Pontos de Carbono Derivados de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata Protegem Rins contra Lesão Renal Aguda Induzida por Veneno de Deinagkistrodon acutus

Resumo

Contexto

Como um nanomaterial emergente, os pontos de carbono (CDs) têm sido foco de tremenda atenção para aplicações biomédicas. No entanto, pouca informação está disponível sobre sua bioatividade de inibir lesão renal aguda (AKI) induzida por veneno de cobra.

Métodos

Este estudo relata o desenvolvimento de um processo verde de pirólise em uma etapa para sintetizar CDs usando Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) como único precursor, e seu potencial de aplicação como protetor contra AKI induzida por veneno de Deinagkistrodon acutus (D. acutus) foi investigado pela primeira vez. O modelo de AKI foi estabelecido injetando veneno de D. acutus na cavidade abdominal de camundongos e os potenciais efeitos protetores de CDs de PCC Carbonisata (PCCC-CDs) sobre anormalidades renais incluindo disfunção, reações inflamatórias, danos teciduais e trombocitopenia em seis pontos de tempo (1, 3 e 12 h, e 1, 2 e 5 dias) foram investigados.

Resultados

Estes resultados demonstraram que os PCCC-CDs inibiram significativamente a disfunção renal (reduziram concentrações de creatinina sérica (SCR), nitrogênio ureico sanguíneo (BUN), proteína urinária total (UTP) e microalbuminúria (MALB)) e a produção de quimioatrativo (proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1)), citocinas pró-inflamatórias (interleucina (IL)-1β) e citocina anti-inflamatória (IL-10) em resposta à injeção intraperitoneal de veneno de D. acutus. O efeito benéfico dos PCCC-CDs nos camundongos envenenados foi semelhante ao da mudança na histologia renal e trombocitopenia.

Conclusões

Estes resultados demonstraram os notáveis efeitos protetores dos PCCC-CDs contra AKI induzida por veneno de D. acutus, o que não apenas ampliaria as aplicações biomédicas dos CDs, mas também forneceria um alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos terapêuticos para AKI induzida por envenenamento por picada de cobra D. acutus.

Introdução

Deinagkistrodon acutus (D. acutus), pertencente à família Viperidae, é considerada uma das cobras terrestres mais perigosas na China [1]. O envenenamento por D. acutus está associado a uma série de sintomas como hemorragia, trombocitopenia e possível dano direto ao rim [2, 3]. A lesão renal aguda (AKI) é o efeito sistêmico mais grave e complicação comum do envenenamento por D. acutus que leva diretamente a disfunção renal persistente e alta morbidade [4, 5]. O tratamento tópico atual envolve o uso de antiveneno hiperimune derivado de cavalo como antídoto. No entanto, sua eficácia é limitada na neutralização de danos teciduais locais, especialmente na ocorrência de AKI, e tem vários efeitos insatisfatórios, como reações anafiláticas e pirogênicas [6]. Além disso, o custo relativamente alto e a baixa estabilidade do antiveneno também contribuem para o tratamento insatisfatório de pessoas picadas por D. acutus, especialmente em áreas selvagens ou rurais [7-9]. Portanto, há uma necessidade urgente de medicamentos complementares eficazes, seguros e acessíveis para o tratamento de AKI induzida por veneno de D. acutus.

Pontos de carbono (CDs), uma nova classe de nanomateriais de carbono com tamanho < 10 nm, foram descobertos fortuitamente pela separação e purificação de nanotubos de carbono de parede única em 2004 [10] e atraíram muito interesse na última década devido às suas notáveis propriedades novas, como apreciável biocompatibilidade, baixa toxicidade, alta solubilidade em água e matérias-primas abundantes [11-13]. O advento dos CDs contribuiu para a pesquisa no desenvolvimento de vários nanossistemas "inteligentes", principalmente incluindo aqueles para bioimagem [14], biomedicina [15], liberação de fármacos [16] e fotocatálise [17].

Notavelmente, o desenvolvimento de CDs com potencial bioativo inerente fornece muitas estratégias para a descoberta de uma nova geração de fármacos para o controle efetivo ou tratamento de algumas doenças devido às vantagens notáveis mencionadas. Em várias bioatividades, como antibacteriana para tratar ceratite bacteriana [18], hemostática [19], do tipo peroxidase [20], anticancerígena, antiviral e anti-inflamatória [21] foram relatadas. Esses efeitos atraíram a atenção de cientistas para estudar aplicações farmacêuticas e biomédicas adicionais dos CDs. Especialmente, as atividades aliviadoras de CDs derivados de Schizonepetae Spica Carbonisata [22] sobre hemorragia induzida por veneno de D. acutus forneceram uma nova perspectiva sobre a investigação dos efeitos benéficos dos CDs sobre AKI induzida por picada de cobra D. acutus, que permaneceu menos compreendida até agora.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CDs é sintetizado por pirólise direta de PCC (um tipo de medicina tradicional chinesa, usada há > 1000 anos) usando um tratamento de pirólise em uma etapa. Os PCCC-CDs são CDs hipotoxicos variando em diâmetro de 1,2 a 4,8 nm. Relatou-se que os PCCC-CDs possuem notáveis efeitos hemostáticos, o que não apenas ampliou a aplicação biomédica dos CDs, mas também pioneirou a elucidação da base material hemostática do PCCC [23]. Notavelmente, PCCC, uma medicina tradicional chinesa preparada por processamento com carvão, foi registrada pela primeira vez nas Prescrições Sagradas de Taiping para Alívio Universal (978-992 d.C., na China). O perfil de segurança e eficácia terapêutica satisfatória do PCCC, como hemostasia e anti-inflamação, encorajaram sua aplicação clínica contínua por mais de 1000 anos, o que foi reconhecido na Farmacopeia da República Popular da China (PPRC, 2015). No entanto, o estudo de bioatividades subjacentes adicionais dos PCCC-CDs tem sido um desafio. Especialmente, há pouca informação sobre a inibição de AKI induzida por envenenamento de D. acutus.

Além disso, o envenenamento por picada de cobra foi relatado como podendo comprometer diretamente a fisiologia renal através de componentes nefrotóxicos ou pela ativação ou modulação de mediadores imunes e inflamatórios [24]. Esses efeitos são principalmente em parâmetros biomédicos [25] (concentrações de creatinina sérica (SCR), nitrogênio ureico sanguíneo (BUN), proteína urinária total (UTP) e microalbuminúria (MALB)), citocinas inflamatórias (interleucina (IL)-1β), citocina anti-inflamatória (IL-10) e proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1), a mudança na histologia renal e contagem de plaquetas (PLT). No presente estudo, sintetizamos PCCC-CDs usando um método verde de pirólise em uma etapa e, pela primeira vez, investigamos seus efeitos protetores contra o desenvolvimento dessas anormalidades em AKI induzida por injeção intraperitoneal de camundongos com veneno de D. acutus.

Materiais e Métodos

Químicos

O material PCC foi comprado da Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China), e o PCCC foi preparado em nosso laboratório. Membranas de diálise com peso molecular de 1000 Da foram compradas da Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). O kit de contagem celular (CCK)-8 foi comprado da Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japão). O veneno de cobra liofilizado de D. acutus foi fornecido pela An Ren Snake Farm (Condado de Yujiang, Yingtan, Jiangxi, China) para uso experimental. Outros reagentes químicos de grau analítico foram obtidos da Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China). Kits de ensaio imunoabsorvente enzimático (ELISA) para MCP-1, IL-10 e IL-1β de camundongo foram comprados da Cloud-Clone Corp. (Wuhan, China). Todos os experimentos foram realizados usando água deionizada (DW).

Animais

O manejo animal e protocolos de pesquisa foram apoiados e aprovados pelo Comitê Institucional de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Camundongos machos Kunming (pesando 30,0 ± 2,0 g) foram comprados da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., com certificado de conformidade de animal de laboratório, e foram mantidos em gaiolas a temperatura e umidade constantes em um ciclo luz/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimento e água.

Preparação da Solução de Veneno

O veneno liofilizado foi dissolvido em soro fisiológico com mistura suave por 20 min (concentração final: 5 mg/mL) e armazenado a -20 °C até necessário.

Preparação dos PCCC-CDs

O PCCC foi preparado usando um método de pirólise em uma etapa com PCC como único precursor de acordo com métodos anteriores [23]. Brevemente, as amostras de PCC foram colocadas em crisóis de porcelana separados e aquecidas por 1 h a 350 °C em um forno pré-aquecido. Após resfriar a 30 °C, os resíduos pretos homogêneos obtidos foram moídos em pó fino e fervidos duas vezes em água a 100 °C por 1 h cada vez. Então, a solução foi coletada por pré-filtração da suspensão através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 μm. Impurezas não carbonáceas foram removidas por diálise contra DW por 72 h (peso molecular retido: 1000 Da). A solução de PCCC-CDs foi concentrada e armazenada a 4 °C até o uso. O diagrama de fluxo na Fig. 1 ilustra o processo acima.

Caracterização dos PCCC-CDs

A morfologia dos CDs foi estudada usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM, JEM-2100 eletrônico, JEOL, Japão) com energia de elétrons de 200 kV. Detalhes estruturais foram examinados usando TEM de alta resolução (HRTEM) usando um microscópio eletrônico Tecnai G2 20 (FEI, EUA). O espectro ultravioleta-visível (UV-Vis) e propriedades de fluorescência foram registrados e medidos usando espectroscopia UV-Vis (CECIL, Cambridge, Reino Unido) e fluorescência (F-4500, Tóquio, Japão), respectivamente. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi usada para analisar informações de grupos funcionais de superfície em uma janela espectral entre 400 e 4000 cm⁻¹.

Ensaio de Citotoxicidade

Linhagens de células de hepatócitos humanos L02 e células renais embrionárias humanas 293 T foram usadas para avaliar a potencial citotoxicidade dos PCCC-CDs usando ensaio CCK-8. Células L02 foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contendo 10% soro fetal bovino (FBS), enquanto células 293 T foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) com alta glicose, contendo 10% FBS. Ambas as linhagens celulares foram incubadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% CO₂.

Células L02 e 293 T foram semeadas a uma densidade de 2,0 × 10⁴ células/poço em placas de 96 poços e cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% CO₂ por 24 h. Então, ambos os tipos de células foram tratados com 100 μL de diferentes concentrações (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 e 19,5 μg/mL) das soluções de PCCC-CDs em meio livre de soro e incubadas por mais 24 h. Subsequentemente, o meio contendo os PCCC-CDs foi removido e as células foram lavadas com solução salina fosfato-bufferizada (PBS) duas vezes. A citotoxicidade foi determinada pela leitura da placa a 450 nm imediatamente após adicionar 10 μL do reagente CCK-8 e incubar por 4 h a 37 °C.

AKI Induzida por Veneno de D. acutus e Tratamento

Modelo de AKI Induzido por Veneno de D. acutus

O modelo de AKI em camundongos foi estabelecido injetando intraperitonealmente camundongos com veneno de cobra D. acutus. Os camundongos foram randomicamente divididos nos seguintes cinco grupos de 36 animais cada: controle; modelo; e grupos de tratamento com PCCC-CDs em alta, média e baixa dose. O grupo modelo recebeu veneno de D. acutus a 1 mg/kg (0,15 mg/mL, 0,2 mL) de peso corporal e 0,5 mL de soro fisiológico intraperitonealmente, enquanto os grupos de tratamento com PCCC-CDs em alta, média e baixa dose receberam volume equivalente de veneno de cobra e extrato de PCCC-CDs nas doses de 8,0, 4,0 e 2,0 mg/kg, respectivamente. Camundongos injetados intraperitonealmente apenas com soro fisiológico (NS) serviram como controles. Seis camundongos de cada grupo foram sacrificados 1, 3 e 12 h após administração de NS, veneno de D. acutus e PCCC-CDs no cronograma descrito acima, enquanto camundongos sacrificados no dia 1, 2 e 5 foram continuamente administrados com NS, veneno de cobra D. acutus e PCCC-CDs duas vezes ao dia.

Análise das Concentrações de UTP e MALB

Após a administração dos respectivos tratamentos, os animais nos grupos controle, modelo e PCCC-CDs- (4,0 mg/kg) tratados foram imediatamente colocados em gaiolas metabólicas apropriadas para coleta de urina até o término do período de incubação (24 h). As concentrações de UTP e MALB foram analisadas usando um analisador bioquímico automático.

Análise de Biomarcadores da Função Renal

A função renal foi avaliada medindo os níveis de SCR e BUN. Antes de os camundongos serem eutanasiados, amostras de sangue foram retiradas do plexo retro-orbitário e então colocadas em tubos plásticos por pelo menos 4 h a 4 °C. O soro foi obtido por centrifugação a 750×g por 15 min, e os níveis de BUN e SCR foram analisados usando um analisador bioquímico automático.

Detecção de Níveis de Citocinas Inflamatórias

Os rins direitos dos camundongos foram removidos, rapidamente congelados em gelo seco e armazenados a -80 °C até o uso nos procedimentos a seguir. Amostras de tecido (100 mg) dos diferentes grupos foram homogeneizadas com PBS no gelo e então centrifugadas a 750×g por 15 min. Os sobrenadantes foram coletados para determinar níveis de MCP-1, IL-10 e IL-1β usando respectivos kits ELISA de acordo com as instruções do fabricante.

Histologia Renal

Amostras de tecido renal esquerdo dos camundongos foram fixadas em formalina neutra bufferizada a 10% a 4 °C por mais de 48 h, desidratadas, incluídas em parafina, cortadas em seções e então coradas com hematoxilina e eosina (H&E). Mudanças morfológicas foram comparadas entre os grupos controle, modelo e PCCC-CDs-tratados.

Atividade Trombocitopênica

O PLT foi realizado em sangue retirado dos camundongos do plexo retro-orbitário e detectado usando um analisador hematológico automatizado (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japão).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, versão 13.0). Dados normalmente distribuídos e variâncias homogêneas são expressos como médias ± desvio padrão (DP). Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de diferença mínima significativa (LSD) foi usada para comparações múltiplas. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Caracterização dos PCCC-CDs

TEM foi usado para observar diretamente a morfologia e distribuição de tamanho dos PCCC-CDs (Fig. 2a, c e d). Os CDs preparados eram esféricos e uniformes em tamanho, com a maioria em 2,84 ± 0,89 nm sem agregações distintas. A imagem de HRTEM mostrou franjas de rede (0,24 nm) dos CDs, que correspondiam a carbono grafítico como mostrado na Fig. 2b.

Como representado na Fig. 3a, os CDs exibiram fluorescência azul distinta com pico máximo em 445 nm após excitação a 370 nm. Consequentemente, a informação óptica dos PCCC-CDs exibida no espectro UV-Vis mostrou um pico de absorção forte em 265 nm correspondente à transição π-π* de moléculas orgânicas conjugadas nas superfícies dos CDs (Fig. 3b).

Além disso, os grupos funcionais dos CDs formulados foram identificados em detalhes baseados no espectro FTIR, como representado na Fig. 3c. O pico em 3433 cm⁻¹ foi atribuído às bandas de absorção de vibrações de estiramento O-H e N-H, enquanto vibrações de estiramento C-H apareceram em 2923 cm⁻¹ e 2853 cm⁻¹. Além disso, o pico de absorção em 1624 cm⁻¹ indicou a presença de C=O. Ligações C-O-C foram observadas em 1109 cm⁻¹, e o pico em 1400 cm⁻¹ foi atribuído a estiramento C-N. Esses achados foram consistentes com os de relatórios anteriores.

Citotoxicidade In Vitro

Para avaliar a citotoxicidade, células L02 e 293 T foram expostas a várias concentrações dos PCCC-CDs por 24 h e a viabilidade foi examinada usando o ensaio CCK-8. Como ilustrado na Fig. 4a, a viabilidade de células L02 tratadas com PCCC-CDs foi > 85% em comparação com a das células controle, mesmo em uma concentração tão alta quanto 5 mg/mL. Similarmente, os PCCC-CDs não afetaram o crescimento de células 293 T em concentrações de até aproximadamente 2500 μg/mL (Fig. 4b). Esses resultados indicaram que os PCCC-CDs mostraram baixa citotoxicidade.

Efeito dos PCCC-CDs nas Concentrações de UTP e MALB

Comparado com o nível de UTP no grupo controle (0,98 ± 0,38 mg/L), os níveis de UTP aumentaram significativamente no grupo tratado com veneno de D. acutus (3,08 ± 0,92 mg/L, P < 0,01) e no grupo PCCC-CDs (2,36 ± 0,83 mg/L, P < 0,05) (Fig. 5a). Além disso, o nível de UTP diminuiu após o tratamento com PCCC-CDs em comparação com os níveis após a administração do veneno (P < 0,05). Adicionalmente, o nível de MALB aumentou obviamente 24 h após injeção intraperitoneal de veneno de D. acutus (17,78 ± 5,96 mg/L, P < 0,01) em comparação ao grupo controle (2,02 ± 0,91 mg/L). Em contraste, os camundongos tratados com PCCC-CDs mostraram tendência de diminuição no nível de MALB (14,25 ± 4,16 mg/L, Fig. 5b).

PCCC-CDs Aliviaram a Disfunção Renal em Camundongos com AKI Induzida por Veneno de D. acutus

A função renal foi avaliada medindo os níveis de BUN e SCR, que são mostrados nas Figs. 6 e 7. Os camundongos tratados com veneno de D. acutus tiveram níveis significativamente mais altos de BUN (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 dia], P < 0,01; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 dias], P < 0,01; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 dias], P < 0,01) e SCR (12,83 ± 1,43 μmol/L [1 dia], P < 0,01; 13,48 ± 2,26 μmol/L [2 dias]; P < 0,01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 dias], P < 0,01) que os camundongos tratados com NS (BUN: 8,95 ± 1,04 [1 dia], 9,53 ± 1,40 [2 dias] e 9,07 ± 1,57 [5 dias] mmol/L; SCR: 9,40 ± 0,89 [1 dia], 10,27 ± 2,04 [2 dias] e 9,85 ± 1,99 [5 dias] μmol/L) do dia 1 a 5 (Figs. 6a e 7a). Notavelmente, comparado com o grupo modelo, o tratamento com PCCC-CDs em baixa dose inibiu significativamente o aumento nos níveis de SCR (9,77 ± 0,79 μmol/mL, P < 0,01) e BUN (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), enquanto doses alta (9,62 ± 1,87 μmol/mL, P < 0,01) e média (10,75 ± 1,48 μmol/mL, P < 0,05) inibiram o aumento no SCR (Fig. 7b) mas não no BUN (Fig. 6b) induzido por veneno de D. acutus no dia 1. Os níveis de SCR (Fig. 7c) dos grupos tratados com PCCC-CDs em alta, média e baixa dose diminuíram (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 e 10,68 ± 1,41 μmol/mL, respectivamente; P < 0,05) em comparação com o grupo modelo no dia 2. Além disso, comparado ao grupo modelo, os níveis de BUN diminuíram significativamente nos grupos de PCCC-CDs em alta (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) e baixa dose (10,72 ± 2,04 mmol/L, P < 0,05), mas não no grupo de média dose (Fig. 6c) no dia 2. Como mostrado nas Figs. 6d e 7d, efeitos inibitórios foram observados nos níveis de ambos os índices em doses alta (12,28 ± 1,65 mmol/L, P < 0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), respectivamente) e média (12,40 ± 1,33 mmol/L, P < 0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol/mL, P < 0,05 (SCR), respectivamente) de PCCC-CDs. Além disso, nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos controle e tratados com PCCC-CDs no SCR.

PCCC-CDs Inibiram a Secreção de Citocinas

Os efeitos de três concentrações de PCCC-CDs na produção de quimioatrativo (MCP-1) e citocinas pró-inflamatórias (IL-1β) e anti-inflamatórias (IL-10) em resposta a injeções de veneno de D. acutus foram investigados. A Figura 8 mostrou que a injeção de veneno aumentou a IL-1β liberada no modelo de camundongo (1 h: 58,19 ± 5,35 ng/mL, P < 0,01; 3 h: 56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0,01; 12 h: 49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05; dia 1: 41,09 ± 4,82 ng/mL, P < 0,05; dia 2: 47,96 ± 8,33 ng/mL, P < 0,05; dia 5: 45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0,05) em comparação com níveis no camundongo tratado com NS (1 h: 35,96 ± 4,72 ng/mL, 3 h: 34,94 ± 2,58 ng/mL, 12 h: 36,42 ± 5,25 ng/mL, dia 1: 34,47 ± 3,67 ng/mL, dia 2: 39,84 ± 3,71 ng/mL, dia 5: 36,82 ± 8,27 ng/mL). Como mostrado na Fig. 8b-d, a comparação com o grupo induzido por veneno de D. acutus mostrou que exposição de 1, 3 e 12 h a doses alta (50,09 ± 7,68 ng/mL, P < 0,05 [1 h]; 40,36 ± 8,51 ng/mL, P < 0,01 [3 h]; 39,87 ± 4,64 ng/mL, P < 0,05 [12 h], respectivamente) e baixa (46,64 ± 3,83 ng/mL, P < 0,01 [1 h]; 37,65 ± 9,61 ng/mL, P < 0,01 [3 h]; 38,75 ± 6,64 ng/mL, P < 0,05 [12 h], respectivamente) de PCCC-CDs diminuíram significativamente os níveis de IL-1β. Além disso, PCCC-CDs em dose média reduziram significativamente o nível de IL-1β (41,50 ± 11,08 ng/mL, P < 0,01) em comparação com o de camundongos tratados com veneno em 3 h, mas não em outros pontos de tempo.

Os níveis da citocina anti-inflamatória IL-10 aumentaram dramaticamente no grupo tratado com veneno de D. acutus em diferentes pontos de tempo (23,27 ± 0,72 ng/mL, P < 0,01; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05; 21,76 ± 1,99 ng/mL, P < 0,05; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0,01; 3 h, 12 h, dia 1 e dia 2, respectivamente) em comparação com o grupo tratado com NS (Fig. 9). Em contraste marcante, o tratamento com PCCC-CDs em alta e média dose (17,17 ± 4,04 e 17,25 ± 5,64 ng/mL, respectivamente, ambos P < 0,05) inibiu a secreção de IL-10 induzida por veneno em 3 h, enquanto PCCC-CDs em baixa dose inibiu os níveis em 3 h, 12 h e dia 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 e 18,31 ± 2,14 ng/mL, respectivamente, todos P < 0,05). Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos tratados com PCCC-CDs e NS.

Além disso, a Fig. 10 mostra que a injeção de veneno de D. acutus aumentou significativamente a liberação de MCP-1 no grupo modelo (1 h: 197,45 ± 22,34 ng/mL, P < 0,01; 3 h: 182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0,01; 12 h: 169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0,01; 24 h: 142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0,05) em comparação com o controle tratado com NS (1 h: 115,82 ± 14,80 ng/mL; 3 h: 106,46 ± 13,76 ng/mL; 12 h: 120,35 ± 15,75 ng/mL; e 24 h: 108,81 ± 25,60 ng/mL). Mais notável, o tratamento de camundongos envenenados com as três doses de PCCC-CDs inibiu o aumento nos níveis de MCP-1. As doses média (3 h: 136,84 ± 39,94 ng/mL, P < 0,01; 12 h: 127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0,01) e baixa (1 h: 152,13 ± 18,89 ng/mL, P < 0,05; 3 h: 129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0,01; 12 h: 118,75 ± 19,96 ng/mL, P < 0,01) de PCCC-CDs inibiram o aumento nos níveis de MCP-1 em 1, 3 e 12 h, exceto para dose média, em 1 h (178,20 ± 22,79 ng/mL). O tratamento com PCCC-CDs em alta dose diminuiu efetivamente o nível de MCP-1 apenas em 3 h (131,42 ± 24,62 ng/mL, P < 0,01).

Em contraste, os níveis de IL-1β, IL-10 e MCP-1 dos grupos tratados com PCCC-CDs em certos pontos de tempo não foram significativamente diferentes dos do grupo modelo, e mostraram tendência decrescente.

Efeito dos PCCC-CDs na Inibição da Trombocitopenia

As PLTs têm um papel específico na patogênese da AKI; portanto, a contagem de PLT foi investigada e os resultados são mostrados na Fig. 11 [26]. Comparado com os valores de PLT do grupo controle (1 h: [1228 ± 51] × 10⁹; 3 h: [1120 ± 36] × 10⁹; 12 h: [1245 ± 111] × 10⁹; dia 1: [1177 ± 69] × 10⁹; dia 2: [1195 ± 51] × 10⁹; e dia 5: [1181 ± 46] × 10⁹), ocorreu uma redução drástica já 1 h após a administração de veneno de D. acutus, com um nadir ocorrendo em 3 h. Subsequentemente, a PLT aumentou constantemente até o dia 5 (1 h: [354 ± 70] × 10⁹, P < 0,01; 3 h: [315 ± 77] × 10⁹, P < 0,01; 12 h: [435 ± 91] × 10⁹, P < 0,01; dia 1: [663 ± 226] × 10⁹, P < 0,01; dia 2: [941 ± 248] × 10⁹, P < 0,05; dia 5: [1083 ± 89] × 10⁹). Notavelmente, mesmo neste intervalo de tempo, os valores de PLT eram significativamente menores que os de camundongos controle. Além disso, a administração de PCCC-CDs na dose de 8 mg/kg inibiu marcadamente a trombocitopenia induzida por veneno em 1 h ([435 ± 91] × 10⁹, P < 0,05), 3 h ([599 ± 290] × 10⁹, P < 0,05), 12 h ([929 ± 92] × 10⁹, P < 0,01), dia 1 ([1028 ± 248] × 10⁹, P < 0,01) e dia 2 ([1183 ± 89] × 10⁹, P < 0,01). Este efeito inibitório também foi observado na dose de 2 mg/kg de PCCC-CDs em 3 h e dia 2 e 4 mg/kg de PCCC-CDs no dia 2, além de aumento de PLT. Embora não houvesse diferença significativa entre os grupos modelo e de dose média, uma tendência crescente foi observada em outros pontos de tempo diferentes.

Observações Histopatológicas

A lesão renal no grupo veneno foi avaliada histologicamente. Como mostrado na Fig. 12a, em contraste com o grupo tratado com NS, que mostrou glomérulos e celularidade tubular normais, mudanças marcantes foram observadas no parênquima renal do grupo tratado com veneno de D. acutus. Essas mudanças incluem hemorragia marcante, dilatação tubular renal e degeneração. O co-tratamento com PCCC-CDs preveniu o dano renal induzido por veneno de D. acutus, e o exame histopatológico da arquitetura dos tecidos renais foi quase normal com hemostasia leve, dilatação tubular renal e degeneração.

Discussão

Como um nanomaterial emergente, os CDs estão começando a ocupar um nicho importante como materiais inovadores para nanomedicinas de próxima geração. Comparados a pontos quânticos tradicionais baseados em metais pesados, os CDs são bons candidatos para aplicação biomédica devido às suas características únicas que têm vantagens potenciais consideráveis no desenvolvimento de novos medicamentos com toxicidade relativamente baixa [27, 28].

As partículas de PCCC-CDs derivadas eram quasi-esféricas e bem dispersas em água, com grupos funcionais abundantes presentes na superfície. Esta observação é consistente com achados relatados anteriormente [23]. Além disso, os CDs preparados mostraram baixa toxicidade contra células L02 e 293 T, o que indicou sua adequação para aplicações biomédicas.

O estudo atual é o primeiro, ao melhor de nosso conhecimento, a demonstrar as notáveis bioatividades dos PCCC-CDs sobre AKI induzida por picada de cobra D. acutus. D. acutus é amplamente chamada de "cinco passos" ou "cem passos" na medicina popular chinesa devido à descrição folclórica de que pessoas ou animais picados por D. acutus não poderiam andar mais de 100 passos. Mais de 90% da população de D. acutus é encontrada na China, e a frequência de condições críticas e até morte relacionada à picada desta cobra é maior que a de muitas outras cobras venenosas [29]. AKI é o efeito sistêmico mais grave e complicação comum, que leva a isquemia renal secundária e falência. Um conhecimento aprimorado de informações relevantes sobre AKI induzida por envenenamento de D. acutus contribuiria para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. No entanto, em contraste com o conhecimento considerável disponível sobre a nefrotoxicidade de veneno de cobra em geral [30, 31], a informação sobre AKI induzida por veneno de D. acutus é rara, o que nos levou a investigar este medicamento potencial que ainda está em estágios iniciais de desenvolvimento.

Neste estudo, estabelecemos um modelo de AKI injetando intraperitonealmente veneno de D. acutus em camundongos para avaliar a patogênese complexa e multifatorial de AKI induzida por veneno. Além disso, o modelo forneceu uma ferramenta para investigar os efeitos protetores dos PCCC-CDs contra AKI induzida por veneno de D. acutus.

Experimentos atuais mostraram o desenvolvimento de AKI substancial com mudanças distintas em citocinas inflamatórias e índices bioquímicos séricos e urinários, bem como evidências histopatológicas de lesão renal após injeção intraperitoneal de veneno de cobra [31]. Esses achados indicaram os possíveis fatores que podem contribuir principalmente para a toxicidade do veneno são [32] (1) citotoxicidade direta do veneno contra o rim e (2) reações inflamatórias renais.

Especificamente, a insuficiência renal foi confirmada aproximadamente 24 h após a injeção de veneno baseada em oligúria associada a proteinúria e biomarcadores séricos elevados (SCR e BUN). Afirmamos ainda o envolvimento renal no grupo tratado com veneno de D. acutus usando análise bioquímica, que mostrou níveis significativamente elevados de UTP e MALB em comparação com os do grupo controle. Esses achados indicaram a presença de mau funcionamento glomerular e reabsorção tubular no grupo tratado com veneno [33], que foram apoiados por evidências de mudança histopatológica. Em contraste, uma redução significativa nos níveis de UTP e MALB foi observada no grupo tratado com PCCC-CDs em dose média. Além disso, indicadores bioquímicos séricos (SCR e BUN) são outros parâmetros vitais usados para determinar a elevação da disfunção renal em AKI e permanecem indicadores clínicos em seu diagnóstico [34]. A injeção de veneno de cobra do dia 1 a 5 também aumentou dramaticamente os níveis de SCR e BUN, enquanto o tratamento com PCCC-CDs reverteu esses efeitos, resultando em uma recuperação mais rápida que a do grupo controle. Mais importante, as mudanças distintas no tecido renal, hemorragia marcante, dilatação tubular renal e degeneração indicaram ainda mais o prejuízo direto do rim pelo veneno. Os efeitos atenuantes dos PCCC-CDs nas mudanças histopatológicas foram demonstrados neste estudo. Esses resultados sugeriram que os PCCC-CDs inibiram a manifestação anormal induzida por AKI de marcadores bioquímicos urinários e séricos associados à disfunção renal, bem como dano histológico renal. Além disso, esses efeitos podem ser atribuíveis à melhora da nefrotoxicidade direta do veneno de D. acutus pelos PCCC-CDs [35]. Os efeitos protetores dos PCCC-CDs foram evidenciados pela inibição do dano renal direto induzido por veneno de D. acutus.

Uma resposta inflamatória intensa é uma característica comum induzida por envenenamento por animais venenosos como cobras e lagartas [35-37]. Os sinais de inflamação sistêmica com infiltração de células mononucleares, leucocitose neutrofílica, degeneração de células epiteliais tubulares e necrose também foram mostrados no prejuízo renal induzido por injeção de veneno de cobra. MCP-1 é uma pequena proteína molecular que desempenha um papel vital no recrutamento e ativação de leucócitos durante respostas inflamatórias [38]. Além disso, fagócitos mononucleares e linfócitos podem contribuir para a lesão aguda de células renais por diferentes mecanismos, como a secreção de mediadores pró-inflamatórios, que podem então induzir células renais residentes a expressar quimiocinas [39]. O envolvimento de MCP-1, citocinas inflamatórias (IL-1β) e citocina anti-inflamatória (IL-10) na resposta inflamatória na patogênese de AKI em camundongos injetados com veneno de D. acutus apenas foi demonstrado no presente estudo. Esta observação indicou que o mecanismo subjacente da AKI induzida por veneno de D. acutus pode estar associado à resposta inflamatória renal. A evidência de que a exposição a PCCC-CDs reduziu significativamente os níveis de IL-1β, IL-10 e MCP-1 sugere que os CDs podem exibir renoproteção inibindo reações inflamatórias renais.

Além disso, as PLTs desempenham um papel crucial em processos hemostáticos e inflamatórios agudos e estão associadas a diversas patologias inflamatórias [40, 41]. Elas são altamente sensíveis e respondem rapidamente a mudanças biológicas quando um organismo é lesionado ou sangra, como as primeiras células a chegar ao local da lesão aguda para interagir com células endoteliais e leucócitos [42]. As PLTs estão envolvidas na patogênese da AKI [43] e são consideradas um marcador prognóstico significativamente associado a um desfecho pior da AKI [44]. Este estudo forneceu evidências de que o veneno de D. acutus diminuiu conspicuamente a contagem de PLT, o que foi consistente com os resultados de estudos relatando que trombocitopenia pode ser induzida por veneno de cobra [34, 45]. Observamos que a exposição a PCCC-CDs elevou significativamente as contagens de PLT, o que foi consistente com os achados de um estudo anterior [23].

As anormalidades de AKI induzidas por veneno de D. acutus foram, ao melhor de nosso conhecimento, demonstradas pela primeira vez no estudo atual e incluíram principalmente disfunção renal associada a proteinúria, oligúria, níveis elevados de BUN e SCR, dano patológico renal, respostas inflamatórias e trombocitopenia.

Notavelmente, os PCCC-CDs demonstraram atividade protetora contra AKI induzida por veneno de D. acutus inibindo os prejuízos associados, como evidenciado neste estudo pela primeira vez. Este estudo foi uma avaliação preliminar dos efeitos benéficos dos PCCC-CDs sobre AKI induzida por veneno de D. acutus, e investigações adicionais do mecanismo subjacente seriam o foco de estudos futuros.

Conclusão

Os impressionantes efeitos protetores dos PCCC-CDs sobre AKI induzida por veneno de D. acutus foram demonstrados neste estudo, pela primeira vez, ao melhor de nosso conhecimento. Os efeitos relacionados à AKI foram manifestados principalmente como disfunção renal, dano patológico renal, respostas inflamatórias e trombocitopenia. Esses resultados indicaram que os PCCC-CDs têm perspectivas de aplicação potencial para uso como medicamento complementar para o tratamento de anormalidades induzidas por AKI induzida por veneno de D. acutus. Além disso, isso fornece uma nova estratégia para o estudo de ingredientes ativos de formulações de medicina tradicional chinesa, e amplia ainda mais as aplicações biomédicas dos CDs.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

Abreviações

AKI:

Lesão renal aguda

BUN:

Nitrogênio ureico sanguíneo

CDs:

Pontos de carbono

D. acutus:

Deinagkistrodon acutus

HE:

Hematoxilina e eosina

IL:

Interleucina

MALB:

Microalbuminúria

MCP-1:

Proteína quimiotática de monócitos 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Pontos de carbono de Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata

PLT:

Contagem de plaquetas

SCR:

Creatinina sérica

UTP:

Proteína urinária total