferentes estágios de funcionalização em modelos de crescimento de células em monocamada e esferóides

A próxima etapa foi determinar a citotoxicidade de CNTs oxidados (CNTox), CNTs funcionalizados com doxorrubicina (CNT-Dox) e marcador fluorescente (CNT-FITC). Os resultados do teste de MTT em cultura em monocamada de HT29 são mostrados na Fig. 5.

Viabilidade de células tumorais HT29 em cultura em monocamada após incubação durante 48 h com CNTs e seus derivados (CNT-Dox e CNT-FITC). Significância estatística:* р ≤ 0,05 ou ** р ≤ 0,01

Como resultado, foi demonstrado que CNTox, CNT-Dox e CNT-FITC têm um efeito citotóxico moderado em concentrações de 12,5 μg / ml (81%). O aumento da concentração de CNTox de 25 para 50 e 100 μg / ml levou à diminuição dependente da dose da viabilidade das células tumorais para 71,8-69,6-62,5% em comparação com o controle. Na concentração de CNTox de até 200 μg / ml, a viabilidade de HT29 diminuiu para 39,2%. Naquela época, o CNT-Dox em baixas concentrações (12,5–50 μg / ml) não mostrou citotoxicidade estatisticamente significativa, em comparação com o CNTox. Em altas concentrações (200 μg / ml), CTN-Dox teve ainda menos citotoxicidade do que CNTox (50%). Ao mesmo tempo, os CNTs, funcionalizados com fluoresceína, tiveram um efeito citotóxico relativamente maior nas células tumorais. Após a incubação com CNT-FITC na concentração de 25 μg / ml, a sobrevivência das células HT29 foi reduzida para 55% e de 100–200 μg / ml para 23 e 7%, respectivamente. Assim, nesse caso, os CNTs desempenharam o papel de substrato celular bastante inerte. Mais do que isso, os CNTs imobilizaram o Dox e reduziram a citotoxicidade do Dox. Em estudos anteriores [33], demonstramos que os nanotubos primários possuem qualidades hidrofóbicas, efeito citotóxico moderado e estimulam a formação de um grande número de agregados celulares. De acordo com a literatura [39], a carga superficial dos NTCs muda durante a oxidação. Os CNTs tornam-se mais hidrofílicos, o que leva à formação de agregados menores e aumenta o efeito citotóxico dos CNTs. Os dados que recebemos no estudo anterior confirmam essa tendência. CNTox reduziu a sobrevivência das células tumorais em pelo menos 60% em comparação com o controle, CNT-Dox em 45% e CNT-FITC em 97% (em 200 μg / ml). A explicação dos dados obtidos pode estar nos relatórios de outros autores que ligantes funcionais, na maioria dos casos, alteram o potencial zeta de superfície dos CNTs, estimulam a solubilidade dos CNTs e aumentam a penetração celular dos CNTs [40]. A capacidade dos CNTs de formar agregados após a oxidação e funcionalização diminui, enquanto a permeabilidade através da membrana celular aumenta e a reatividade das organelas celulares aumenta. Mais do que isso, o CNT-Dox, em altas concentrações, tem menor efeito citotóxico do que o CNTox. Ao mesmo tempo, de acordo com os dados obtidos, pode-se presumir que a ligação peptídica mantém a doxorrubicina na superfície do CNT. A ligação peptídica entre os CNTs e Dox é suficientemente estável em condições de cultura de células. Não se decompõe e toma a doxorrubicina na forma inativa. Ao mesmo tempo, o molecular de fluoresceína-sódio (C ₂₀ H ₁₂ O ₅ ), um ligante com o tamanho de 332,311 g / mol, dissocia-se facilmente da superfície dos CNTs e entra nas células. Em resultados, existem violações irreversíveis de estruturas de DNA, núcleos e mitocôndrias [41].

Para verificar a citotoxicidade dos CNTs e seus derivados e o impacto nas propriedades adesivas das células tumorais, foi analisada a área das colônias 2D de células HT29. Os resultados são apresentados na Fig. 6. Foi demonstrado que os CNTs e seus derivados têm influência na capacidade adesiva das células tumorais e na formação de colônias de células tumorais em cultura em monocamada. A incubação de células tumorais com CNTox (amostra # 1) em concentrações de 12,5, 50,0 e 200 μg / ml levou à diminuição dependente da dose de colônias de células 2D em 55,2%, 57,8% e 78,3% em conformidade, em comparação com o controle. Ao mesmo tempo, a amostra de CNT-Dox (amostra # 3) nas mesmas concentrações não causou tal efeito. A área de colônias 2D reduzida em 34,8%, 61,6% e 82,4%, respectivamente. O CNT-FITC (amostra # 5) demonstrou a maior influência nas células tumorais em cultura em monocamada. A área das colônias 2D após a incubação com CNT-FITC diminuiu em 59,8%, 85,2% e 89,8%, respectivamente. Deve-se notar que os resultados obtidos têm a mesma tendência do ensaio MTT. Mas os resultados da análise de MTT não mostraram um efeito citotóxico tão significativo. As discrepâncias resultantes podem ser o resultado de efeitos não citotóxicos de CNTs na colônia de células e, em parte, influência antiadesiva. Anteriormente, demonstramos que os CNTs têm menos capacidade citotóxica do que a anti-adesão. De acordo com nossos dados, os CNTs estimulam a migração de células tumorais para a fração de suspensão e a formação de esferóides tumorais multicelulares (MTS). A sensibilidade das células a agentes antitumorais em culturas em monocamada e esferóide é diferente. É por isso que na próxima etapa, investigamos a formação de MTS por células tumorais HT29 na presença de CNTox, CNT-Dox e CNT-FITC. As concentrações de CNTs foram as mesmas dos experimentos anteriores. Na Fig. 7, foi demonstrado que os CNTox (amostra # 1) são capazes de estimular a formação de MTS. O aumento da concentração de CNTox é acompanhado pelo aumento dependente da dose do volume médio de MTS. Na concentração CNTox de 12,5, 50, 200 μg / ml, o volume médio de MTS aumenta de 1,79 para 2,18 e 10,98 mm ³ ; é quase dez vezes. Os derivados de CNTs não causam esse efeito nas células tumorais. CNT-Dox (amostra # 3) estimula a formação de MTS em 2,83 vezes. Ao mesmo tempo, a incubação de cultura de células tumorais 3D com CNT-FITC (amostra # 5) leva a uma diminuição de 2,4 vezes do volume de MTS.

A área de colônias de células tumorais HT29 em cultura em monocamada que foi incubada com CNTox (# 1), CNT-Dox (# 3), CNT-FITC (# 5). Significância estatística:* р ≤ 0,05 ou ** р ≤ 0,01

A mediana do volume dos esferóides do tumor multicelular. Os MTS foram gerados na presença de CNTox (amostra # 1), CNT-Dox (amostra # 3), CNT-FITC (amostra # 5). Significância estatística:* р ≤ 0,05 ou ** р ≤ 0,01

Ressalta-se que, na maioria dos experimentos, o CNT-Dox não apresenta efeitos citotóxicos nas células tumorais, tanto em cultura 2D quanto em 3D, que poderiam ser comparados com o efeito de uma única doxorrubicina. The mechanism of cytotoxic action of doxorubicin is based on penetration into the cell nucleus and intercalation between nucleotide pairs, violation of replication and DNA repair, protein synthesis and, as a result, cell death. The cause of the reduction of cytotoxic effect of the CNT-Dox may be the binding of the doxorubicin with CNT surface through peptide bonds. It prevents Dox dissociation from CNT surface and Dox penetration into the cell and cellular organelles. This fact may let to deliver the compound to certain tissues without causing a negative effect on “non-target” objects.

In this case, the next step of the study was controlled release of doxorubicin. For peptide bonds breaking, we used the commonly known peptidase trypsin as the release agent. The effect of trypsin on the Dox release from the surface of the CNT was investigated by spectral analysis. Since the free doxorubicin has a fluorescence peak at 495 nm, bounded doxorubicin has no such ability. It was analyzed how the increasing of trypsin concentration affected on concentration of free doxorubicin. The results are shown in our previous work [42]. Shortly, it was demonstrated that increasing the concentration of 0.05% trypsin from 11 to 20% in culture medium contributed to an increasing the concentration of free doxorubicin from 3.13 to 6.55 μg/ml. A further increasing the concentration of trypsin to 60% did not lead to increasing in free doxorubicin. However, the concentration of trypsin by about 66% stimulated release again and led to increasing the concentration of doxorubicin in two times, to 11.38 μg/ml. Thus, it was concluded that 0.05% trypsin has several effective concentrations. Under these conditions, peptide bonds between doxorubicin and CNT were broken and doxorubicin was released. Therefore, to analyze how CNT-Dox influence the tumor cells after Dox release, we incubated tumor cells in the w/o fetal bovine serum (FBS) nutrient medium with trypsin and in the presence of CNT-Dox. The survival of tumor cells was determined using the MTT test. The ratio of the nutrient medium, trypsin, concentration of CNT-Dox, and doxorubicin are given in Table 2. The results of incubation HT29 during 48 h are demonstrated on Fig. 8. Cell viability in the presence of trypsin—blue columns, alone doxorubicin—orange columns, and CNT-Dox with trypsin—pink columns. In results, it has been found that the simultaneous use of trypsin and CNT-Dox significantly increased the cytotoxic effect of CNT and doxorubicin compared to the separately use of these substances. So doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decreasing the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control (Fig. 8, orange columns). Incubation of CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 t0 70% led to a dose-dependent decreasing in the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively (Fig. 8, pink columns). At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0% (Fig. 8, blue columns). Thus, we can conclude that we observe the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times.

Percentage of alive cells HT29 after 48 h of incubation in the presence of trypsin, doxorubicin, CNT-Dox. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01

As functional groups (Dox) were attached to CNTs surface by peptide bonds as, in vivo Dox release will be realized in organs of the gastrointestinal tract with an increased content of proteases, peptidases. In organism, proteases are used for various metabolic processes. Acid proteases secreted into the stomach (such as pepsin) and serine proteases present in duodenum (trypsin and chymotrypsin) enable us to digest the protein in food [43]. Other proteases are present in leukocytes (elastase, cathepsin G) and play several different roles in metabolic control. This is one of the fastest “switching on” and “switching off” regulatory mechanisms in the physiology of an organism. By complex cooperative action, the proteases may proceed as cascade reactions, which result in rapid and efficient amplification of an organism’s response to a physiological signal. Therefore, the authors suggest that CNT-Dox construction will be the most effective in the case of stomach, pancreas, liver, and small intestine cancer localization in case of parenteral administration of drug.

Influence of CNTs and Their Derivatives on Cell Blood Composition, Hepatic Enzyme System, and Proteins Turnover In Vivo

To determine the impact of the CNTox and CNT-Dox on the protein metabolism and the state of the hepatic enzyme system, the level of albumin (Al), total protein (Tp), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP) was determined. Data are given in Fig. 9a, b. As a result, it was noted that CNT-Dox and Dox have influence on the hepatic enzymes activity, namely on the AST and ALP. AST level increased in mice serum from 1 group for 21.6%, 2 group for 93.9%, and 3 group for 126.4% compared with control. At the same time, the activity of ALP increased in mice serum from 1 group for 23.5%, 2 group for 119.1%, and 3 group for 147.8%. CNTox administration did not show statistically significant changes in AST, ALT, and ALP levels. In addition, it should be noted that CNTox, Doxorubicin, and CNT-Dox slightly increased the level of total protein in the blood of experimental animals. So, we found that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox. To determine possible inflammatory processes and systemic effects of CNTox, CNT-Dox on the state of blood cells composition, it was analyzed the blood cell formula of the experimental animals. The results are shown in Table 3. Obtained data are in good agreement with the well-known manifestations of doxorubicin’s hematological toxicity:anemia (decreased red blood cells, hemoglobin, hematocrit), thrombopenia (platelet count), neutropenia (decrease in the number of granulocytes). Interestingly, that it was demonstrated the same direction of the changes of practically all hematological parameters in the 1 (CNTox), 2 (CNT-Dox), and 3 (Dox) groups of animals. However, the change in the 2 and 3 groups of animals was statistically significant accordingly to control and 1 group. In the 2 group (CNT-Dox), it was found pronounced decreasing of the monocyte content related to the system of phagocyte mononuclear cells and cell’s immune response (9.5% and 0.12 × 10⁹ /l in control, 4.6% and 0.06 × 10⁹ /l in 2 group, and 4.55 and 0.05 × 10⁹ /l in 3 group). Animals of 2 and 3 groups demonstrated reducing the content of granulocytes (neutrophils) (12.6 and 0.16 × 10⁹ /l in control and 8.5% and 0.2 × 10⁹ /l in 2 group and 8.05 and 0.16 × 10⁹ /l in 3 group). The number of lymphocytes, both in percentage and absolute, increased in 2 and 3 groups (77.9% and 0.97 × 10⁹ /l in control and 86.9% and 2.0 × 10⁹ /l in 2 group and 87.8% and 2.3 × 10⁹ /l in 3 group). The main function of the lymphocytes is recognition of the antigen and participation in the adequate immunological response of the body. T lymphocytes perform regulatory and effectors functions. B lymphocytes take part in humoral immunity, providing immunoglobulins in response to stimulation of other people’s antigens. So, it can be assumed that an increase in the index of lymphocyte content in experimental 1, 2, and 3 groups can be associated with the introduction of foreign antibodies (CNTs) and/or tissue distraction [44]. Some decrease in the absolute number of leukocytes in 2 (1.2 × 10⁹ /l) and 3 (0.85 × 10⁹ /l) groups compared with the 1 group of animals (2.0 × 10⁹ /l) can be regarded as the result of a gradual accumulation of the reversal of toxic effects of Dox. It is described the reaction of WBC in experimental animal groups as well-known toxic hematologic impact from doxorubicin in the development of leucopenia. The analysis of indicators reflecting the number and state of RBC (erythrocytes and hemoglobin) also showed the same trend of misbalance in the 2 and 3 groups of animals. Statistically significant thrombocytopenia and anemia are more indicative in animals of 2 and 3 groups:the number of erythrocytes (5.54 × 10¹² /l in control, 3.97 × 10¹² /l in 2 group, and 3.12 × 10¹² /l in 3 group), the amount of hemoglobin (78 g/dl for intact animals, 55.5 g/dl for 2 group, and 46.2 g/dl for 3 group), hemoglobin (25.25% for intact animals and 16.75% for 2 group and 15.12% for 3 group). The amount of erythrocytes decreased but the average content of hemoglobin in one erythrocyte did not decrease. And, as a result, concentration of hemoglobin per one erythrocyte increased. Analysis of the RBW counts let us suggest that in 2 and 3 group of animals, there are several processes:decreasing the formation of erythrocytes in the bone marrow, the acceleration of erythrocyte destruction, the violation of the structure of membranes of red blood cells, and molecular defects (oxidation) of hemoglobin. Thrombocytopenia (27 × 10⁹ /l in intact animals, 14.0 × 10⁹ /l in 2 group, and 12.05 × 10⁹ /l in 3 group), a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia and granulocytopenia (neutropenia) are the predominant manifestations of doxorubicin hematologic toxicity and is the most common acute dose-limiting toxicity of this drug. The direction of changes in the platelet content in the blood of experimental animals treated with CNTox and CNT-Dox is the same; however, significantly more pronounced in the group of animals receiving free Dox.

Monitoring of clinical parameters following CNTox (1 group), CNT-DOX (2 group), free DOX (3 group) administration in Balb/2a mice. Mice were treated by CNTox, CNT-DOX, DOX every 3 days during 4 weeks, in concentrations:CNT—1.5 g/kg and Dox—20 mg/kg of weight. Each experiment was done in triplicate. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01. ALT alanine transferase, AST aspartate transferase, AP alkaline phosphatase

Thus, according to our results from in vivo experiments, it was demonstrated that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile and protein turnover. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. More than that, dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia) was shown for the group of animals receiving free Dox. This predominant manifestation of hematologic toxicity was less pronounced in the group of animals receiving free CNT-Dox and CNTs. So, we can assume that, in the case of parenteral administration of CNT-Dox under action of gastric juice peptidases, CNT-Dox particles breaks up into free CNT and Doxorubicin. After that, Doxorubicin enters to the stomach cells and partly in the bloodstream. That also causes the specified effect on blood cells composition. For modeling Dox release in vivo, trypsin were used in vitro.

One of the goals of this investigation was to minimize the side effects of carbon vehicle on the body. Previously, the authors demonstrated that CNTs may be a potential threat to tumor development due to its ability to stimulate cell migration and support cells in suspension fraction [33]. In this case, CNTs themselves play a role of artificial extra cellular matrix. Another way CNTs can stimulate suspension cells to aggregation. If this process will be coincident with antitumor drug accumulation on CNTs surface, CNTs will attract substrate-independent cells and kill them. Simultaneously, it was found that pure CNTs did not have statistically significant cytotoxicity to tumor cells. So, CNTs alone are not dangerous as cytotoxic agents and can act as carrier for antitumor drugs to target cells. Then, studies were conducted to the functionalization of the CNTs by antitumor antibodies. It was demonstrated that CNTs are able to carry on the surface not only the Dox but also specific tumor antibodies—anti EGFr [42]. Under the action of trypsin, Dox was released and realized strong cytotoxic effect on tumor cells. Recent studies have shown the synergy cytotoxic effect of CNTs and Doxorubicin after release from CNT-Dox construct in the presence of trypsin. Such effect was not demonstrated by CNTs and Dox separately. Therefore, the benefits from the use of CNTs seems in the usage CNTs as vehicle for antitumor antibody and drug. On the other hand, the negative effects of Doxorubicin, like many other early antitumor drugs, are totally cytotoxic effects. Binding of the Dox to the CNTs partially blocks it. This effect allows ensuring local accumulation of the Dox in the focus of tumor activity with subsequent release and action. Thus, greater efficacy can be achieved with a smaller dose of administration. This effect can be achieved only if there are tumor-specific antibodies on the surface of the CNTs. The possibility of creating such construct was demonstrated by the authors in previous work. Undoubtedly, that CNTs dissemination, accumulation, and Dox effective should be tested on mixed culture in vitro and on a tumor model in vivo. For this purpose, synthesized CNT-FITC was created and conducted. The ability of the CNTs to act as an extra-cellular matrix and the significance of this process for the “tumor-body” system should be tested on the animal model. The effectiveness of the drug will be investigated on the model of Ehrlich carcinoma and colon rectal carcinoma [44]. The distribution of CNTs in the tissues of the body will be investigated using the construct created by the CST-FITC, as was mentioned in this work. The accumulation of CNTs in the tissues of the organs of the gastrointestinal system, namely the stomach, liver, and intestines, will be analyzed by histological assay. These studies are already conducted by the authors.

According to Shang-Lin Wang [4] and our data, free doxorubicin causes similar side effects, but more pronounced than CNT-Dox. Other authors reported that toxicity effect of CNTs depends on way of administration, dose, and time of exposure and varies according to the size and type of the cells [45,46,47,48,49]. Settling of CNTs in the tissues of the liver, kidneys, and stomach with prolonged exposure can cause oxidative stress, DNA damages, compromise cell proliferation, necrosis of tissues, and chronic inflammation [50]. According to Manna [51], CNTs can cause oxidative stress and compromise cell proliferation. In the case of in vitro studies, the cytotoxicity of CNT highly depends on the degree of CNTs purification, functionalization, size, and surface charge [52,53,54,55]. According to our results and previous data, the obtained CNTs did not demonstrate a significant cytotoxic effect [33]. More than that, our data let us suggest that there is a combined cytotoxic effect of CNTs and DOX that occurs as in vitro. That is why we assumed that obtained CNTs can be used against tumor cells, in case of the target accumulation of CNTs/CNT-Dox in tumor tissue. However, mechanisms of the cytotoxic effect of CNTs are not completely clear. Some authors suggested that CNT particles activate NF-kappaB pathway depending on the dose and that the mechanism of activation was due to activation of stress-related kinases [51]. Other authors reported that CNTs have a direct pro-apoptotic effect in vitro in different cancer cell lines and tumor cells obtained from surgical specimens [56], CNTs able to modify fatty acids in cell membranes [57] or erythrocyte membrane damage [58]. For further investigation of accumulation CNTs in cells and tissue, we plan to use CNT-FITC composite.

Other unclear questions are as follows:what is the prolonged impact of CNTs/CNT-Dox on organism level and how does it stimulate accumulation CNTs/CNT-Dox in tumor tissue? To investigate the influence of chronical introduction of CNTs/CNT-Dox, long-time studies on model of transplanted or initiated tumors of various localizations will be realized. Other authors analyzed the distribution of nanotubes throughout the body of mice after pulmonary exposure [59]. In results, accumulation of MWCNTs was documented in several organs, including notably the white pulp of the spleen and the bone marrow. The CNTs usually deposit in the liver, spleen, or lungs after they have served their purpose from where they are expelled gradually out of the body through the renal excretion route [60]. Zhao and Liu reported that accumulation of CNTs in the body can lead to granulomatous inflammation or alveolar septal thickening. Zhuang Liu et al. reported that SWNT-PTX affords higher efficacy in suppressing tumor growth than clinical Taxol® in a murine 4T1 breast-cancer model, owing to prolonged blood circulation and tenfold higher tumor paclitaxel (PTX) uptake by SWNT delivery likely through enhanced permeability and retention [61]. Accumulation of CNTs in the target tissue can be enhanced by placing on the CNTs surface specific antibodies which over expressed by tumor cells. The possibility of using antibodies for the targeted delivery of nanostructured preparations has been described by many authors [62, 63].

Conclusion

In 2D culture CNTox concentration from 25 to 50 and 100 μg/ml led to dose-dependent decreasing the viability of tumor cells to 71.8–69.6–62.5% accordingly compared with control. At concentration of CNTox up to 200 μg/ml, the viability of HT29 decreased to 39.2%. At that time, CNT-Dox at concentrations 12.5–25–50 μg/ml did not show statistically significant cytotoxicity, compared with CNTox. At high concentrations (200 μg/ml), CTN-Dox had even less cytotoxicity than CNTox (50%). After incubation with CNT-FITC in concentration of 25 μg/ml, HT29 cell survival reduced to 55% and at 100–200 μg/ml to 23 and 7% respectively. In 3D culture, increasing of CNTox concentration is accompanied with dose-dependent increasing of median volume of MTS. At concentration CNTox from 12.5, 50, 200 μg/ml median volume of MTS increases from 1.79 to 2.18 and 10.98 mm³ . CNTs-Dox and CNT-FITC did not cause such effect on tumor cells. Doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decrease in the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control. Incubation CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 to 70% led to a dose-dependent decreasing the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively. At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0%. So, the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin was observed. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times. In vivo, systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage, thrombocytopenia, a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia). Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox.

So, the possibility of targeted delivery and controlled release of any highly toxic drug with the use of CNT depends on strategies of reducing toxicity of CNTs and realizing potential of CNTs and anti-tumor drugs “in right place in right time.” According to the data obtained by authors and literature, it is possible. Our data support the assumption that this approach allows to reduce toxicity of the doxorubicin on the general biochemical indicators of blood and violations in the blood cells composition. At the same time, doxorubicin releasing is realized under certain conditions. And combined effect of CNTs and doxorubicin let us achieve greater efficacy in suppressing tumor cell growth in vitro.