Inibidor de autofagia (LY294002) e 5-fluorouracil (5-FU) Nanolipossoma baseado em combinação para eficácia aprimorada contra carcinoma de células escamosas de esôfago

Resumo

Neste estudo, o nanolipossoma PEGuilado carregado com 5-fluorouracil (5-FU) e LY294002 (LY) foi preparado para ter como alvo o carcinoma de células escamosas do esôfago (ESCC). As partículas foram caracterizadas em termos de parâmetros físico-químicos e biológicos. A co-entrega de inibidor de autofagia e fármaco quimioterápico em um único transportador foi realizada com sucesso. Os dois componentes do nanolipossoma PEGuilado (FLNP) carregado com 5-FU e LY foram liberados de maneira controlada com o LY relativamente liberado mais rápido em comparação com o 5-FU. FLNP mostrou uma captação celular mediada por receptor que permitirá a liberação gradual da droga no ambiente ácido. A captação celular de nanopartículas (NP) foi posteriormente confirmada por análise FACS. A combinação de 5-FU e LY resultou em maior efeito citotóxico em comparação com os medicamentos individuais. Mais importante ainda, o FLNP exibiu um efeito anticâncer significativamente maior em células cancerosas em comparação com as combinações de coquetéis livres. A liberação mais rápida de LY do FLNP leva à inibição da autofagia, que melhora a sensibilidade das células cancerosas ao 5-FU, resultando em mais morte celular. De forma consistente, o FLNP induziu uma maior apoptose (~ 48%) das células cancerosas em comparação com qualquer outro grupo. A análise de Western blot mostrou claramente que 5-FU e LY aumentaram individualmente a expressão de caspase-3 e PARP, enquanto como esperado FLNP induziu uma expressão notável desses marcadores de proteína indicando o efeito anticâncer superior. Acreditamos que a liberação programada do inibidor da autofagia e do fármaco quimioterápico a partir de um único nanocarreador aumentará a perspectiva de terapia anticâncer no ESCC.

Histórico

O carcinoma espinocelular de esôfago (CCEE) é um dos tipos comuns de cânceres de esôfago que são mais prevalentes no Leste Asiático, como a China [1, 2]. A taxa de sobrevivência de 5 anos do ESCC é de cerca de 25%. A cirurgia é a principal opção de tratamento para o tratamento de ESCC; entretanto, acredita-se que a quimioterapia adjuvante terá grande impacto no tratamento do CCEE [3, 4]. Foi relatado que o tratamento quimioterápico baseado em um único regime de droga resultou em eficácia terapêutica pobre devido à heterogeneidade das células cancerosas [5]. As células cancerosas costumam ser resistentes a medicamentos anticâncer isolados e não são eficazes na natureza. A este respeito, uma combinação de dois ou mais medicamentos irá atuar de forma sinérgica, visando diferentes alvos celulares [6, 7]. Foi relatado que os inibidores da autofagia superam a resistência a múltiplas drogas (MDR) das células cancerosas. Quando as células têm nutrição e fator de crescimento limitados, a autofagia fornece a homeostase necessária ao ambiente do câncer e contribui para sua sobrevivência [8]. A autofagia também serve para proteger as células cancerosas dos agentes quimioterápicos. Neste estudo, selecionamos LY294002 (LY) como um inibidor de autofagia [9].

Vários estudos relataram que os inibidores da autofagia funcionam melhor quando combinados com um medicamento anticâncer. Neste estudo, selecionamos 5-fluorouracil (5-FU) como agente quimioterápico. O 5-FU tem sido indicado principalmente no tratamento de cânceres de células escamosas e usado em pacientes com câncer de mama e outros tipos de câncer [10]. 5-FU tem um átomo de flúor na posição C-5 do uracil no lugar do hidrogênio. O efeito anticâncer do 5-FU surge da regulação de várias moléculas, como Bax e Bcl-2, e induz a apoptose das células cancerosas [11, 12]. Apesar do potencial efeito citotóxico de 5-FU e LY, ambos os agentes sofrem de problemas de baixa solubilidade em água e estabilidade, o que resulta em meia-vida plasmática curta e efeitos tóxicos indesejáveis para as células normais [6]. Além disso, um simples coquetel de mistura de ambos os agentes anticâncer não induz um efeito sinérgico devido à liberação aleatória de drogas e distribuição descontrolada de drogas em vários tecidos [7]. Portanto, é extremamente importante administrar ambos os medicamentos anticâncer de maneira programada e muito controlada, o que aumentará sua eficácia terapêutica.

Nanopartículas têm sido amplamente investigadas como transportadores de entrega de drogas para aplicações direcionadas ao câncer [13]. O fármaco pouco solúvel poderia ser incorporado de forma estável nas nanopartículas e, assim, sua solubilidade e biodisponibilidade poderiam ser melhoradas. Dentre todos os carreadores, o lipossoma tem sido amplamente estudado por sua adequação para aplicações sistêmicas [14, 15]. Estudos anteriores demonstraram que muitas formulações lipossomais comerciais estão disponíveis, incluindo Doxil, Myocet, LipoPlatin e assim por diante. A circulação sistêmica do lipossoma poderia ser melhorada pela conjugação de superfície do polietileno (glicol) (PEG) como uma concha hidrofílica [16]. O tamanho nanométrico e a camada hidrofílica do PEG conferem a circulação sanguínea prolongada e reduzem as depurações plasmáticas mediadas pelo reticuloendotelial (RES). Além disso, o NP pode se acumular passivamente nos tecidos tumorais por meio do efeito de permeação e retenção (EPR) aprimoradas [17, 18]. Portanto, pode-se esperar que se o fármaco quimioterápico e o inibidor de autofagia pudessem ser incorporados no único carreador, teria um efeito anticâncer sinérgico no CCEE.

Até o momento, o objetivo principal do presente estudo foi administrar uma combinação de 5-FU e LY para tratar ESCC. Para este propósito, 5-FU e LY foram incorporados de forma estável no nanolipossoma PEGuilado. Esperava-se que a liberação precoce do inibidor da autofagia (LY) interromperia o mecanismo de proteção das células cancerosas e, posteriormente, o 5-FU atuaria de maneira mais forte nas células cancerosas. O lipossoma carregado com a droga foi caracterizado em termos de tamanho de partícula, forma e padrão de liberação. A absorção celular e o ensaio de viabilidade celular foram realizados em células cancerosas ESCC. Além disso, o ensaio de apoptose foi realizado por meio de coloração com anexina V / PI e coloração Hoechst 33382. Finalmente, o estudo de eficácia antitumoral foi realizado em modelo animal de xenoenxerto portador de células ESCC.

Métodos

Materiais

O 5-fluorouracil foi adquirido na Sigma-Aldrich, China. 2- (4-morfolinil) -8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona (LY294002, LY) foi adquirido de Beijing Huafeng United Technology Corporation, China. L-a-fosfatidilcolina (ovo / galinha) (EPC), disteroilfosfatidiletanolamina-polietilenoglicol (2000) (DSPE-PEG) e colesterol foram adquiridos em Avanti Polar Lipids, China. Todos os outros produtos químicos eram de grau reagente e usados para purificações adicionais.

Preparação de nanolipossomos carregados com droga dupla

EPC, DSPE-PEG e colesterol foram misturados em uma mistura de metanol-clorofórmio (proporção de 10:4:1 M (total de 10 mg)), e para esta mistura orgânica, 5-FU (1,5 mg) e LY (1,5 mg) foram adicionado. Os solventes orgânicos foram evaporados usando um evaporador rotativo (Buchi, EUA) a 60 ° C durante 1 h. O filme lipídico fino foi hidratado com o tampão PBS por 1 h e seguido por extrusão através de uma mini-extrusora através de uma membrana de policarbonato (200 nm). O nanolipossoma carregado com o fármaco foi filtrado através de um tubo Millipore com um MW de 3500. O lipossoma carregado com o fármaco foi recolhido da câmara superior e o fármaco não aprisionado foi determinado pelo método de HPLC. A carga de droga e o encapsulamento foram calculados usando as seguintes equações:
$$ \ mathrm {DL} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {Peso} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {carregado} \ \ mathrm {drug} / \ mathrm {weight} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {lipossoma} \ right) \ times 100 \% $$$$ \ mathrm {EE} \ \ left (\% \ right) =\ left (\ mathrm {Weight} \ \ mathrm { de} \ \ mathrm {carregado} \ \ mathrm {droga} / \ mathrm {peso} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {droga} \ \ mathrm {inicialmente} \ \ mathrm {adicionado} \ certo) \ vezes 100 \% $$

Análise do tamanho de partícula

O tamanho da partícula e a distribuição do tamanho das nanopartículas foram determinados pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, UK). O tamanho de partícula foi medido a 25 ° C após diluição apropriada com água destilada. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

Análise de morfologia

A morfologia do NP foi estudada pela primeira vez por microscopia eletrônica de transmissão (TEM; H-7600, Hitachi, Tóquio, Japão) em uma tensão de aceleração de 100 kV. As amostras foram carregadas em uma grade de cobre revestida com carbono e secas. A morfologia NP foi posteriormente observada em microscopia de força atômica (AFM). As amostras foram colocadas sobre uma superfície de mica.

Estudo de liberação in vitro

A liberação in vitro de 5-FU e LY de 5-FU e nanolipossoma PEGuilado carregado com LY (FLNP) foi estudada em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) a 37 ° C. A dispersão de NP (1 ml contendo 1 mg de cada droga em um carreador) foi colocada em uma membrana de diálise (MW ~ 3500) e ambas as extremidades foram seladas. A membrana de diálise foi colocada em um tubo com 30 ml de meio de liberação. O tubo contendo a membrana de diálise foi colocado em um banho de agitação e incubado no ponto de tempo de pré-requisito. Em pontos de tempo específicos, 100 μl da amostra foram retirados e substituídos por uma quantidade igual de tampão fresco. A quantidade de fármaco liberada no tampão foi estudada por meio do método HPLC. Um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (Hitachi, Tóquio, Japão) que consiste em amostrador automático L-2200 e detector de UV-Vis L-2420 foi usado. Uma coluna Inertsil C18 (150 mm × 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 μm; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., EUA) foi usada sob eluição isocrática da fase móvel a uma taxa de fluxo de 1,0 mL / min e uma temperatura de coluna de 25 ° C. Boa linearidade foi observada entre 0,025 e 2 μg / ml para ambas as drogas com um coeficiente de correlação ( r ² ) por volta de 0,9995. O LOD (μg / ml) para 5-FU e LY foram 0,020 e 0,050, respectivamente. O LOQ (μg / ml) para 5-FU e LY foi de 0,070 e 0,150, respectivamente.

Cultura de células

A linha celular de câncer de esôfago, EC 9706, foi cultivada em meio RPMI normal com 10% de FBS e 100 unidades / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina em 5% de CO ₂ e 95% de umidade atmosférica no umidificador.

Análise de captação celular

A captação celular de NP foi observada por microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). Para este propósito, NP carregado com rodamina B foi preparado e purificado por filtração em gel usando coluna Sephadex G-50 com tampão HEPES. As células foram semeadas em placas de 12 poços e incubadas durante a noite. As células foram então expostas com NP carregado com rodamina B (10 μg / ml) e incubadas por 2 h. As células foram lavadas com PBS três vezes e fixadas com 2% de paraformaldeído (PFA) e lavadas novamente com PBS. As células foram então coradas com DAPI como um agente de coloração nuclear. As células foram lavadas e observadas em microscópio de fluorescência (microscópio Nikon TE2000-E).

A captação celular foi posteriormente observada usando citômetro de fluxo. As células foram semeadas em placas de 12 poços e incubadas durante a noite. As células foram então expostas com NP carregado com rodamina B e incubadas por 1 h e 2 h, respectivamente. As células foram então extraídas e lavadas duas vezes com PBS. As células foram ressuspensas em tampão PBS e analisadas usando um classificador de células ativado por fluorescência Calibur equipado com software CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Ensaio de citotoxicidade

O potencial citotóxico de formulações individuais foi avaliado pelo ensaio de brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazoil) -2,5-difenil tetrazólio (MTT). Resumidamente, 1 × 10 ⁴ as células foram semeadas em uma placa de 96 poços e incubadas por 24 h. As células foram então expostas com diferentes concentrações de 5-FU, LY, 5-FU + LY e FLNP livres, respectivamente, e posteriormente incubadas por 24 h. Soluções de MTT foram preparadas (5 mg / ml), e 10 μl de solução de MTT foram adicionados a cada poço e incubados por 4 h. O cristal de formazan foi extraído pela adição de DMSO, e a absorvância foi estudada usando um leitor de microplaca (Synergy ™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (a 570 nm).

Ensaio de apoptose

A apoptose da célula cancerosa foi determinada pelo protocolo de coloração com Anexina-V / PI (BD Biosciences, EUA). Resumidamente, EC 9706 foi semeado em uma placa de 12 poços e incubado por 24 h. As células foram incubadas com 5-FU, LY, 5-FU + LY e FLNP livres, respectivamente, e posteriormente incubadas por 24 h (1 μg de concentração de droga equivalente). As células foram extraídas e coradas com anexina V-FITC e PI por 15 min em temperatura ambiente e então enumeradas por meio de análise de citometria de fluxo usando um software FACS CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Ensaio Hoechst 33342

A apoptose da célula cancerosa foi ainda determinada pelo protocolo de coloração Hoechst 33342. Resumidamente, EC 9706 foi semeado em uma placa de 12 poços e incubado por 24 h. As células foram incubadas com 5-FU, LY, 5-FU + LY e FLNP livres, respectivamente, e posteriormente incubadas por 24 h (1 μg de concentração de droga equivalente). As células foram fixadas com PFA a 2% e incubadas com Hoechst 33342 (1 μg / ml) por 15 min. A apoptose celular foi então observada sob um microscópio de fluorescência.

Western Blotting

As células EC 9706 foram semeadas e tratadas com 5-FU, LY, 5-FU + LY e FLNP livres, respectivamente, e posteriormente incubadas por 24 h. As células foram então lisadas e o sobrenadante foi submetido a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferido para membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e subsequentemente incubadas com os anticorpos primários específicos durante a noite a 4 ° C. Após incubação com o conjugado de anticorpo secundário com peroxidase de rábano, as manchas foram reveladas usando o sistema ECL (AbClon) para detecção de sinal. Os filmes foram desenvolvidos usando um processador Kodak M35-A X-OMAT.

Inibição do crescimento do tumor in vivo

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais, Hospital Popular de Subei da província de Jiangsu, China. Camundongos nus fêmeas de 6 semanas de idade foram inoculados com 1 × 10 ⁶ Células OE-19 no flanco direito dos camundongos em 100 μl de mídia. Os tumores foram autorizados a crescer até 80 mm ³ (dia 10). O animal foi dividido em cinco grupos com seis camundongos em cada grupo. Os camundongos foram injetados com as respectivas formulações a uma dose fixa de 5 mg / kg e administradas três vezes durante os primeiros 10 dias do experimento. O tamanho do tumor foi medido em termos de volume do tumor usando compassos de calibre vernier e o tamanho estimado usando a fórmula; Volume =(largura ² × comprimento) / 2.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A significância estatística foi determinada usando t teste e análise de variância (ANOVA). P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados e discussão

As células cancerosas costumam ser resistentes a medicamentos anticâncer isolados e não são eficazes na natureza. A este respeito, uma combinação de dois ou mais fármacos irá atuar de forma sinérgica, alvejando diferentes alvos celulares. Foi relatado que os inibidores da autofagia superam a resistência a múltiplas drogas (MDR) das células cancerosas. Vários estudos relataram que os inibidores da autofagia funcionam melhor quando combinados com um medicamento anticâncer. Neste estudo, selecionamos 5-fluorouracil (5-FU) como agente quimioterápico e LY294002 (LY) como inibidor de autofagia. A fim de abordar as questões de solubilidade e estabilidade de drogas livres que por sua vez resultam em meia-vida plasmática curta e efeito tóxico indesejável, incorporamos de forma estável 5-FU e LY no nanolipossoma PEGuilado (Fig. 1).

Preparação e caracterização de nanolipossomas carregados com 5-FU e LY

O lipossoma carregado com dupla droga foi preparado pelo método de hidratação de película fina. O tamanho médio das partículas do lipossoma em branco foi de ~ 110 nm com um excelente índice de dispersão. O tamanho de partícula do lipossoma carregado com droga dupla (FLNP) aumentou para ~ 150 nm com um bom índice de polidispersidade (PDI ~ 150) (Fig. 2a). O aumento no tamanho das partículas foi atribuído principalmente à incorporação de drogas hidrofóbicas no lipossoma. Foi relatado que o tamanho de partícula em torno de 200 nm aumentará o acúmulo de droga nos tecidos tumorais em virtude do efeito de permeação e retenção (EPR) aprimorado. O lipossoma carregado com a droga exibiu uma capacidade de armazenamento de longo prazo atribuída à presença de PEG em sua superfície que contribuiu para o efeito anti-incrustante. Além disso, o FLNP exibiu uma carga superficial média de ~ 25 mV, indicando sua estabilidade coloidal. A carga superficial negativa evitará quaisquer interações nas circulações sistêmicas.

A morfologia do FLNP foi observada pela primeira vez usando TEM (Fig. 2b). Como visto, as partículas tinham formato esférico típico e estavam uniformemente dispersas na grade de cobre. Uma leve concha acinzentada na circunferência foi atribuída à presença de PEG em sua superfície. O tamanho de partícula observado do TEM foi ligeiramente menor em comparação com o do DLS. O tamanho de partícula do TEM era de ~ 130 nm em comparação com ~ 150 nm do DLS. A diferença no tamanho das partículas de duas técnicas pode ser atribuída ao estado de medição. O TEM mede a partícula em condições secas, enquanto o DLS mede a partícula em condições hidratadas e o alongamento da cadeia PEG. A morfologia da partícula foi posteriormente confirmada por AFM (Fig. 2c). As partículas eram circulares e se apresentavam como um objeto achatado na superfície da mica.

Carregamento de drogas e liberação in vitro de drogas

FLNP mostrou uma alta eficiência de aprisionamento para ambas as drogas (92,5% para 5-FU e 86% para LY) com uma carga de droga ativa de cerca de ~ 16% w / w . O comportamento de liberação in vitro de 5-FU e LY do FLNP foi observado em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). Os dois componentes do FLNP são liberados de forma controlada em condições de pH 7,4. Por exemplo, ~ 30% de 5-FU e ~ 40% de LY liberado do lipossoma ao final de 24 h. A liberação das drogas continuou até 90 h com ~ 60% do 5-FU e ~ 75% do LV liberado (Fig. 3). Deve-se notar que a taxa de liberação diminuiu significativamente após 24 h até 90 h, indicando a difusão lenta de drogas do sistema NP. Tal liberação controlada da droga seria benéfica para as aplicações direcionadas ao câncer. Além disso, uma liberação lenta da droga em condições neutras indica menos efeitos colaterais para os tecidos normais. É importante notar que o LY foi liberado relativamente mais rápido em comparação com o do 5-FU. Será uma situação benéfica, pois o LY tornaria as células cancerosas mais sensíveis ao 5-FU, resultando em um efeito citotóxico intensificado nos tecidos tumorais.

Estudo de internalização celular

Microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) foi realizada para determinar o padrão subcelular de FLNP. A rodamina B foi usada como uma sonda fluorescente para rastrear a captação intracelular dos NPs no ESCC. Como visto (Fig. 4), um forte sinal de fluorescência vermelha foi observado no citoplasma celular na circunferência do núcleo, indicando a captação celular mediada por endocitose típica. A captação celular mediada por receptor permitirá a liberação gradual da droga no ambiente ácido. O nanosize da partícula permitiu a fácil internalização do sistema NP. Os resultados mostraram claramente que a droga entrou nas células cancerosas por meio de uma via específica, em vez da simples difusão. A captação celular foi posteriormente monitorada por FACS. Como visto, notavelmente a captação de NP foi observada após 1 h de incubação e a captação celular aumentou com o aumento do tempo de incubação (2 h). A maior captação celular de NP aumentará a concentração intracelular de drogas anticâncer encapsuladas, o que aumentará ainda mais a eficácia terapêutica no ESCC.

Efeito anticâncer In Vitro

O efeito citotóxico de formulações individuais foi estudado pelo ensaio MTT (Fig. 5). Como mostrado, drogas livres, bem como NP combinacional exibiram um efeito citotóxico dependente da concentração típico em ESCC. O 5-FU exibiu um efeito anticâncer relativamente maior em comparação com o de LY nas células cancerosas. A combinação de 5-FU e LY resultou em maior efeito citotóxico em comparação com os medicamentos individuais. Mais importante ainda, o FLNP exibiu um efeito anticâncer significativamente maior em células cancerosas em comparação com as combinações de coquetéis livres. O valor IC50 de 5-FU, LY, 5-FU + LY e FLNP foram situados em 2,68 μg / ml, 5,98 μg / ml, 1,54 μg / ml e 0,58 μg / ml, respectivamente. Isso pode ser atribuído ao fato de que o LY pode inibir a autofagia nas células cancerosas e torná-lo mais responsivo ao 5-FU. Deve-se observar que o FLNP foi mais eficaz do que as combinações de coquetéis gratuitos devido a uma liberação mais programada dos medicamentos de maneira controlada. A liberação mais rápida de LY do FLNP leva à inibição da autofagia que melhora a sensibilidade das células cancerosas em relação ao 5-FU, resultando em mais morte celular [19]. Foi relatado que o 5-FU após entrar nas células cancerosas foi convertido em trifosfato de fluorouridina (FUTP) via monofosfato de fluorouridina (FUMP) ou metabolizado em trifosfato de fluorodeoxiuridina (FdUTP) por duas vias diferentes. O FdUTP atua como um substrato para a timidilato sintase (TS) e bloqueia a síntese de nucleotídeos. O metabólito 5-FU liga-se ao sítio de ligação de nucleotídeos do TS e inibe a síntese de nucleotídeos. Este ciclo leva à depleção de trifosfato de desoxitimidina (dTTP) que irá prevenir a síntese de DNA e resulta em morte aumentada de células cancerosas [20, 21].

Ensaio de apoptose

O efeito de apoptose da formulação foi avaliado pelo método de coloração com Anexina-V / PI (Fig. 6a, b). Isso permitirá determinar o efeito de apoptose do indivíduo, bem como do sistema de combinação de drogas. Consistente com o ensaio de MTT, 5-FU (~ 20%) resultou em maior apoptose de células cancerosas em comparação com LY (~ 12%), enquanto a combinação 5-FU + LY induziu maior morte celular por apoptose (~ 30%). Em comparação com qualquer outro grupo, o FLNP induziu uma maior apoptose (~ 48%) das células cancerosas, sugerindo que a captação celular mediada por receptor aumentou muito a concentração intracelular de drogas anticâncer que resultou em maior efeito terapêutico. Uma razão importante para o maior efeito anticâncer do FLNP foi atribuída principalmente à liberação sequencial de drogas encapsuladas em que LY sensibilizará as células tumorais e 5-FU irá induzir seus potentes efeitos citotóxicos. As terapias anticâncer funcionam induzindo a apoptose nas células cancerosas sem danificar as células normais circundantes. A apreciável atividade apoptótica do FLNP foi atribuída principalmente ao maior acúmulo de nanopartículas nas células por meio da captação de endocitose e da liberação sequencial de drogas no ambiente intracelular que resultou em um efeito terapêutico sinérgico. Esperava-se que uma liberação precoce do inibidor da autofagia (LY) interromperia o mecanismo de proteção das células cancerosas e, posteriormente, o 5-FU atuaria de maneira mais forte nas células cancerosas.

Análise de Western Blot

O mecanismo de ação das formulações é determinado por análise de Western blot (Fig. 7). A expressão dos níveis de proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptose após a exposição às respectivas formulações é apresentada na Fig. 8. p53 é um importante regulador do ciclo celular, e sua regulação negativa está associada com o aumento da sobrevivência das células cancerosas. Pode-se observar que as formulações regulam negativamente os níveis de expressão de p53, indicando o efeito notável nas células ESCC. Foi relatado que o dano ao DNA resulta na ativação da cascata de caspases que resulta na clivagem de PARP-1, que é considerada uma marca registrada da apoptose celular [22, 23]. Nossos resultados mostraram claramente que 5-FU e LY aumentaram individualmente a expressão de caspase-3 e PARP, enquanto como esperado FLNP induziu uma expressão notável desses marcadores de proteína indicando o efeito anticâncer superior. De forma consistente, o FLNP regulou negativamente a expressão da proteína antiapoptótica (Bcl-2), indicando sua eficiência para melhorar a eficácia terapêutica em ESCC.

Análise de inibição de crescimento de tumor in vivo

Os camundongos foram injetados com as respectivas formulações em camundongos, e o volume do tumor foi anotado até 20 dias. Como visto (Fig. 8), o grupo de controle mostrou um aumento constante no volume do tumor em todos os momentos até o dia 18. Em comparação com o controle, as drogas livres controlaram o crescimento do tumor; no entanto, não foi satisfatório. O coquetel de mistura de dois medicamentos foi relativamente mais eficaz do que os medicamentos individuais no controle do volume do tumor. É importante ressaltar que o FLNP mostrou-se significativamente ( p <0,05; p <0,0001) maior eficácia antitumoral em comparação com qualquer outro grupo. O volume final do tumor foi de aproximadamente 500 mm ³ em comparação com ~ 1400 mm ³ para ratos não tratados. O efeito antitumoral significativamente maior no modelo de tumor foi atribuído ao tamanho nanométrico da partícula que pode ser acumulada nos tecidos do tumor devido ao efeito de permeação e retenção aumentados. A liberação controlada de drogas nos tecidos tumorais também contribuiu para sua maior eficácia [24].

Conclusões

Em conclusão, o nanolipossoma PEGuilado carregado com 5-fluorouracil (5-FU) e LY294002 (LY) foi preparado com sucesso para o carcinoma espinocelular do esôfago (CCEE). FLNP mostrou uma captação celular mediada por receptor que permitirá a liberação gradual da droga no ambiente ácido. A combinação de 5-FU e LY resultou em maior efeito citotóxico em comparação com os medicamentos individuais. Mais importante ainda, o FLNP exibiu um efeito anticâncer significativamente maior em células cancerosas em comparação com as combinações de coquetéis livres. A liberação mais rápida de LY do FLNP leva à inibição da autofagia, que melhora a sensibilidade das células cancerosas ao 5-FU, resultando em mais morte celular. De forma consistente, o FLNP induziu uma maior apoptose (~ 48%) das células cancerosas em comparação com qualquer outro grupo. A análise de Western blot mostrou claramente que 5-FU e LY aumentaram individualmente a expressão de caspase-3 e PARP, enquanto como esperado FLNP induziu uma expressão notável desses marcadores de proteína indicando o efeito anticâncer superior. Acreditamos que a liberação programada do inibidor da autofagia e do fármaco quimioterápico a partir de um único nanocarreador aumentará a perspectiva de terapia anticâncer no ESCC. Um estudo mais amplo sobre os diferentes carcinomas de células escamosas e o desenvolvimento do modelo ortotrópico e do modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) será objeto de investigação futura.

Abreviações

5-FU:: 5-Fluorouracil
EPR:: Enhanced permeation and retention effect
ESCC:: Esophageal squamous cell carcinoma
FLNP:: 5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles

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Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias