Efeitos de proteção de pontos de carbono derivados de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata contra Deinagkistrodon acutus Lesão renal aguda induzida por veneno

Resumo

Histórico

Como um nanomaterial emergente, os pontos de carbono (CDs) têm sido o foco de uma tremenda atenção para aplicações biomédicas. No entanto, poucas informações estão disponíveis sobre sua bioatividade na inibição da lesão renal aguda (LRA) induzida pelo veneno de cobra.

Métodos

Este estudo relata o desenvolvimento de um processo de pirólise verde de uma etapa para sintetizar CDs usando Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) como o único precursor e sua aplicação potencial como um protetor contra Deinagkistrodon acutus (D. acutus) AKI induzida por veneno foi investigada pela primeira vez. O modelo AKI foi estabelecido pela injeção de D. acutus veneno na cavidade abdominal de camundongos e os potenciais efeitos protetores de PCC Carbonisata-CDs (PCCC-CDs) em anormalidades renais, incluindo disfunção, reações inflamatórias, dano tecidual e trombocitopenia em seis pontos de tempo (1, 3 e 12 h, e 1, 2 e 5 dias) foram investigados.

Resultados

Estes resultados demonstraram que PCCC-CDs inibiram significativamente a disfunção renal (redução da creatinina sérica (SCR), nitrogênio da ureia no sangue (BUN), proteína total urinária (UTP) e concentrações de microalbuminúria (MALB)) e a produção de quimioatraente (proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1)), citocinas pró-inflamatórias (interleucina (IL) -1β) e citocinas anti-inflamatórias (IL-10) em resposta à injeção intraperitoneal de D. acutus veneno. O efeito benéfico dos PCCC-CDs nos camundongos envenenados foi semelhante ao da mudança na histologia renal e trombocitopenia.

Conclusões

Estes resultados demonstraram os notáveis ​​efeitos protetores de PCCC-CDs contra AKI induzida por D. acutus veneno, que não apenas ampliaria as aplicações biomédicas de CDs, mas também forneceria um alvo potencial para o desenvolvimento de novos medicamentos terapêuticos para IRA induzida por D. acutus envenenamento por picada de cobra.

Introdução

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , pertencente à família Viperidae, é considerada uma das cobras terrestres mais perigosas da China [1]. Envenenamento por D. acutus está associado a uma série de sintomas, como hemorragia, trombocitopenia e possível dano direto ao rim [2, 3]. A lesão renal aguda (LRA) é o efeito sistêmico mais sério e complicação comum do envenenamento por D. acutus isso leva diretamente à disfunção renal persistente e alta morbidade [4, 5]. O tratamento tópico atual envolve o uso de antiveneno hiperimune derivado de cavalo como antídoto. Porém, sua eficácia é limitada em neutralizar o dano tecidual local, principalmente na ocorrência de LRA, e apresenta diversos efeitos insatisfatórios, como reações anafiláticas e pirogênicas [6]. Além disso, o custo relativamente alto e a baixa estabilidade do antiveneno também contribuem para o tratamento insatisfatório de pessoas picadas por D. acutus , especialmente nas áreas selvagens ou rurais [7,8,9]. Portanto, há uma necessidade urgente de medicamentos complementares eficazes, seguros e acessíveis para o tratamento de D. acutus AKI induzida por veneno.

Pontos de carbono (CDs), uma nova classe de nanomateriais de carbono com um tamanho <10 nm, foram descobertos por acaso por separação e purificação de nanotubos de carbono de parede única em 2004 [10] e atraíram muito interesse na última década por causa de sua notável novas propriedades, como biocompatibilidade apreciável, baixa toxicidade, alta solubilidade em água e matérias-primas abundantes [11,12,13]. O advento dos CDs contribuiu para a pesquisa sobre o desenvolvimento de vários nanossistemas “inteligentes”, principalmente aqueles para bioimagem [14], biomedicina [15], entrega de drogas [16] e fotocatálise [17].

Vale ressaltar que o desenvolvimento de CDs com potencial de bioatividade inerente fornece muitas estratégias para a descoberta de uma nova geração de medicamentos para o controle ou tratamento efetivo de algumas doenças devido às notáveis ​​vantagens acima mencionadas. Em várias bioatividades, como antibacteriana para tratar ceratite bacteriana [18], hemostática [19], semelhante à peroxidase [20], atividades anticâncer, antivirais e antiinflamatórias [21] foram relatadas. Esses efeitos têm atraído a atenção de cientistas para estudar outras aplicações farmacêuticas e biomédicas dos CDs. Especialmente, as atividades de alívio de CDs derivados de Schizonepetae Spica Carbonisata [22] em D. acutus a hemorragia induzida por veneno proporcionou uma nova perspectiva na investigação dos efeitos benéficos dos CDs na IRA induzida por D. acutus picada de cobra, que permaneceu menos compreendida até agora.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC) -CDs é sintetizado por pirólise direta de PCC (um tipo de medicina tradicional chinesa, que tem sido usado por mais de 1000 anos) usando um tratamento de pirólise em uma etapa. PCCC-CDs são CDs hipotóxicos que variam em diâmetro de 1,2 a 4,8 nm. Foi relatado que PCCC-CDs possuem efeitos hemostáticos notáveis, o que não apenas ampliou a aplicação biomédica de CDs, mas também foi pioneiro na elucidação da base de material hemostático de PCCC [23]. Digno de nota, PCCC, um medicamento tradicional chinês preparado por processamento de carvão, foi registrado pela primeira vez nas Taiping Holy Prescriptions for Universal Relief (978-992 DC, na China). O perfil de segurança e eficácia terapêutica satisfatória do PCCC, como hemostasia e antiinflamatório, encorajou sua aplicação clínica contínua por mais de 1000 anos, o que foi reconhecido na Farmacopéia da República Popular da China (PPRC, 2015). No entanto, o estudo de bioatividades subjacentes adicionais de PCCC-CDs tem sido um desafio. Especialmente, há pouca informação sobre a inibição de AKI induzida por D. acutus envenenamento.

Além disso, foi relatado que o envenenamento por picada de cobra possivelmente compromete a fisiologia renal diretamente por meio dos componentes nefrotóxicos ou pela ativação ou modulação de mediadores imunológicos e inflamatórios [24]. Esses efeitos são principalmente sobre os parâmetros biomédicos [25] (creatinina sérica (SCR), nitrogênio ureico no sangue (BUN), proteína total urinária (UTP) e concentração de microalbuminúria (MALB)), citocinas inflamatórias (interleucina (IL) -1β), citocina antiinflamatória (IL-10) e proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1), a alteração na histologia renal e contagem de plaquetas (PLT). No presente estudo, sintetizamos PCCC-CDs usando um método de pirólise verde em uma etapa e, pela primeira vez, investigamos seus efeitos protetores contra o desenvolvimento dessas anormalidades em AKI induzida por injeção intraperitoneal de camundongos com D. acutus veneno.

Material e métodos

Químicos

O material PCC foi adquirido da Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Pequim, China), e o PCCC foi preparado em nosso laboratório. Membranas de diálise com um peso molecular de 1000 Da foram adquiridas de Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Pequim, China). O kit de contagem de células (CCK) -8 foi adquirido na Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japão). O veneno de cobra liofilizado de D. acutus foi fornecido por An Ren Snake Farm (Yujiang County, Yingtan, Jiangxi, China) para uso experimental. Outros reagentes químicos de grau analítico foram obtidos na Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Pequim, China). Os kits de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) de camundongo MCP-1, IL-10 e IL-1β foram adquiridos em Cloud-Clone Crop. (Wuhan, China). Todos os experimentos foram realizados com água deionizada (DW).

Animais

O manejo animal e os protocolos de pesquisa foram apoiados e aprovados pelo Comitê Institucional de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Camundongos Kunming machos (pesando 30,0 ± 2,0 g) foram adquiridos de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., com um certificado de conformidade de animal de laboratório, e foram mantidos em gaiolas a temperatura e umidade constantes em uma luz de 12 h / ciclo escuro com ad libitum acesso a alimentos e água.

Preparação da solução de veneno

O veneno liofilizado foi dissolvido em solução salina normal com mistura moderada por 20 min (concentração final:5 mg / mL) e armazenado a -20 ° C até ser necessário.

Preparação de PCCC-CDs

O PCCC foi preparado usando um método de pirólise de uma etapa com PCC como o único precursor de acordo com métodos anteriores [23]. Resumidamente, as amostras de PCC foram colocadas em cadinhos de porcelana separados e aquecidas por 1 h a 350 ° C em um forno pré-aquecido. Após resfriamento a 30 ° C, os resíduos pretos homogêneos obtidos foram moídos em pó fino e fervidos duas vezes em água, ambos a 100 ° C por 1 h por vez. Em seguida, a solução foi coletada através da pré-filtragem da suspensão através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 μm. Impurezas não carbonosas foram removidas por diálise contra DW por 72 h (peso molecular retido:1000 Da). A solução PCCC-CDs foi concentrada e armazenada a 4 ° C até o uso. O diagrama de fluxo na Fig. 1 ilustra o processo acima.

Ilustração do processo de formação de pontos de carbono (CDs) de Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) por tratamento de pirólise

Caracterização de PCCC-CDs

A morfologia dos CDs foi estudada usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEM-2100 elétron, JEOL, Japão) com energia eletrônica de 200 kV. Detalhes estruturais foram examinados usando TEM de alta resolução (HRTEM) usando um microscópio eletrônico Tecnai G2 20 (FEI, EUA). O espectro ultravioleta-visível (UV-Vis) e as propriedades de fluorescência foram registrados e medidos usando espectroscopia de UV-Vis (CECIL, Cambridge, Reino Unido) e fluorescência (F-4500, Tóquio, Japão), respectivamente. A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi usada para analisar as informações dos grupos funcionais de superfície em uma janela espectral entre 400 e 4000 cm ^{- 1} .

Ensaios de citotoxicidade

Hepatócito L02 humano e linhas de células T 293 de rim embrionário humano foram usados ​​para avaliar a potencial citotoxicidade de PCCC-CDs usando um ensaio de CCK-8. As células L02 foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), enquanto as células 293 T foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose, contendo 10% de FBS. Ambas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C em 5% CO umidificado ₂ .

Células T L02 e 293 foram semeadas a uma densidade de 2,0 × 10 ⁴ células / poço em placas de 96 poços e cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO ₂ por 24 h. Em seguida, ambos os tipos de células foram tratados com 100 μL de diferentes concentrações (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 e 19,5 μg / mL) das soluções de PCCC-CD em meio isento de soro e foram incubados por mais 24 h. Posteriormente, o meio contendo os PCCC-CDs foi removido e as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes. A citotoxicidade foi determinada pela leitura da placa a 450 nm imediatamente após a adição de 10 μL do reagente CCK-8 e incubação por 4 h a 37 ° C.

D. acutus LRA induzida por veneno e tratamento

D. acutus Modelo AKI induzido por veneno

O modelo de camundongo AKI foi estabelecido pela injeção intraperitoneal de camundongos com D. acutus veneno de cobra. Os ratos foram divididos aleatoriamente nos seguintes cinco grupos de 36 animais cada:controle; modelo; e grupos de tratamento de PCCC-CDs de alta, média e baixa dose. O grupo modelo recebeu D. acutus veneno a 1 mg / kg (0,15 mg / mL, 0,2 mL) de peso corporal e 0,5 mL de solução salina normal intraperitonealmente, enquanto os grupos de tratamento de PCCC-CD de alta, média e baixa dose receberam um volume equivalente de veneno de cobra e PCCC -CD extrato em doses de 8,0, 4,0 e 2,0 mg / kg, respectivamente. Os camundongos injetados por via intraperitoneal apenas com solução salina normal (NS) serviram como controles. Seis camundongos de cada grupo foram sacrificados 1, 3 e 12 h após a administração de NS, D. acutus veneno e PCCC-CDs no cronograma descrito acima, enquanto camundongos sacrificados nos dias 1, 2 e 5 foram administrados continuamente com NS, D. acutus veneno de cobra e PCCC-CDs duas vezes ao dia.

Análise de concentrações de UTP e MALB

Após a administração dos respectivos tratamentos, os animais dos grupos controle, modelo e tratados com PCCC-CDs (4,0 mg / kg) foram imediatamente colocados em gaiolas metabólicas apropriadas para coleta de urina até o término do período de incubação (24 h). As concentrações de UTP e MALB foram analisadas por meio de um analisador bioquímico automático.

Análise de biomarcadores da função renal

A função renal foi avaliada medindo os níveis de SCR e BUN. Antes de os camundongos serem sacrificados, amostras de sangue foram retiradas do plexo retro-orbital e colocadas em tubos de plástico por pelo menos 4 horas a 4 ° C. O soro foi obtido por centrifugação a 750 × g por 15 min, e os níveis de BUN e SCR foram analisados ​​usando um analisador bioquímico automático.

Detecção de níveis de citocinas inflamatórias

Os rins direitos dos camundongos foram removidos, rapidamente congelados em gelo seco e armazenados a -80 ° C até o uso nos procedimentos a seguir. Amostras de tecido (100 mg) dos diferentes grupos foram homogeneizadas com PBS em gelo e, em seguida, centrifugadas a 750 × g por 15 min. Os sobrenadantes foram coletados para determinar os níveis de MCP-1, IL-10 e IL-1β usando os respectivos kits de ELISA de acordo com as instruções do fabricante.

Histologia do rim

As amostras de tecido de rim esquerdo de camundongo foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% a 4 ° C por mais de 48 h, desidratadas, incluídas em parafina, cortadas em seções e, em seguida, coradas com hematoxilina e eosina (H&E). As mudanças morfológicas foram comparadas entre os grupos controle, modelo e tratados com PCCC-CDs.

Atividade trombocitopênica

O PLT foi realizado em sangue retirado dos camundongos do plexo retro-orbital e detectado usando um analisador hematológico automatizado (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japão).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada por meio do Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, versão 13.0). Os dados normalmente distribuídos e as variâncias homogêneas são expressos como média ± desvio padrão (DP). Uma análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste de diferença mínima significativa (LSD) foi usada para comparações múltiplas. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização de PCCC-CDs

TEM foi usado para observar diretamente a morfologia e distribuição de tamanho de PCCC-CDs (Fig. 2a, c e d). Os CDs preparados eram esféricos e uniformes em tamanho, com no máximo 2,84 ± 0,89 nm sem agregações distintas. A imagem HRTEM mostrou franjas de rede (0,24 nm) dos CDs, que correspondiam ao carbono grafítico, conforme mostrado na Fig. 2b.

a e c Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de pontos de carbono Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CDs), b Imagem TEM de alta resolução de PCCC-CDs, d Distribuição de tamanho de PCCC-CDs

Como representado na Fig. 3a, os CDs exibiram fluorescência distintamente azul com um pico máximo a 445 nm após excitação de 370 nm. Consequentemente, a informação óptica nos PCCC-CDs exibidos no espectro UV-Vis mostrou um forte pico de absorção em 265 nm correspondendo à transição π-π * de moléculas orgânicas conjugadas nas superfícies dos CDs (Fig. 3b).

Propriedades ópticas de pontos de carbono Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CDs). a Espectro de fluorescência, b espectro ultravioleta-visível (UV-Vis) e c Espectro infravermelho da transformada de Fourier (FTIR)

Além disso, os grupos funcionais dos CDs formulados foram identificados com base no espectro de FTIR em detalhes, conforme representado na Fig. 3c. O pico em 3433 cm ^{- 1} foi atribuído às bandas de absorção de vibrações de alongamento O – H e N – H, enquanto as vibrações de alongamento C – H apareceram em 2923 cm ^{- 1} e 2853 cm ^{- 1} . Além disso, o pico de absorção em 1624 cm ^{- 1} indicou a presença de C =O. Ligações C – O – C foram observadas em 1109 cm ^{- 1} , e o pico em 1400 cm ^{- 1} foi atribuído ao alongamento C – N. Essas descobertas foram consistentes com as de relatórios anteriores.

Citotoxicidade in vitro

Para avaliar a citotoxicidade, as células L02 e 293 T foram expostas a várias concentrações de PCCC-CDs por 24 horas e a viabilidade foi examinada usando o ensaio CCK-8. Conforme ilustrado na Fig. 4a, a viabilidade das células L02 tratadas com PCCC-CDs foi> 85% em comparação com as células de controle, mesmo em uma concentração tão alta quanto 5 mg / mL. Da mesma forma, os PCCC-CDs não afetaram o crescimento de células 293 T em concentrações de até aproximadamente 2500 μg / mL (Fig. 4b). Esses resultados indicaram que os PCCC-CDs apresentaram baixa citotoxicidade.

Viabilidade celular pelo ensaio de CCK-8 de ( a ) Células L02 e ( b ) Células 293 T incubadas com PCCC-CDs por 4 h

Efeito dos PCCC-CDs nas concentrações UTP e MALB

Comparado com o nível de UTP no grupo controle (0,98 ± 0,38 mg / L), os níveis de UTP aumentaram significativamente no D. acutus tratado com veneno (3,08 ± 0,92 mg / L, P <0,01) e PCCC-CDs (2,36 ± 0,83 mg / L, P <0,05) grupos (Fig. 5a). Além disso, o nível de UTP diminuiu após o tratamento com PCCC-CD em comparação com os níveis após a administração de veneno ( P <0,05). Além disso, o nível de MALB obviamente aumentou 24 h após a injeção intraperitoneal de D. acutus veneno (17,78 ± 5,96 mg / L, P <0,01) em comparação ao grupo controle (2,02 ± 0,91 mg / L). Em contraste, os camundongos tratados com PCCC-CD mostraram uma tendência de diminuição no nível de MALB (14,25 ± 4,16 mg / L, Fig. 5b).

Efeitos de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-pontos de carbono (PCCC-CDs) na proteína urinária total (UTP) e microalbuminúria (MALB) na urina. a UTP e b MALB. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e PCCC-CDs (4 mg / kg) + Dav (1 mg / kg). Os dados são representados como média ± DP de seis animais de cada grupo. * p < 0,05 e ** p < 0,01 em comparação com o grupo controle tratado com NS. ^# p < 0,05 em comparação com o grupo Dav

PCCC-CDs com Disfunção Renal Aliviada em D. acutus Ratos AKI induzidos por veneno

A função renal foi avaliada medindo os níveis de BUN e SCR, que são mostrados nas Figs. 6 e 7. Os ratos tratados com D. acutus o veneno apresentou níveis significativamente mais elevados de BUN (12,07 ± 1,00 mmol / L [1 dia], P <0,01; 11,43 ± 1,37 mmol / L [2 dias], P <0,01; 14,83 ± 2,53 mmol / L [5 dias], P <0,01) e SCR (12,83 ± 1,43 μmol / L [1 dia], P <0,01; 13,48 ± 2,26 μmol / L [2 dias]; P <0,01. 13,80 ± 1,90 μmol / L [5 dias], P <0,01) do que os camundongos tratados com NS (BUN:8,95 ± 1,04 [1 dia], 9,53 ± 1,40 [2 dias] e 9,07 ± 1,57 [5 dias] mmol / L; SCR:9,40 ± 0,89 [1 dia] , 10,27 ± 2,04 [2 dias] e 9,85 ± 1,99 [5 dias] μmol / L) do dia 1 ao 5 (Figs. 6a e 7a). Digno de nota, em comparação com o grupo modelo, o tratamento com baixa dose de PCCC-CDs inibiu significativamente o aumento dos níveis de SCR (9,77 ± 0,79 μmol / mL, P <0,01) e BUN (10,50 ± 1,38 mmol / L, P <0,05), enquanto alto (9,62 ± 1,87 μmol / mL, P <0,01) e meio (10,75 ± 1,48 μmol / mL, P <0,05) as doses inibiram o aumento na SCR (Fig. 7b), mas não BUN (Fig. 6b) induzido por D. acutus veneno no dia 1. Os níveis de SCR (Fig. 7c) dos grupos tratados com PCCC-CD de alta, média e baixa dose diminuíram (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 e 10,68 ± 1,41 μmol / mL, respectivamente; P <0,05) do que no grupo modelo no dia 2. Além disso, em comparação com o grupo modelo, os níveis de BUN diminuíram significativamente na alta- (9,57 ± 0,52 mmol / L, P <0,01) e dose baixa (10,72 ± 2,04 mmol / L, P <0,05) grupo PCCC-CDs, mas não o grupo de dose média (Fig. 6c) no dia 2. Como mostrado nas Figs. 6d e 7d, efeitos inibitórios foram observados nos níveis de ambos os índices em alta (12,28 ± 1,65 mmol / L, P <0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol / mL, P <0,05 (SCR), respectivamente) e meio (12,40 ± 1,33 mmol / L, P <0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol / mL, P <0,05 (SCR), respectivamente) doses de PCCC-CDs. Além disso, nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos controle e tratados com PCCC-CDs no SCR.

Efeitos de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - pontos de carbono (PCCC-CDs) no nitrogênio da uréia no sangue (BUN). a A concentração de BUN muda em 1 h, 3 h, 12 h, 1 dia, 2 dias e 5 dias. Os níveis de BUN em ( b ) 1 dia ( c ) 2 dias ( d ) 5 dias. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e altas (H), médias (M) e baixas (L) doses de PCCC-CDs + Dav (1 mg / kg). Os dados são representados como média ± DP de seis animais de cada grupo. * p < 0,05 e ** p < 0,01 em comparação com o grupo controle tratado com NS. ^# p < 0,05 em comparação com o grupo Dav

Efeitos dos pontos de carbono do Cortex Carbonisata de Phellodendri Chinensis (PCCC-CDs) na creatinina sérica (SCR). a A concentração de SCR muda em 1 h, 3 h, 12 h, 1 dia, 2 dias e 5 dias. Os níveis de SCR em ( b ) 1 dia ( c ) 2 dias ( d ) 5 dias. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e doses altas (H), médias (M) e baixas (L) de PCCC-CDs + Dav (1 mg / kg). Os dados são representados como média ± DP de seis animais de cada grupo. * p < 0,05 e ** p < 0,01 em comparação com o grupo controle tratado com solução salina normal (NS). ^# p < 0,05 em comparação com o grupo Dav

Secreção de citocinas inibida por PCCC-CDs

Os efeitos de três concentrações de PCCC-CDs na produção de citocinas quimioatraentes (MCP-1) e pró-inflamatórias (IL-1β) e antiinflamatórias (IL-10) em resposta a injeções de D. acutus veneno foram investigados. A Figura 8 mostrou que a injeção de veneno aumentou a IL-1β liberada no modelo de camundongo (1 h:58,19 ± 5,35 ng / mL, P <0,01; 3 h:56,57 ± 3,54 ng / mL, P <0,01; 12 h:49,48 ± 7,74 ng / mL, P <0,05; dia 1:41,09 ± 4,82 ng / mL, P <0,05; dia 2:47,96 ± 8,33 ng / mL, P <0,05; dia 5:45,11 ± 6,95 ng / mL, P <0,05) em comparação com os níveis no camundongo tratado com NS (1 h:35,96 ± 4,72 ng / mL, 3 h:34,94 ± 2,58 ng / mL, 12 h:36,42 ± 5,25 ng / mL, dia 1:34,47 ± 3,67 ng / mL, dia 2:39,84 ± 3,71 ng / mL, dia 5:36,82 ± 8,27 ng / mL). Conforme mostrado na Fig. 8b-d, comparação com D. acutus grupo induzido por veneno mostrou que exposição de 1, 3 e 12 h a alta (50,09 ± 7,68 ng / mL, P <0,05 [1 h]; 40,36 ± 8,51 ng / mL, P <0,01 [3 h]; 39,87 ± 4,64 ng / mL, P <0,05 [12 h], respectivamente) e baixo- (46,64 ± 3,83 ng / mL, P <0,01 [1 h]; 37,65 ± 9,61 ng / mL, P <0,01 [3 h]; 38,75 ± 6,64 ng / mL, P <0,05 [12 h], respectivamente) a dose de PCCC-CDs diminui significativamente os níveis de IL-1β. Além disso, os PCCC-CDs de dose média reduziram significativamente o nível de IL-1β (41,50 ± 11,08 ng / mL, P <0,01) em comparação com o de camundongos tratados com veneno em 3 h, mas não em outros pontos de tempo.

Efeitos dos pontos de carbono do Cortex Carbonisata de Phellodendri Chinensis (PCCC-CDs) no nível de IL-1β no tecido renal. a O nível de IL-1β muda em 1 h, 3 h, 12 h, 1 dia, 2 dias e 5 dias. Níveis de IL-1β em ( b ) 1 h, ( c ) 3 h, ( d ) 12 h, ( e ) 1 dia, ( f ) 2 dias, e ( g ) 5 dias. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e doses altas (H), médias (M) e baixas (L) de PCCC-CDs + Dav (1 mg / kg). Os dados são representados como média ± DP de seis animais de cada grupo. * p <0,05 e ** p <0,01 em comparação com o grupo controle tratado com solução salina normal (NS). ^# p < 0,05 em comparação com o grupo Dav

Os níveis da citocina antiinflamatória IL-10 aumentaram dramaticamente no D. acutus grupo tratado com veneno em diferentes pontos de tempo (23,27 ± 0,72 ng / mL, P <0,01; 22,03 ± 0,96 ng / mL, P <0,05; 21,76 ± 1,99 ng / mL, P <0,05; 26,31 ± 6,55 ng / mL, P <0,01; 3 h, 12 h, dia 1 e dia 2, respectivamente) em comparação com o grupo tratado com NS (Fig. 9). Em nítido contraste, o tratamento com PCCC-CDs de alta e média dose (17,17 ± 4,04 e 17,25 ± 5,64 ng / mL, respectivamente, ambos P <0,05) inibiu a secreção induzida por veneno de IL-10 em 3 h, enquanto PCCC-CDs de baixa dosagem inibiram os níveis em 3 h, 12 h e dia 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 e 18,31 ± 2,14 ng / mL, respectivamente, todos P <0,05). Nenhuma diferença significativa foi observada entre o grupo tratado com PCCC-CDs e o grupo NS.

Efeitos dos pontos de carbono do Cortex Carbonisata de Phellodendri Chinensis (PCCC-CDs) no nível de IL-10 no tecido renal. a O nível de IL-10 muda em 1 h, 3 h, 12 h, 1 dia, 2 dias e 5 dias. O nível de IL-10 em ( b ) 1 h, ( c ) 3 h, ( d ) 12 h, ( e ) 1 dia, ( f ) 2 dias e ( g ) 5 dias. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e doses altas (H), médias (M) e baixas (L) de PCCC-CDs + Dav (1 mg / kg). Os dados são representados como média ± DP de seis animais de cada grupo. * p <0,05 e ** p <0,01 em comparação com o grupo controle tratado com solução salina normal (NS). ^# p < 0,05 em comparação com o grupo Dav

Além disso, a Fig. 10 mostra que a injeção de D. acutus o veneno aumentou significativamente a liberação de MCP-1 no grupo modelo (1 h:197,45 ± 22,34 ng / mL, P <0,01; 3 h:182,42 ± 12,94 ng / mL, P <0,01; 12 h:169,20 ± 26,74 ng / mL, P <0,01; 24 h:142,81 ± 25,85 ng / mL, P <0,05) em comparação com o controle tratado com NS (1 h:115,82 ± 14,80 ng / mL; 3 h:106,46 ± 13,76 ng / mL; 12 h:120,35 ± 15,75 ng / mL; e 24 h:108,81 ± 25,60 ng / mL). Mais notável, o tratamento de camundongos envenenados com as três doses de PCCC-CD inibiu o aumento nos níveis de MCP-1. O meio- (3 h:136,84 ± 39,94 ng / mL, P <0,01; 12 h:127,48 ± 13,75 ng / mL, P <0,01) e baixo- (1 h:152,13 ± 18,89 ng / mL, P <0,05; 3 h:129,54 ± 30,85 ng / mL, P <0,01; 12 h:118,75 ± 19,96 ng / mL, P <0,01) dose de PCCC-CDs inibiu o aumento dos níveis de MCP-1 em 1, 3 e 12 h, exceto para dose média, em 1 h (178,20 ± 22,79 ng / mL). O tratamento com alta dose de PCCC-CDs diminuiu efetivamente no nível de MCP-1 apenas em 3 h (131,42 ± 24,62 ng / mL, P <0,01).

Efeitos dos pontos de carbono do Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CDs) no nível de MCP-1 no tecido renal. a O nível de MCP-1 muda em 1 h, 3 h, 12 h, 1 dia, 2 dias e 5 dias. Níveis de MCP-1 em ( b ) 1 h, ( c ) 3 h, ( d ) 12 h, ( e ) 1 dia, ( f ) 2 dias, e ( g ) 5 dias. Os camundongos foram tratados com solução salina normal (NS), D.acutus veneno (Dav, 1 mg / kg) e doses altas (H), médias (M) e baixas (L) de PCCC-CDs + Dav (1 mg / kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p  < 0.05 and ** p  < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10 ⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10 ⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10 ⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10 ⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10 ⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10 ⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10 ⁹ , P  < 0.01; 3 h:[315 ± 77] × 10 ⁹ , P < 0.01; 12 h:[435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.01; day 1:[663 ± 226] × 10 ⁹ , P < 0.01; day 2:[941 ± 248] × 10 ⁹ , P <0,05; day 5:[1083 ± 89] × 10 ⁹ ) Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10 ⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10 ⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10 ⁹ , P <0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. a PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p  < 0.05 and ** p  < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Disponibilidade de dados e materiais

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Abreviações

AKI:

Acute kidney injury

BUN:

Blood urea nitrogen

CDs:

Pontos de carbono

D. acutus :

Deinagkistrodon acutus

HE:

Haematoxylin and eosin

IL:

Interleukin

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Monocyte chemotactic protein 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots

PLT:

Platelet counts

SCR:

Serum creatinine

UTP:

Urinary total protein

Nanocompósitos à base de lítio ativados por Li2RuO3 para novos materiais catódicos enraizados na reação redox de oxigênio Eficiência de aquecimento de nanopartículas magnéticas cilíndricas de estado de triplo vórtice