Compósito de Pontos Quânticos de Carbono-Porfirina de Platina: Agente Teranóstico de Dupla Função para Terapia Fotodinâmica de Câncer Aprimorada

Resumo

Fotossensibilizadores (PSs) são notoriamente hidrofóbicos, limitando sua utilidade clínica em terapia fotodinâmica (PDT). Para superar isso, projetamos um novo nanoagente teranóstico, CQDs@PtPor, pela ligação eletrostática de um complexo porfirina tetraplatinado (PtPor) a pontos quânticos de carbono (CQDs) carregados negativamente. Caracterização abrangente (DRX, MET, XPS, FTIR) confirmou a montagem bem-sucedida de CQDs e PtPor em uma única nanoestrutura. Análise espectroscópica revelou transferência de energia por ressonância eficiente de CQDs para PtPor, resultando em produção marcadamente aumentada de oxigênio singleto (¹O₂). Estudos in vitro em células HeLa demonstraram que CQDs@PtPor alcançou fototoxicidade superior comparada ao PtPor livre, exibindo citotoxicidade escura negligenciável, sublinhando seu potencial como plataforma terapêutica segura e eficaz contra câncer.

Fundamentação

PDT emergiu como estratégia não invasiva para tratar distúrbios de pele, degeneração macular e vários cânceres [1]. A terapia baseia-se em PSs ativados por luz que geram espécies reativas de oxigênio (ROS) sob irradiação, matando seletivamente células tumorais enquanto poupam tecido saudável [2–6]. Embora PSs ativáveis como derivados de porfirina e ftalocianina possam servir a papéis duais em imagem e terapia, sua tradução clínica é dificultada por baixa solubilidade aquosa, fotossensibilidade cutânea prolongada, penetração tecidual limitada e absorção subótima além de 700 nm [7–11]. Vários nanocarregadores — lipossomos, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de ouro, nanotubos de carbono, grafeno e pontos quânticos de carbono (CQDs) — foram explorados para melhorar entrega e desempenho de PSs [12–22].

CQDs, uma classe versátil de nanomateriais de carbono, exibem propriedades ópticas excepcionais, alta solubilidade em água, baixa toxicidade, excelente biocompatibilidade e funcionalização de superfície facilitada [23–27]. Seus abundantes grupos de superfície permitem anexação covalente ou não covalente de fármacos, proteínas ou ligantes de direcionamento, tornando-os carregadores atrativos para aplicações teranósticas [31–33]. Estudos prévios demonstraram que CQDs conjugados com PSs (ex: Ce6, ZnPc, TMPyP) podem melhorar imagem por fluorescência e eficácia fotodinâmica através de mecanismos de transferência de energia [34–36].

Recentemente, um complexo porfirina tetraplatinado exibiu baixa citotoxicidade escura mas valores IC₅₀ tão baixos quanto 19 nM sob irradiação a 420 nm, indicando atividade anticancerígena potente [37]. No entanto, sua hidrofobicidade e biocompatibilidade limitada impedem uso clínico. Projetamos portanto CQDs@PtPor para aproveitar a solubilidade e química de superfície dos CQDs enquanto retemos a potência terapêutica do PtPor. A montagem eletrostática entre PtPor carregado positivamente e CQDs carregados negativamente não só melhora dispersibilidade em água mas também promove transferência de energia, amplificando geração de ¹O₂ e fototoxicidade.

Métodos

Materiais
Diclorodiamina trans-platina (trans-platina) (Aladdin®), 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF) (Sigma-Aldrich), e todos os solventes foram comprados da Tianjin Fu Chen Chemical Reagents ou Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Todos os reagentes foram usados como recebidos.

Síntese de [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Tetra(4-piridil)-Porfirina Nitrato

Trans-platina (0,193 mmol, 58 mg) e AgNO₃ (0,193 mmol, 33 mg) foram dissolvidos em 5 mL DMF e agitados por 24 h. O precipitado branco de AgCl resultante foi removido por centrifugação, resultando em solução clara. Esta foi adicionada a uma suspensão de 5,10,15,20-Tetra(4-piridil)porfirina (0,487 mmol, 30 mg) em 3 mL DMF, seguida por agitação a 50 °C por 48 h. Após resfriamento, 10 mL éter dietílico foi adicionado para precipitar o produto vermelho, que foi lavado com metanol, diclorometano e éter. Secagem sob vácuo deu 81 mg de produto (rendimento 86%). A estrutura foi confirmada por RMN de ¹H e ESI-MS.

Preparação de CQDs

Ácido cítrico (0,45 g) e etilenodiamina (500 µL) foram dissolvidos em 10 mL água DI e submetidos a tratamento hidrotérmico a 200 °C por 5 h em autoclave revestida com PTFE. A solução marrom-escura resultante foi purificada por centrifugação e diálise contra água DI para obter CQDs.

Preparação do Compósito CQDs@PtPor

PtPor (20 mg em 3 mL DMSO) foi disperso em 12 mL água e adicionado lentamente a uma suspensão de CQDs (5 mg em 15 mL H₂O) sob sonicação. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 24 h, então purificada por centrifugação e dialisada por 2 dias. A solução aquosa final foi liofilizada a 4 °C para obter o compósito.

Medida de Rendimento Quântico

O rendimento quântico (Φ) dos CQDs foi calculado relativo a sulfato de quinina (Φ_st ≈ 54%) usando método comparativo padrão. Absorbância foi mantida abaixo de 0,1 a 360 nm para evitar efeitos de reabsorção.

Geração de Oxigênio Singleto

Amostras (5 mg mL⁻¹) foram misturadas com 10 mM DPBF em cubeta de 3 mL e irradiadas com lâmpada de xenônio 50 W (filtro passa-longa 500 nm, 6 mW cm⁻²) por até 30 min. A diminuição na absorbância do DPBF a 415 nm foi monitorada a cada 3 min para quantificar produção de ¹O₂. Fluorescência DCFH (λ_em = 525 nm) também foi usada como sonda qualitativa.

Ensaios de Citotoxicidade

Células HeLa foram cultivadas em DMEM com 5% FCS, 100 U mL⁻¹ penicilina e 100 µg mL⁻¹ estreptomicina a 37 °C, 6% CO₂. Para citotoxicidade escura, células foram incubadas com concentrações variadas de CQDs, PtPor ou CQDs@PtPor por 24 h, então avaliadas por ensaio MTT. Para fototoxicidade, células foram irradiadas após 24 h de incubação, e viabilidade foi novamente determinada por MTT.

Imagem Celular

Células HeLa (5 × 10⁴ células mL⁻¹) foram incubadas com 0,25 mg mL⁻¹ CQDs@PtPor por 1 h, lavadas, e imageadas por microscopia confocal (Zeiss LSM7 DUO) usando laser de 405 nm.

Resultados

Preparação e Caracterização de CQDs@PtPor

Microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou partículas uniformes e monodispersas: CQDs com média de 2,5 nm, enquanto CQDs@PtPor com média de 7,6 nm, refletindo adsorção de PtPor (Fig. 1). Padrões de DRX exibiram pico largo a ~23°, indicativo de estrutura de carbono amorfo. Espectros FTIR confirmaram presença de grupos hidroxila, amino e amida (Fig. 2b). Espalhamento dinâmico de luz (DLS) mediu diâmetro hidrodinâmico médio de 9,2 nm para CQDs@PtPor, corroborando dados de MET. Potencial zeta mudou de −15,6 mV (CQDs livres) para +4,5 mV após conjugação com PtPor, confirmando ligação eletrostática (Fig. 3d).

Propriedades Fotofísicas

Espectros UV-Vis exibiram absorção característica de CQD (~360 nm) e bandas Soret/Q de porfirina (~425, 520, 580 nm). CQDs exibiram fotoluminescência (PL) dependente de excitação com emissão deslocando de 460 a 552 nm entre excitação 280–500 nm, e rendimento quântico de 36%. No compósito, intensidade de PL a 500 nm diminuiu enquanto emissão a 660 nm aumentou, evidenciando transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) eficiente. Medidas de tempo de vida de fluorescência confirmaram tempo de vida do doador encurtado em CQDs@PtPor, suportando ainda mais transferência de energia (Fig. 4).

Produção Aumentada de Oxigênio Singleto

Experimentos de degradação DPBF revelaram que CQDs@PtPor produziu significativamente mais ¹O₂ que PtPor livre, enquanto CQDs sozinhos mostraram atividade negligenciável (Fig. 5a). Fluorescência DCFH corroborou estes achados, com CQDs@PtPor resultando no sinal mais forte (Fig. 5b).

Fototoxicidade em Células HeLa

Ensaios de citotoxicidade escura mostraram >90% viabilidade a 50 µg mL⁻¹ para todas as amostras (Fig. 6a). Ensaios de fototoxicidade, no entanto, demonstraram redução dependente de dose na viabilidade: CQDs@PtPor a 50 µg mL⁻¹ alcançou apenas 8% sobrevivência, superando PtPor (18%) e CQDs (90%) (Fig. 6b). Esta eficácia superior é atribuída à geração aumentada de ¹O₂ mediada por CQDs.

Captação Celular e Estabilidade

Imagem confocal revelou que CQDs@PtPor localizou predominantemente no citoplasma de células HeLa, com fluorescência azul de CQD sobrepondo emissão vermelha de PtPor, indicando formação estável do complexo pós-captação (Fig. 7).

Discussão

O pronunciado FRET de CQDs para PtPor, evidenciado por emissão do doador reduzida e tempo de vida encurtado, traduz-se diretamente em maior produção de ¹O₂ e fototoxicidade aprimorada. O pequeno tamanho (~10 nm) de CQDs@PtPor facilita acumulação tumoral via efeito de permeabilidade e retenção aumentada (EPR), enquanto a dispersibilidade em água aprimorada e biocompatibilidade reduzem toxicidade sistêmica. A natureza modular da montagem eletrostática permite substituição fácil de diferentes PSs ou ligantes de direcionamento, posicionando CQDs@PtPor como plataforma versátil para PDT personalizada.

Conclusões

Fabricamos com sucesso um nanoagente CQDs@PtPor que combina as propriedades ópticas superiores de CQDs com a potente atividade anticancerígena de uma porfirina tetraplatinada. O compósito exibe alta estabilidade aquosa, baixa toxicidade escura, transferência de energia eficiente e eficácia fotodinâmica marcadamente aprimorada in vitro. Estes atributos tornam CQDs@PtPor um candidato promissor para futura tradução clínica em terapia de câncer.

Histórico de Alterações

• Submissão inicial.

Abreviações

CA

Ácido cítrico

CQDs

Pontos quânticos de carbono

DPBF

1,3-Difenilisobenzofurano

EDA

Etilenodiamina

MTT

3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo

PDT

Terapia fotodinâmica

PSs

Fotossensibilizadores

TEM

Microscopia eletrônica de transmissão

UV

Ultravioleta

XPS

Espectroscopia de fotoelétrons por raios-X

XRD

Difração de raios-X