Nanopartículas híbridas magnéticas com nanopartículas de ouro funcionalizadas Her2:um agente teranóstico para imagem dual-modal e terapia fototérmica de câncer de mama

Resumo

A plataforma teranóstica direcionada que integra imagem multimodal e função terapêutica está emergindo como uma estratégia promissora para detecção precoce e tratamento preciso do câncer. Neste documento, nós projetamos nanopartículas híbridas magnéticas de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) com nanopartículas de ouro nanoeschadas direcionadas que transportam anticorpos anti-receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (Her2) (NPs Her2-GPH) para ultrassom dual-modal (EUA) / Ressonância magnética (RM) e terapia fototérmica do câncer de mama. O agente foi fabricado revestindo nanopartículas de ouro em torno de nanopartículas de PLGA co-carregadas com brometo de perfluorooctilo (PFOB) e nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (SPIOs), seguido de conjugação com anticorpos anti-Her2. Estudos de direcionamento de células demonstraram ligação específica mediada por receptor do agente a células SKBR3 de câncer de mama humano Her2-positivas, e sua taxa de ligação foi significativamente maior do que a de células Her2-negativas ( P <0,001). In vitro, o agente tinha recursos para imagens de US com contraste, bem como T ₂ de ressonância magnética ponderada com uma relaxividade relativamente alta ( r ₂ =441,47 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) Além disso, a funcionalização do agente com Her2 aumentou de forma proeminente o efeito de imagem molecular US / MR de células-alvo por ligação específica de célula. O ensaio de células vivas / mortas e experimentos de citotoxicidade fototérmica direcionada confirmaram que os NPs Her2-GPH poderiam servir como fotoabsorventes eficazes para induzir especificamente a morte celular SKBR3 após irradiação de laser no infravermelho próximo. Em resumo, os NPs de Her2-GPH demonstraram ser novos agentes teranósticos direcionados com grande potencial para facilitar o diagnóstico não invasivo precoce e a terapia adjuvante do câncer de mama.

Introdução

O câncer de mama é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre mulheres em todo o mundo [1]. A chave para reduzir efetivamente a mortalidade por câncer de mama é o diagnóstico precoce e preciso [2]. Apesar dos avanços nas últimas décadas, as estratégias diagnósticas e terapêuticas atuais ainda apresentam limitações na detecção precoce e no tratamento preciso do câncer de mama [3]. Portanto, é necessário explorar novas estratégias criativas para o câncer de mama nos estágios iniciais e subclínicos.

Espera-se que a teranóstica, que envolve a combinação de abordagens diagnósticas e terapêuticas em uma plataforma, desempenhe um papel significativo no avanço da medicina personalizada [4]. Geralmente, os agentes teranósticos integram a imagem molecular e a função terapêutica em uma única nanopartícula, dado o potencial de monitorar e tratar simultaneamente o câncer de mama em nível celular ou molecular [5]. Na clínica, o ultrassom (US) e a ressonância magnética (MRI) são os dois métodos comumente usados para o diagnóstico e estadiamento do câncer de mama [6]. A imagem por US mostra vantagens de alta segurança, medição em tempo real e disponibilidade imediata, e a ultrassonografia com contraste (CEUS) melhorou a sensibilidade e especificidade na detecção de lesões mamárias [7]. Mas a aplicação de imagens de US ainda está limitada a uma resolução espacial e anatômica relativamente limitada. A ressonância magnética pode fornecer uma imagem com excelente resolução espacial e contraste de tecidos moles, enquanto sofre de um tempo de imagem relativamente longo e sensibilidade limitada [8, 9]. Portanto, é significativo combinar os recursos da US e da ressonância magnética para fornecer informações mais complementares, sinérgicas e precisas sobre o câncer de mama [10]. Além disso, a cirurgia e a quimioterapia adjuvante são os principais tratamentos para o câncer de mama, mas também apresentam desvantagens, como complicações graves e aumento da resistência a vários medicamentos. A terapia fototérmica (PTT) utilizando lasers infravermelhos próximos (NIR) e fotoabsorventes, tem despertado amplo interesse recentemente como uma alternativa eficaz aos tratamentos convencionais devido à sua invasividade mínima e boa controlabilidade [11, 12]. Portanto, será de grande valor combinar imagens de US / RM e PTT em uma plataforma para obter ablação fototérmica guiada e monitorada por imagem dual-modal do câncer de mama.

Recentemente, a preparação de nanomateriais fez avanços significativos nas aplicações potenciais da teranóstica do câncer. Como todos sabemos, devido à sua excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade, as nanoestruturas baseadas em poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) têm sido amplamente investigadas para uso em sistemas de entrega de drogas e imagem molecular [13, 14]. O brometo de perfluorooctilo (PFOB), um perfluorocarbono líquido (PFCs), foi encapsulado em conchas poliméricas, como o PLGA, para desenvolver novos agentes de contraste de ultrassom (UCAs) devido à sua alta solubilidade em oxigênio, hidrofobicidade e lipofobicidade [15, 16]. Além disso, nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (SPIOs) têm recebido grande atenção como sondas moleculares de RM para obter informações anatômicas em organismos vivos devido à sua grande biocompatibilidade e excelente realce de contraste [17,18,19].

Outra nanoplataforma promissora são as nanoestruturas de ouro (Au), amplamente utilizadas em pesquisas biológicas e médicas devido à sua boa biocompatibilidade e propriedades óticas e elétricas únicas [20]. A nanoconcha de ouro, um tipo de nanomateriais esféricos de ouro, exibiu significativa absorção de ressonância de plasma de superfície (SPR) na região NIR, permitindo seu uso em PTT para matar seletivamente as células cancerosas sem afetar as células saudáveis circundantes [21]. Também foi relatado que microcápsulas de PLGA revestidas com nanoconchas de Au poderiam ser usadas para imagens moleculares dos EUA [22]. Numerosos estudos se concentraram na combinação de nanoconcha de Au e polímero como uma "estrutura de núcleo de casca" para teranósticos de câncer. Ke et al. desenvolveu uma série de agentes teranósticos baseados em microcápsulas de nanocápsulas de ácido lático para imagens multimodais e PTT [23, 24]. Lu et al. preparou nanoconchas de ouro polimérico carregadas com doxorrubicina para imagens fluorescentes e fototermoquimioterapia de câncer [25]. No entanto, um problema comum enfrentado por esses NPs é a falta de ligantes de ligação de alta afinidade na superfície, o que resulta em sua incapacidade de reconhecer ou se ligar a células-alvo específicas com alta especificidade para maximizar os efeitos diagnósticos e terapêuticos. Além disso, para o melhor de nosso conhecimento, poucos estudos se dedicaram a investigar nanoplataforma híbrida de PLGA com nanoconcha de Au direcionada para diagnóstico colaborativo dual-modal e PTT de câncer de mama.

Entre os alvos moleculares considerados para o câncer de mama até agora, o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (Her2), um receptor tirosina quinase ligado à superfície da membrana celular, é mais comumente usado como um biomarcador importante para a localização e identificação do câncer de mama [26, 27 ] É superexpresso em aproximadamente 25-30% dos cânceres de mama primários humanos associados à agressividade do tumor, alta taxa de recorrência e mau prognóstico [28, 29]. Portanto, a fabricação de agentes teranósticos direcionados a Her2 é um campo florescente na melhoria da detecção precoce e do tratamento do câncer de mama.

Em nosso estudo, a ideia básica é desenvolver NPs magnéticos com nanoconcha de ouro funcionalizados com Her2 (NPs Her2-GPH) que integram imagens de US / RM e PTT, dedicados ao diagnóstico precoce e ao tratamento preciso do câncer de mama. O agente foi construído encapsulando PFOB e SPIOs em PLGA NPs, seguido de revestimento de nanoconchas de ouro na superfície e, em seguida, conjugação com anticorpos anti-Her2 (Fig. 1). Espera-se que o acúmulo suficiente do agente em células SKBR3 de câncer de mama Her2-positivas possa ser alcançado por especificidade de direcionamento mediada por anticorpo e tamanho em nanoescala do agente. O presente estudo também foi desenhado para verificar a viabilidade do uso do agente como uma sonda molecular dual-modal para fornecer imagens com contraste US / MR in vitro, bem como o efeito PTT direcionado de células de câncer de mama induzidas por Au absorvido por NIR nanoconchas.

Materiais e métodos

Materiais

Poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, ácido carboxílico terminado, lactídeo:glicolídeo 50:50, Mw 24.000-38.000), cloridrato de polialilamina (PAH, Mw 17.500) e tri-hidrato de ácido tetracloroáurico (III) (HAuCl ₄ · 3H ₂ O) foram obtidos da Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, China). Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético revestidas com ácido oleico (OA-SPIOs) com um diâmetro médio de 10 nm foram adquiridas de Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd. (Shanghai, China). Brometo de perfluorooctilo (PFOB), álcool polivinílico (PVA, 87-89% molar hidrolisado, baixo peso molecular), cloridrato de 1- (3-moeda-tilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) e N -hidroxissuccinimida (NHS) foram obtidos de Aladdin Chemistry Co., Ltd. (Shanghai, China). Poli (etilenoglicol) (SH-PEG-COOH, Mw 2000) e anticorpo anti-Her2 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram obtidos da Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, China) ) e Abcam (Cambridge, MA, EUA), respectivamente. Todos os outros reagentes usados eram de grau analítico.

Preparação de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs

PFOB / SPIOs @ PLGA NPs foram fabricados usando um método de evaporação de solvente de emulsão de óleo / água adaptado [24, 30]. Resumidamente, SPIOs revestidos com ácido oleico em hexano (0,5 mL, 20 mg / mL) foram adicionados a cloreto de metileno (3,6 mL) dissolvendo PLGA (100 mg) e PFOB (60 μL). A fase orgânica resultante foi adicionada gota a gota à solução aquosa de PVA de pré-resfriamento (20 mL, 2%, w / v ) Posteriormente, o sistema foi emulsificado por 2 min usando sonicação de sonicação em um banho de água com gelo sob configuração de amplitude de saída de 80%. Em seguida, a emulsão foi agitada à temperatura ambiente por 5 h, depois centrifugada (16.000 rpm, 5 min, 15 ° C, Avanti J-25, Beckman Coulter) e lavada duas vezes com água desionizada (DI) para obter PFOB / SPIOs @ PLGA NPs.

Preparação de PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs

Em primeiro lugar, NPs de ouro estabilizadas com citrato com um diâmetro médio de 5 nm foram preparadas como relatado anteriormente [21]. Enquanto isso, a suspensão de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs (1 mL) foi misturada em solução de PAH (1,0 mg / mL em solução aquosa de NaCl 0,5 mol / L) por 30 min, seguido por centrifugação (15.000 rpm, 10 min, 15 ° C ) e lavar duas vezes com água DI. Em seguida, a mistura foi adicionada a uma suspensão de NPs de ouro estabilizada com citrato (100 ml) e agitada durante 30 min. Após etapas de centrifugação / lavagem repetidas, os NPs Au NPs revestidos com PFOB / SPIOs @ PLGA NPs foram redispersos em HAuCl ₄ solução (2 mL, 1% w / v ) sob agitação magnética. A seguir, solução de cloridrato de hidroxilamina recém-preparada (NH ₂ OH · HCl, 0,3 mL, 0,5 mol / L) foi adicionado para reduzir HAuCl ₄ para formar nanoconchas Au na superfície de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs.

Preparação de NPs Her2-GPH

A solução aquosa preparada de PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs (1 mL, 1 mg / mL) foi misturada com SH-PEG-COOH (5 mg) e agitada à temperatura ambiente durante 12 h. Após centrifugação (16.000 rpm, 20 min, 15 ° C) e lavagem duas vezes, o precipitado foi disperso em tampão fosfato salino (PBS). Em seguida, EDC (10 mg) e NHS (10 mg) foram introduzidos e agitados à temperatura ambiente por 2 h para ativar os grupos de ácido carboxílico dos NPs peguilados, e os NPs ativados (NPs GPH) foram então obtidos por centrifugação / lavagem repetida degraus. Posteriormente, os anticorpos anti-Her2 com FITC marcados (10 μL, 0,38 mg / mL) foram adicionados às dispersões de NPs ativadas e incubados por 90 min em um agitador isotérmico. Finalmente, os anticorpos livres foram removidos por centrifugação / lavagem para obter PFOB / SPIOs funcionalizados com Her2 @ PLGA @ Au NPs (Her2-GPH NPs).

Caracterizações

A estrutura e morfologia da superfície de Her2-GPH NPs foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FE-SEM, Hitachi S-4800, Tóquio, Japão). Microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução (TEM, JEM-2100; JEOL, Tóquio, Japão) foi usado para confirmar a estrutura interna, mergulhando uma amostra em grades de cobre revestidas com carbono. A correspondente espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS) da amostra (sem processo de pulverização catódica de ouro) foi anexada ao TEM para analisar a composição elementar dos NPs resultantes. O tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta de Her2-GPH NPs foram medidos usando um instrumento de espalhamento de laser dinâmico (DLS) (Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, UK). Os espectros de absorção no UV-visível do agente em diferentes estágios de preparação foram obtidos com espectrofotômetro no UV-visível (Beckman Coulter DU 730, EUA). A quantidade de elementos Au e Fe em Her2-GPH NPs foi avaliada por espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-AES, Vistampxicp Varian, EUA).

Medição do desempenho fototérmico

O desempenho fototérmico de NPs Her2-GPH foi avaliado por meio do monitoramento do aumento da temperatura sob irradiação com laser NIR. Diferentes concentrações de soluções aquosas Her2-GPH NPs (50, 100, 150, 200 μg / mL) foram irradiadas por um laser de 808 nm (1 W / cm ² ) por 10 min em cubetas de quartzo (volume total de 1 mL), e a temperatura das soluções foi medida por uma câmera térmica FLIR A300 a cada 10 s. Para avaliar a estabilidade fototérmica do agente, os espectros de absorção dos materiais foram adquiridos antes e após o processo de irradiação. Água DI foi irradiada nas mesmas condições para comparação.

Cultura de células

A linha de células SKBR3 de carcinoma de mama humano (células SKBR3) superexpressando Her2 e a linha de células de câncer de mama humano MDA-MB-231 (células MDA-MB-231) de baixa expressão Her2 eram do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular (Xangai, China). Eles foram cultivados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. Todas as células foram cultivadas no ambiente de 37 ° C e 5% de CO ₂ .

Ensaio de citotoxicidade in vitro

A citotoxicidade in vitro de Her2-GPH NPs foi avaliada por ensaios de kit-8 de contagem de células (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Japão) em células SKBR3 e MDA-MB-231. Os dois tipos de células foram semeados respectivamente em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10 ⁴ por poço e incubado por 24 h. Após a remoção do meio de cultura, as células foram tratadas com diferentes concentrações (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg / mL) de NPs de Her2-GPH e posteriormente incubadas por 12 ou 24 h. Em seguida, a solução CCK-8 (10 μL CCK-8 em 100 μL DMEM) foi adicionada e incubada por mais 2 h. Finalmente, a densidade óptica (DO) de cada poço foi medida usando um leitor de microplaca (Thermo Scientific Multiskan MK3) no comprimento de onda de 450 nm.

Estudos de direcionamento específicos para receptores in vitro

Microscopia de varredura a laser confocal

As células SKBR3 e MDA-MB-231 foram semeadas em placas de cultura de células com fundo de vidro ( Φ =20 mm) a uma densidade de 2 × 10 ⁴ células / poço por 24 h e, em seguida, foram divididos em três grupos, respectivamente, incluindo grupo não direcionado, grupo direcionado e grupo de inibição direcionado. Dois tipos de células como grupo não-alvo foram tratados com 100 μL de NPs de GPH e as células do grupo-alvo foram tratadas com 100 μL de NPs de Her2-GPH. Em grupos de inibição direcionados, as células foram incubadas com anticorpos anti-Her2 livres (20 μL) por 30 min antes de serem tratadas com NPs Her2-GPH. Após a respectiva incubação de 30 min, as células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% por 15 min. Em seguida, as células foram coradas com um agente de coloração de núcleo (DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) por 10 min e lavadas novamente com PBS. Finalmente, as células foram observadas usando microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Alemanha).

Citometria de fluxo

As células SKBR3 e MDA-MB-231 foram cultivadas e tratadas como descrito acima, e os agrupamentos foram consistentes com o ensaio LSCM. Todas as células foram digeridas com tripsina e então ressuspensas em PBS antes da citometria de fluxo (FCM) com uma densidade de 2 × 10 ⁵ células por tubo. A intensidade de fluorescência das células foi determinada por um citômetro de fluxo (FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA). As células SKBR3 e MDA-MB-231 foram usadas como controles em branco para definir as portas. Em seguida, a voltagem e a compensação de fluorescência de FL1 foram ajustadas para garantir que a fluorescência espontânea das células estava dentro de 10 ¹ do histograma de fluorescência. Após incubar as células com NPs, os desvios da intensidade de fluorescência dos grupos em branco refletiram a taxa de ligação dos NPs às células. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Imagem In Vitro dos EUA e Análise Quantitativa

Imagem de ultrassom com solução in vitro

A imagem de ultrassom de solução in vitro de NPs de Her2-GPH foi realizada usando a unidade Mylab Twice Ultrasound System (Esaote SpA, Genova, Itália). Os NPs Her2-GPH foram dispersos em água DI desgaseificada em diferentes concentrações (0,1, 0,5, 1, 1,5, 2 mg / mL) e injetados no tubo Eppendorf (2 mL) e, em seguida, o tubo foi imerso em um tanque de água ultrapura. A ultrassonografia foi realizada com o transdutor LA522 no modo de escala de cinza bidimensional (2D) e no modo aprimorado com contraste sob os seguintes parâmetros:o índice mecânico (MI) =0,01 e a faixa de frequência foi de 3–9 MHz. As imagens foram adquiridas da seção transversal longitudinal do tubo e gravadas para análise quantitativa da Curva de Intensidade de Tempo (TIC) usando o software QontraXt V3.06.

Imagem direcionada de células do câncer de mama nos EUA

As células SKBR3 e as células MDA-MB-231 foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10 ⁶ / poço por 24 h, e eles foram divididos em três grupos, incluindo o grupo de controle, o grupo não-alvo e o grupo-alvo. As células no grupo não direcionado e no grupo direcionado foram tratadas com NPs de GPH (100 μg / mL) e NPs de Her2-GPH (100 µg / mL) por 30 min, respectivamente. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS, digeridas e redispersas em tubos de ensaio com PBS (0,5 mL). Os géis de agarose (1%) foram preparados em placas de vidro de 20 mL. Para simular o efeito de imagem de ultrassom direcionado de NPs na superfície da célula, as suspensões de células nos seis grupos de tubos de ensaio foram extraídas separadamente com seringas de 1 mL e lentamente injetadas no gel de ágar. A imagem foi realizada usando um transdutor SL3116 no modo de escala de cinza (ganho =70%; frequência central =22 MHz; MI =0,06). Após a digitalização, a região de interesse (ROI) em cada grupo de imagens de ultrassom foi desenhada. O valor da escala de cinza de cada ROI foi analisado quantitativamente usando software de análise de imagem (DigSubAna; Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China) para avaliar o efeito de imagem de ultrassom direcionado de NPs Her2-GPH.

Imagem de RM in vitro e análise quantitativa

T ₂ Medição e imagens de RM de NPs Her2-GPH

Imagens de RM de Her2-GPH NPs e medições de relaxividade foram realizadas usando um sistema de 0,5 T (Shanghai Niumag Corporation ration NM120-Analyst). Os NPs Her2-GPH foram suspensos em água DI em várias concentrações de Fe (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 mM) e T ₂ As imagens de RM ponderadas das amostras foram adquiridas usando sequência spin-eco (TR =2.000 ms; TE =100 ms; espessura de corte =3 mm; FOV =3 × 3 cm). O tempo de relaxamento transversal ( T ₂ ) de prótons de água da solução aquosa de NPs também foi medida, e a relaxividade transversal ( r ₂ ) foi determinado através do ajuste da curva de 1 / T ₂ (s ⁻¹ ) versus a concentração de Fe (mM).

Imagem por RM direcionada de células cancerosas da mama

Os agrupamentos e tratamento das células SKBR3 e MDA-MB-231 foram consistentes com o ensaio de imagem dos EUA direcionado. Após a incubação com GPH NPs não direcionados (100 μg / mL) ou Her2-GPH NPs direcionados (100 μg / mL) por 30 min, as células foram lavadas com PBS, digeridas e dispersas em goma xantana (1 mg / mL) . Todas as amostras foram digitalizadas usando sequência spin-eco com os mesmos parâmetros descritos acima. O ROI de cada imagem foi definido para análise quantitativa da intensidade do sinal com o software Image J.

Avaliação de PTT direcionada in vitro

Para visualizar o efeito PTT direcionado de Her2-GPH NPs, as células SKBR3 foram semeadas em placas de cultura de células com fundo de vidro ( Φ =20 mm) a uma densidade de 1 × 10 ⁵ células / poço por 24 h, e eles foram divididos em cinco grupos, respectivamente, incluindo grupos de controle DMEM com ou sem irradiação a laser, grupos de materiais direcionados com ou sem irradiação a laser e material não direcionado com irradiação a laser. Os grupos-alvo foram tratados com dispersões de DMEM contendo Her2-GPH NPs (100 μg / mL) por 30 min e os grupos não-alvo foram tratados com GPH NPs (100 μg / mL) na mesma condição. As células em grupos de irradiação de laser foram irradiadas com laser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) por 10 min e posteriormente incubado a 37 ° C por 2 h. Em seguida, a viabilidade celular foi avaliada usando um kit de ensaio de células vivas / mortas (Life Technologies, Grand Island, NY). Finalmente, as imagens das células coradas foram adquiridas com um LSCM. Para quantificar a citotoxicidade fototérmica, células SKBR3 (1 × 10 ⁴ por poço) foram semeados em placas de 96 poços e incubados por 24 h. Os agrupamentos foram consistentes com o acima, e a viabilidade celular foi testada pelo ensaio CCK-8. Para avaliar ainda mais quantitativamente a citotoxicidade fototérmica de NPs Her2-GPH sob diferentes concentrações e irradiação a laser. As células foram incubadas com dispersões de DMEM contendo NPs Her2-GPH de diferentes concentrações (0, 50, 100, 150, 200 μg / mL). Após lavagem com PBS (10 mM, pH 7,0), as células foram irradiadas por laser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) por 10 min e posteriormente incubado por 2 h. Em seguida, a viabilidade celular também foi determinada pelo ensaio CCK-8. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão ( n =4).

Para simular a expressão heterogênea de Her2 em tecidos de tumor de mama, co-cultivamos células SKBR3 e células MDA-MB-231 em diferentes proporções (0:100%, 25:75%, 50:50%, 75:25%, 100 :0%). Todas as células foram tratadas com Her2-GPH NPs (200 μg / mL) por 30 min e irradiadas com laser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ) por 10 min. Após incubação adicional por 2 h, as viabilidades celulares foram analisadas com ensaios de CCK-8. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão ( n =4).

Análise estatística

Os dados quantitativos foram expressos como média ± desvio padrão (média ± DP). As diferenças estatísticas entre vários grupos foram determinadas por análise de variância (ANOVA), e os dados de duas amostras independentes foram comparados usando o t de Student teste. P <0,05 foi considerada diferença estatisticamente significativa. As análises estatísticas foram realizadas usando SPSS v17.0 (IBM, Armonk, NY, EUA).

Resultados e discussões

Caracterizações

PFOB / SPIOs @ PLGA NPs foram fabricados através do processo de evaporação de solvente de emulsão de óleo / água. A imagem SEM (Fig. 2a) revelou que os NPs PFOB / SPIOs @ PLGA possuíam morfologia esférica uniforme e superfície lisa. Conforme mostrado no TEM (Fig. 2b), havia uma diferença óbvia de densidade eletrônica entre o núcleo e o escudo dos NPs PFOB / SPIOs @ PLGA, sugerindo o encapsulamento de PFOB dentro dos NPs. Além disso, conforme representado na imagem inserida de maior ampliação, a presença de SPIOs foi demonstrada como manchas cinza profundas na concha e na região do núcleo de PFOB líquido de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs. O diâmetro médio de PFOB / SPIOs @ PLGA NPs foi de cerca de 248,3 nm com um índice de polidispersidade de 0,037, e o potencial zeta foi de aproximadamente - 14,7 mV de acordo com a medição DLS. Portanto, PFOB / SPIOs @ PLGA NPs poderiam facilmente absorver PAH carregados positivamente de modo a anexar posteriormente nanopartículas de Au carregadas negativamente com um tamanho médio de 5-7 nm, que foram usadas como sementes para nuclear o crescimento da nanoconcha de ouro em torno da superfície do PFOB / SPIOs @ PLGA NPs por meio do procedimento de semeadura.

Os NPs Her2-GPH foram preparados ligando anticorpos anti-Her2 a NPs PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au via SH-PEG-COOH. Neste processo, a tecnologia clássica de carbodiimida foi usada para ativar os grupos de ácido carboxílico de PFOB / SPIOs PEGuilados @ PLGA @ Au NPs e promover a ligação covalente de grupos amino a anticorpos [31]. Conforme ilustrado em imagens SEM e TEM (Fig. 2c, d), Her2-GPH NPs mantiveram uma morfologia esférica bem definida com superfície rugosa, e Au NPs densos com um diâmetro de dezenas de nanômetros podiam ser vistos claramente na superfície do NPs, que indicavam a fabricação bem-sucedida das nanoconchas de ouro. O mapeamento de elementos EDS (Fig. 2e) e os resultados da análise de elementos (Fig. 3a) de NPs Her2-GPH revelaram claramente a grande quantidade de elemento Au e a presença de elementos Fe, F e Br, indicando o encapsulamento bem-sucedido de SPIOs e PFOB e a formação de nanoconchas Au. Além disso, o conteúdo de elementos Au e Fe em NPs Her2-GPH foram avaliados em 67,71 ± 7,34% em peso e 2,13 ± 0,52% em peso% por ICP-AES, respectivamente.

Além disso, os espectros de absorção de UV-Vis de NPs de Her2-GPH em diferentes estágios de preparação também foram examinados (Fig. 3b). PFOB / SPIOs @ PLGA NPs não mostraram nenhum pico de absorção óbvio na faixa de 400 a 800 nm, enquanto Au NPs exibiram um pico de ressonância de plasma em cerca de 520 nm. Ambos PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs e Her2-GPH NPs exibiram um pico amplo e contínuo variando de 600 a 900 nm (região NIR) por causa das sementes de Au anexadas cresceram o suficiente através do processo de semeadura para agrupar. O amplo espectro de absorção na região NIR garantiu que os NPs Her2-GPH pudessem operar como fotoabsorventes para a terapia fototérmica NIR. Além disso, em comparação com PFOB / SPIOs @ PLGA NPs, Her2-GPH NPs tinham uma distribuição de tamanho aumentada de 282,3 nm com um índice de polidispersidade de 0,18 (Fig. 3c). E o potencial zeta era - 31,3 mV (Fig. 3d), implicando na boa estabilidade do mesmo.

Medição do desempenho fototérmico

O efeito de conversão fototérmica da solução Her2-GPH NPs foi avaliado sob a irradiação de laser NIR (808 nm, 1 W / cm ² ), e a variação da temperatura foi monitorada com uma câmera de imagem térmica IR a cada 10 s. Após 10 min de irradiação do laser, a cor da imagem térmica de diferentes concentrações de solução de NPs Her2-GPH mudou, significando que a temperatura aumentou com o aumento da concentração de NPs Her2-GPH (Fig. 4a). A medição da temperatura fototérmica foi consistente com os dados de imagem. Pôde-se observar que a temperatura da solução de NPs aumentou com o aumento do tempo de exposição e da concentração (Fig. 4b). Em detalhes, o aumento de temperatura da solução de NPs Her2-GPH foi de 18,5 ° C na concentração de 0,2 mg / mL, enquanto houve apenas um aumento de 1,2 ° C para água DI. Para matar as células cancerosas, a temperatura teve que ser elevada para a faixa de hipertermia (40-47 ° C) de acordo com estudos anteriores [32]. Porém, devido à perda térmica in vitro, um aumento de temperatura de cerca de 10 ° C não é suficiente para induzir a morte celular [33]. Os NPs Her2-GPH podem aumentar a temperatura em cerca de 18 ° C em uma concentração relativamente baixa, dando assim o potencial de matar células cancerosas por hipertermia. Além disso, para verificar a estabilidade fototérmica dos NPs Her2-GPH, espectros de absorção de NIR UV-visível das amostras foram coletados antes e após a irradiação do laser. E os espectros de absorção permanecem quase inalterados antes e depois da exposição ao laser (Fig. 4c), garantindo que os NPs Her2-GPH possam ser usados como fotoabsorventes eficientes para PTT de câncer.

Ensaio de citotoxicidade in vitro

It is well known that biocompatibility of NPs is one of the primary concerns in biomedical applications and should be determined first. Thus, CCK-8 assays were used to evaluate the cytotoxicity of Her2-GPH NPs in breast cancer MDA-MB-231 and SKBR3 cells, as shown in Fig. 5a and b. Compared with controls, the viability of Her2-GPH NPs-treated MDA-MB-231 and SKBR3 cells remained more than 90% at the concentration ranging from 10 to 200 μg/mL for 24 h, indicating the low cytotoxicity and good biocompatibility of the resulted NPs, which could ensure their safety for further cell experiments and clinical studies.

In Vitro Receptor-Specific Targeting Studies

Confocal Laser Scanning Microscopy

Fluorescein isothiocyanate (FITC) is widely used as green fluorescence probes for immune detection and it can easily bind several kinds of monoclonal antibodies. Thus, we choose FITC-labeled anti-Her2 antibody, and the connection of NPs with antibody could be observed more visually by immunofluorescence assay. To verify the binding of anti-her2 antibodies to GPH NPs, GPH NPs and Her2-GPH NPs were placed on dishes (Φ = 20 mm) for CLSM analysis. As illustrated in Fig. 6, both Her2-GPH NPs and GPH NPs could be clearly observed in bright field. GPH NPs showed no fluorescence signal, while Her2-GPH NPs exhibited bright green fluorescence in the FITC and merged channel, which confirmed the successful conjugation of anti-her2 antibody with GPH NPs.

We utilized LSCM to confirm the targeting specificity of Her2-GPH NPs in vitro. As can be seen from the Fig. 7, compared with non-targeted group (b), SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a) exhibited bright green fluorescence signals on the surface of cell membranes, indicating the NPs carrying Her2 antibodies could effectively bind to Her2-positive cells [34]. To clearly observe the distributions of Her2-GPH NPs in SKBR3 cells, we provided a bright image (a1), FITC fluorescence image (a2), nuclear image (a3), and an overlay image (a4) of it. Because of the short incubation time of NPs, they were mainly distributed on the surface of cell membranes and aggregated into black spots. In competition study, there were negligible fluorescence signals when SKBR3 cells were pre-treated with excess free anti Her2 antibodies and then incubated with Her2-GPH NPs (Fig. 7c). These results demonstrated that the targeting behavior of Her2-GPH NPs was receptor-mediated and could be blocked by excess free anti-Her2 antibodies [26]. In addition, little fluorescence is detected in MDA-MB-231 cells treated with Her2-GPH NPs under the same conditions (Fig. 7d), which confirmed that Her2-GPH NPs specifically bind to SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors.

Flow Cytometry

The binding rate of Her2-GPH NPs towards cells was further assessed quantitatively via FCM. As clearly illustrated in Fig. 7, the binding rate of targeted NPs to SKBR3 cells (e) was remarkably higher than that of MDA-MB-231 cells (h) (86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%, P < 0.001), indicating the specific targeting capability of Her2-GPH NPs to Her2-positive cells. In addition, Her2-GPH NPs had little targeting binding to SKBR3 cells which were pre-treated with excess free anti-Her2 antibodies (Fig. 7g), and there was significant difference between the targeted inhibition group and targeted group (3.16% ± 0.41% vs 86% ± 3.72%, P <0,001). Based on the above, the FCM results provided further strong evidence that Her2-GPH NPs had specific targeting capability of recognizing and combining with SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors and the targeting behavior was receptor-mediated.

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

In Vitro Solution Ultrasound Imaging

In our study, the US imaging effect of Her2-GPH NPs solution was assessed in vitro under different modes using Mylab Twice Ultrasound System unit. Observed from Fig. 8a, the tubes filled with Her2-GPH NPs solution displayed strong dotted echo in both 2D gray-scale and CEUS modes. By contrast, DI water exhibited as an echo. Furthermore, with the increasing concentration of Her2-GPH NPs, the ultrasound contrast enhancement signal gradually increased. As illustrated in TIC, the mean signal intensity of the Her2-GPH NPs gradually increased as the concentration of NPs increased and it kept correspondence with the CEUS result. The agent at the concentration of 2 mg/mL had significantly stronger contrast enhancement signals than the NPs at 0.1 mg/mL (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P < 0.01), indicating the stronger backscattering is produced by higher concentration of the NPs. The above indicated that the Her2-GPH NPs possessed satisfactory contrast enhancement effect in vitro and such contrast enhancement was concentration-dependent. In addition, the length of ultrasound imaging time of Her2-GPH NPs at the concentration of 2 mg/mL was also investigated (Fig. 8b). Her2-GPH NPs exhibited exquisite contrast-enhanced signal before 2 min, and the signal intensity gradually decreased with time elapsing. However, there was still obvious enhancement signal within 5 min, which can meet the requirement of clinical contrast-enhanced ultrasonography. Conventional gas-filled microbubbles as UCAs could enhance the backscattering signal of blood by non-linear oscillations under ultrasound but are not suitable for tissue molecular evaluation due to its limitation in intravascular imaging and poor stability [35]. Compared with gas-filled agent, the liquid fluorocarbon-filled PLGA nanocapsules have acoustic stability with prolonged circulation half-time [16]. Besides, our previous research found that Au nanoshells have good reflection properties because of its high atomic number and density [36]. Therefore, we combined the ultrasonic resonance properties of PFOB-filled PLGA nanocapsules with the great echogenicity of Au nanoshells, which prominently enhanced the backscattering signal of Her2-GPH NPs in vitro.

Targeted US Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted ultrasound imaging ability of Her2-GPH NPs on breast cancer cells was evaluated in 2D gray-scale mode using Mylab Twice Ultrasound System unit. As shown in Fig. 9a, both the NPs-treated and the control cells displayed uniform, hyperechoic bands in the gel with clear boundaries. It could be clearly observed that the echogenic band of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs was brighter and denser than those of non-targeted and control SKBR3 cells. However, no significant echo signal differences were observed in MDA-MB-231 cells treated with targeted or non-targeted NPs. We further quantified the average gray-scale value of the images based on the defined ROI, and the results were exhibited in Fig. 9b. The gray-scale value of SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs was significantly higher than that of SKBR3 non-targeted and control group (P <0,01). Moreover, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs showed higher gray-scale values compared to MDA-MB-231 cells treated with the same NPs (P <0,05). These results demonstrated that Her2-GPH NPs could specifically bind to Her2-positive SKBR3 cells and had the potential to enhance the ultrasound molecular imaging effect of targeted cells.

In Vitro MR Imaging and Quantitative Analysis

T ₂ Measurement and MR Imaging of Her2-GPH NPs

SPIOs have been intensively investigated in T ₂ -weighted MR imaging due to their capability to shorten transverse relaxation times of the surrounding water protons, which results in the decrease in the MR signal intensity and enables to provide negative contrast enhancement of the target lesion [37, 38]. The T ₂ contrast imaging capabilities of Her2-GPH NPs with various Fe concentrations were evaluated at a 0.5 T magnetic field. Figure 10 a displayed the transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of water protons as a function of the iron concentration in Her2-GPH NPs aqueous solution. And the relaxivity (r ₂ ) was calculated based on the slope to be 441.47 mM⁻¹ s ⁻¹ , which is more than 2 times as high as commercial SPIO-based MR imaging contrast agent Feridex (152 mM⁻¹ s ⁻¹ ) under the same magnetic field strength [39]. The higher T ₂ relaxivity may be due to the fact that the aggregation of SPIOs inside the polymeric matrix results in a relatively enlarge in the size of the magnetic NPs and enhances the magnetic interactions [37, 40]. In addition, the signal intensity of T ₂ -weighted MR imaging gradually decreased along with the increase of the iron concentration (Fig. 10b), which further confirmed Her2-GPH NPs had the capability for T ₂ -weighted MR contrast imaging.

Targeted MR Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted MR imaging effect of Her2-GPH NPs on SKBR3 and MDA-MB-231 cells was confirmed by in vitro T ₂ -weighted MR imaging. As shown in Fig. 10 c and d, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs exhibited noticeable negative contrast enhancement, and the signal intensity decreased by 48% compared to the control cells (P <0,001). However, the MR signal intensity of non-targeted GPH NPs-treated SKBR3 cells showed little reduction. In addition, the signal intensity of MDA-MB-231 cells labeled with Her2-GPH NPs or GPH NPs did not change significantly compared with the control group (P> 0,05). Furthermore, Her2-GPH NPs-treated SKBR3 cells showed a higher degree of signal intensity reduction than that of MDA-MB-231 cells (P < 0.001), which could be used to distinguish the two cells from each other. The above results together indicated that Her2-GPH NPs could enhance T ₂ -weighted MR imaging through receptor-mediated cell-specific uptake [41].

In Vitro Targeted PTT Evaluation

Initially, calcein-AM/propidium iodide (PI) staining was used to visually evaluate targeted photothermal cytotoxicity in vitro. Calcein AM, a non-fluorescent live cell stain, can permeate the cell membrane and hydrolyze to produce a green fluorescent calcein dye in live cells. Propidium iodide (PI) is a dead cell stain, which binds to the DNA of dead cells to generate red fluorescence [33]. As shown in Fig. 11a, there were no obvious dead cells when NIR laser irradiation or the Her2-GPH NPs was used separately, indicating that neither laser irradiation nor the NPs itself was cytotoxic. Likewise, cells treated with non-targeted GPH NPs in combination with NIR laser showed little cell death. On the contrary, a large number of dead cells could be observed when Her2-GPH NPs were treated in the presence of laser irradiation, which suggested that the agent could induce hyperthermic cell death by targeting photothermal effect. The cell viabilities were further quantitatively evaluated by CCK-8 assay. As illustrated in Fig. 11b, SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs and laser irradiation exhibited a (62 ± 4.56%) decrease in cell viability compared with the control group (P <0,001). Furthermore, under the laser irradiation for 10 min, the cell viability of targeted Her2-GPH NPs group was significantly lower than that of the non-targeted group (38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%, P <0,05).

In addition, we used the CCK-8 assay to further quantitatively assess the photothermal cytotoxicity of Her2-GPH NPs at various concentrations. As shown in Fig. 11c, the viabilities of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs without NIR laser irradiation remained more than 90%, whereas the viabilities of laser irradiated cells decreased significantly with increasing concentrations of Her2-GPH NPs. Only less than 20% of laser-irradiated cells remained viable at the concentration of 200 μg/mL compared with the non-laser-irradiated cells at the same concentration (P <0,001). These results further confirmed that relatively low concentrations of Her2-GPH NPs were sufficient to provide enough temperature increase to kill SKBR3 cells.

Furthermore, we co-cultured SKBR3 and MDA-MB-231 cells in different proportions to simulate the heterogeneous expression of Her2 in breast tumor tissues. Results showed that the total cell viabilities after photothermal induction of Her2-GPH NPs decreased with the increasing proportions of SKBR3 cells, and the total cell viability of the other proportion group was significantly higher than that of the 100% SKBR3 cells group (P < 0.05) (Additional file 1:Figure S1). Besides, in the presence of Her2-GPH NPs for 30 min, the total cell viabilities after induction with NIR laser was significantly lower than that of the non-laser irradiation cells (P < 0.05), except for the 100% MDA-MB-231 cells group. Taken together, Her2-GPH NPs could specifically bind to SKBR3 cells and had great potential to induce cancer cells to death by photothermal effect. The possible mechanism of photothermal hyperthermia for SKBR3 cells should be mainly attributed to the exposure of the cancer cells to higher temperatures, which inhibited normal cellular growth and proliferation by denaturing intracellular proteins [42].

Conclusions

Her2-GPH NPs, a Her2 functionalized theranostic agent that integrated dual-modal US/MR imaging and targeted PTT has been successfully designed, fabricated and investigated in vitro. By conjugation with anti-Her2 antibodies, the agent could recognize or bind to breast cancer SKBR3 cells overexpressing Her2 with high specificity and sensitivity. In addition, through the co-loading of PFOB and SPIOs, and the construction of Au-nanoshelled PLGA “shell-core structure”, the resulting Her2-GPH NPs provide excellent contrast enhancement in vitro US and T ₂ -weighted MR imaging. Furthermore, the formation of Au nanoshells enables the agent to be served as efficient photoabsorber for targeted NIR PTT in breast cancer cells. Our results provide a preliminary exploratory study for the integration of collaborative diagnosis and adjuvant therapy of breast cancer, and further studies in vivo are still needed.