Lipossoma funcionalizado com aptâmero anti-Epcam (Syl3c) para distribuição direcionada de doxorrubicina:estudos de antitumorais in vitro e in vivo em camundongos com carcinoma do cólon C26

Resumo

Neste estudo, temos doxorrubicina nanolipossômica PEGuilada funcionalizada em superfície (DOX) com aptâmero anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) via pós-inserção de DSPE-mPEG conjugado a aptâmero anti-EpCAM ₂₀₀₀ em Caelyx® (ED-lip). O tamanho, carga, perfil de liberação e citotoxicidade e absorção celular da formulação foram determinados. A caracterização do lábio ED demonstrou o ligeiro aumento no tamanho e PDI junto com a diminuição no potencial zeta, o que indica que a pós-inserção foi feita de forma eficiente. Os resultados da citometria de fluxo e microscopia fluorescente mostraram que o ED-lip aumentou a taxa de captação celular na linha celular C26 em comparação com o Caelyx®. O lábio ED também teve mais efeitos citotóxicos do que Caelyx®, o que indicou a eficácia do aptâmero anti-EpCAM como ligante de direcionamento. A farmacocinética e a biodistribuição tecidual de formulações em camundongos com tumores C26 demonstraram que o lábio-ED não afetou o perfil de distribuição de DOX em comparação com Caelyx® em modelo animal. Além disso, o ED-lip melhorou efetivamente o acúmulo de DOX no tumor e promoveu a sobrevivência dos animais em comparação ao Caelyx®. Esses resultados sugerem que a funcionalização de Caelyx® com aptâmero anti-EpCAM é promissora no tratamento do câncer e merece mais investigação.

Introdução

Os nanossistemas de entrega de drogas (NDDSs) com o tamanho de 100–200 nm são acumulados passivamente no microambiente tumoral por meio do efeito de permeabilidade e retenção aprimorada (EPR). Isso ocorre por meio do revestimento endotelial frouxo e da drenagem linfática fraca. No entanto, dados recentes indicaram que apenas menos de 1% do medicamento administrado pode chegar ao local do tumor [1]. A falta de capacidade de penetração na matriz extracelular densa (MEC) do tumor, o retorno do fármaco liberado à circulação e a heterogeneidade dos tumores são os responsáveis por essa falha [2]. Diferentes estratégias têm sido usadas para melhorar o acúmulo tumoral de NDDSs usando estímulos endógenos e exógenos [3]. Esses NDDSs poderiam responder a estímulos exógenos, como a luz, e têm a capacidade de uso em imagiologia de tumor [4]. Existem muitos nanomateriais inorgânicos diferentes que têm a capacidade de uso como agentes anticâncer [5, 6]. No entanto, no caso de nanomateriais inorgânicos, deve-se atentar para suas toxicidades e segurança ambiental [7,8,9,10,11].

A entrega direcionada ativa é uma abordagem importante que ajuda os NDDSs a entregar agentes terapêuticos mais eficientes para os tumores e minimizar a exposição a tecidos não-alvo [12, 13]. Um agente de direcionamento ideal para entrega direcionada é uma molécula que tem afinidade para as proteínas da superfície celular ou receptores regulados positivamente por células específicas ou componentes de tecido [14].

A molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) é uma glicoproteína transmembrana considerada como ligante candidato para direcionamento ativo. Descobertas recentes indicaram que a EpCAM possui células epiteliais saudáveis de baixa expressão normal, enquanto nas células cancerosas sua expressão se torna em níveis mais elevados (até 1000 vezes) [15,16,17]. Durante o desenvolvimento do câncer, o padrão de expressão de EpCAM muda da membrana basal e basolateral na superfície epitelial normal para a apical nas células epiteliais tumorais [18]. Esta expressão diferencial torna EpCAM um ligante muito interessante para a entrega de drogas, o que poderia melhorar o índice terapêutico da droga [19].

A EpCAM é demonstrada como marcador de células-tronco cancerígenas (CSC) ou célula iniciadora de tumor (TIC), cuja expressão no câncer está relacionada ao mau prognóstico [20]. CSC ou TIC são células que possuem autorrenovação, a capacidade de produzir mais células do mesmo tipo, que desempenham papéis importantes no desenvolvimento de tumores e metástases [21]. A superexpressão de EpCAM foi relatada em CSC de vários tumores sólidos [22]. Recentemente, aptâmeros têm atraído muita atenção em ampla gama de investigação e emergem como moléculas potencialmente poderosas que podem ser usadas em NDDSs como o ligante de direcionamento [23, 24]. Aptâmeros são sequências de oligonucleotídeos baseadas em DNA ou RNA que possuem estruturas secundárias e terciárias que têm afinidade para seus alvos, como receptores de superfície celular [23, 24]. Os aptâmeros também têm várias vantagens sobre os, por exemplo, eles não são imunogênicos e têm baixo peso molecular (8–25 kDa) com estabilidade química e térmica. Além disso, sua síntese e modificações químicas são de baixo custo e escalonáveis [25]. O direcionamento seletivo dos NDDSs por meio de aptâmero específico de anti-EpCAM pode ser considerado uma opção de direcionamento eficaz para entregar agentes quimioterápicos no microambiente tumoral [19, 26]. A este respeito, diferentes estudos mostraram que os nanocarreadores funcionalizados com aptâmero anti-EpCAM poderiam melhorar efetivamente a entrega de drogas anticâncer às células tumorais [15, 27, 28].

O objetivo deste estudo é desenvolver um aptâmero de DNA anti-EpCAM (SYL3C) -PEGilado-nanolipossomas carregados com doxorrubicina (DOX) (ED-lip) como um modelo de NDDS. Tal funcionalização foi realizada por química de acoplamento EDC / NHS entre o grupo amina do aptâmero e o grupo carboxila de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ , que é pós-inserido no lipossoma como mostrado na Fig. 1. O lábio ED caracterizado por tamanho, potencial zeta e porcentagem de encapsulação de doxorrubicina, perfil de liberação e citotoxicidade. Em seguida, avaliamos se esses lábios ED poderiam melhorar a captação celular in vitro e entregar DOX ao tumor por meio de direcionamento em camundongos com tumores de carcinoma do cólon C26.

Resultado e discussão

Caelyx®, a doxorrubicina lipossomal PEGuilada é um dos agentes quimioterápicos mais amplamente usados e é a primeira nanopartícula aprovada pelo FDA que foi indicada para o tratamento de câncer de ovário, sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS e mieloma múltiplo. Caelyx® penetrou passivamente no local do tumor via efeito EPR [29]. Embora, Caelyx® tenha melhorado significativamente a farmacocinética e a meia-vida de DOX; no entanto, as principais limitações do Caelyx® são a captação celular insuficiente e a baixa taxa de liberação da droga no local do tumor [29]. Aqui, usamos o aptâmero SYL3C como um ligante de direcionamento para funcionalizar a doxorrubicina lipossomal (ED-lip) para direcionar a molécula de EpCAM na superfície das células cancerosas, o que permite a entrega de DOX para o local alvo específico através do processo de direcionamento ativo.

Conjugação de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ para Aptamer

No presente estudo, usamos a química de acoplamento EDC / NHS para a conjugação de aptâmeros anti-EpCAM funcionalizados com amina ao grupo carboxílico ativo de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -COOH. A vantagem dessa reação de acoplamento usando a química de acoplamento EDC / NHS e a formação da ligação amida é sua estabilidade e redução de interações inespecíficas entre aptâmeros [30]. Os aptâmeros podem ser modificados com amina primária ou grupo tiol e covalentemente conjugados para ativar o grupo carboxila ou pirrol da maleimida, respectivamente [31]. Os aptâmeros modificados com o grupo tiol foram conjugados ao grupo funcional maleimida de DSPE-PEG ₂₀₀₀ . Então, DSPE-PEG ₂₀₀₀ -aptâmero pós-inserido na estrutura do lipossoma para decorar a superfície externa dos lipossomas [32]. Uma limitação importante com a química do tiol maleimida é que durante o armazenamento o grupo tiol de aptâmeros pode ser afetado pela oxidação e levando à formação de ligação dissulfeto (S-S) entre dois aptâmeros modificados com tiol. Estes aptâmeros diméricos não são capazes de participar na reação de conjugação com o grupo funcional maleimida de DSPE-PEG ₂₀₀₀ [30]. Portanto, o uso de reações EDC / NHS aumenta o rendimento do produto e melhora no método pós-inserção.

O aptamer tem algumas vantagens sobre os anticorpos, incluindo facilidade de síntese e aumento de escala, baixa toxicidade sistêmica e falta de imunogenicidade [33]. Aqui, após a conjugação do aptâmero com o lipídeo, o método pós-inserção foi recrutado para fazer o aptâmero anti-EpCAM decorado com Caelyx® (ED-lip). Geralmente, a técnica de pós-inserção é um método simples e eficaz para a ligação de aptâmeros à superfície dos lipossomas e fornece uma taxa mais elevada de incorporação de aptâmeros nos lipossomas [34].

Usamos o ensaio de mudança de mobilidade por eletroforese em gel para avaliação da pós-inserção do aptâmero anti-EpCAM no lipossoma. Como mostrado na Fig. 2, os aptâmeros carregados negativamente migraram no gel e sua banda foi observada enquanto não há nenhuma banda de contrapartida para formulação de lábio ED, porque lábio ED preso na linha do poço e não podia se mover através do gel. Estes resultados indicaram que micelas conjugadas com aptâmeros foram pós-inseridas com sucesso na superfície dos lipossomas.

Caracterização físico-química do lábio-ED

A caracterização físico-química de Caelyx® e ED-lip foi demonstrada na Tabela 1. O tamanho e a carga das formulações preparadas revelaram que a modificação de Caelyx® com aptâmero anti-EpCAM não teve efeito significativo no tamanho de partícula ( p > 0,05). O tamanho lipossomal antes da inserção do aptâmero (Caelyx®) era de cerca de 96 nm com PDI de 0,11, após a pós-inserção (ED-lábio) o tamanho dos lipossomas aumentou parcialmente para 117 nm com PDI de 0,14 que têm um tamanho desejável para entrega a tumor. Os resultados de estudos anteriores também indicaram que a incorporação de ligantes de direcionamento leva ao aumento no tamanho e PDI dos lipossomas [35, 36]. Além disso, o potencial zeta do lábio ED (- 19,25) tornou-se mais negativo do que Caelyx® (- 12). Foi demonstrado que a conjugação de RNA-aptâmero em lipossoma resultou na diminuição do potencial zeta do lipossoma [37]. O aumento no tamanho e potencial zeta negativo do lábio ED pode ser evidência de pós-inserção bem-sucedida de aptâmeros conjugados na superfície do lipossoma [38]. Esses resultados são consistentes com nosso estudo anterior que indicou a fixação do aptâmero à superfície do Caelyx® levando a um ligeiro aumento no tamanho da partícula e ao potencial zeta mais negativo no aptâmero funcionalizado Caelyx® [38, 39]. No entanto, a eficácia da pós-inserção deve ser testada em termos de tempo de incubação e temperatura para se chegar a um lipossoma pós-inserido mais eficiente com melhor tamanho e PDI. A eficiência de encapsulação do Caelyx® e ED-lip foi de 100% (ver Tabela 1).

O número de aptâmero pós-inserido na superfície do lipossoma foi determinado conforme descrito [6]. A quantidade total de conteúdo de fosfolipídios da formulação lipossomal determinada por ensaio de fosfato foi de 14 mM. Uma vez que, o número médio de moléculas de lipídios em lipossomas com tamanho médio de 100 nm é 8 × 10 ⁴ o número de lipossomas em cada mililitro é quase 10 ¹⁴ [38]. O peso molecular do aptâmero era g / mol. O número de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -aptâmero foi determinado com base em métodos de ensaio de fosfato em que moles de moléculas de fosfato são correspondentes a moles de moléculas conjugadas. Com base nesses dados, o número de moléculas de aptâmero por cada solução de alíquotas ml é 10 ¹⁵ .

Perfil de versão DOX

A inserção de micelas conjugadas com aptâmero na superfície externa do Caelyx® pode afetar o perfil de liberação do DOX. Portanto, avaliamos a liberação de DOX da forma ED-lip em comparação com o Caelyx® em dextrose a 5% com FBS a 50%. Este meio pode simular o comportamento de liberação das formulações no plasma [40]. A Figura 3 mostrou que não há diferença significativa na liberação de DOX das formulações de Caelyx® e ED-lip durante 24 horas de estudo e apenas as quantidades insignificantes de DOX foram liberadas. Isso é consistente com nossos estudos anteriores que indicaram que a inserção do aptâmero na superfície do lipossoma não afetou a estabilidade da membrana e o perfil de liberação de DOX [38, 39]. Isso se deve principalmente à estabilidade da formulação de Caelyx® que foi formulada usando um método de carregamento remoto controlado por gradiente de pH [41].

Interação celular e captação celular por microscopia fluorescente

A interação celular e a absorção celular de formulações lipossomais foram avaliadas em 4 ° C e 37 ° C e foram mostradas na Fig. 4. A avaliação da eficácia de direcionamento de ED-lip indicou que não houve diferenças entre as intensidades fluorescentes médias (MFIs) de células CHO-K1 tratadas com Caelyx® e ED-lip a 4 ° C e 37 ° C (Fig. 4a, c). No entanto, os dados demonstraram que o lábio-ED direcionado teve consideravelmente maior captação pelas células C26 em comparação com Caelyx® a 4 ° e 37 ° C (Fig. 4b, d) que foi estatisticamente significativo a 37 ° C ( p <0,0001). O lábio ED teve uma captação significativa em comparação com o Caelyx® ( p <0,001). Estes resultados indicaram que a especificidade alvo aumentada de lábio ED devido ao aptâmero anti-EpCAM tem mais afinidade para a linha celular C26 em comparação com as células CHO-K1. A DOX livre passa livremente pela bicamada lipídica e entra na célula, portanto tem a maior absorção celular entre as formulações e, portanto, a maior citotoxicidade. No caso do Caelyx®, a PEGilação limita a taxa de endocitose e resultou na diminuição da citotoxicidade. No entanto, a presença de aptâmero anti-EpCAM na superfície do lipossoma (ED-lip) aumenta a taxa de internalização da formulação nas células e aumenta sua citotoxicidade em comparação com Caelyx® [38]. Os dados de microscopia fluorescente demonstraram que a diferença entre a captação celular de ED-lip e DOX livre na linha de células C26 a 37 ° C não foi significativa (Fig. 5). No entanto, o dimensionamento com base na intensidade de DOX internalizado representado na Tabela 2 em que ED-lip e DOX mostraram diferenças estatisticamente significativas com Caelyx® na captação celular de C26 ( p <0,001). Embora as células C26 expressem baixo nível de EpCAM em sua superfície [42], os dados deste estudo sugeriram que a presença de aptâmero anti-EpCAM poderia aumentar a taxa de processo de internalização de lipossomas [43].

Interação celular e captação celular de formulações lipossomais avaliadas em 4 ° C e 37 ° C. a A interação das células CHO-K1 das formulações a 4 ° C e 37 ° C. b A interação de formulações com células C26 a 4 ° C e 37 ° C. c O gráfico demonstrou a média de MFI de formulações em células CHO-K1 e C26. Dados representados como média ± desvio padrão (SEM) ( n =3). **** p <0,0001

Microscopia fluorescente. Os resultados da internalização celular de DOX em linhas de células C26 visualizados por microscopia fluorescente. Células coradas com DAPI. Tanto o DOX livre quanto o lábio ED têm maior nível de internalização DOX em comparação com o Caelyx®. Células inspecionadas com ampliação de 200 ×

Estudo de Citotoxicidade

Os efeitos da citotoxicidade das formulações de DOX livre, Caelyx® e ED-lip são indicados na Fig. 6. Diferentes concentrações de formulações usadas para tratar células por 1, 3 e 6 h e incubadas por 72 h seguintes. Os dados demonstraram que todas as formulações têm efeitos nas células no tempo e de maneira dependente da dose. A viabilidade das células C26 tratadas com a formulação ED-lip diminuiu em comparação com as células tratadas com Caelyx®. Uma vez que as células CHO-K1, como células negativas para EpCAM, mostram menor resposta ao lábio-ED em comparação às células C26, parece que o aptâmero anti-EpCAM aumentou a entrega específica de Caelyx® às células-alvo. Estes resultados podem confirmar a captação celular específica de ED-lip pelas células C26. Esses resultados enfatizaram a importância do uso da entrega de drogas direcionadas com agentes de direcionamento específicos para a entrega seletiva de drogas às células-alvo com a redução dos efeitos colaterais da droga, evitando fora do alvo [44]. Conforme relatado anteriormente, o direcionamento ativo de Caelyx® com ligantes de direcionamento específicos, como aptâmero e anticorpo, leva a aumentar o direcionamento de tumor ativo e a distribuição de droga específica para células-alvo que, por sua vez, aumentam a eficácia terapêutica de DOX [35, 39].

Efeito de citotoxicidade in vitro (IC50) de ED-lip, Caelyx® e doxorrubicina livre contra células CHO e células C26 após diferentes tempos de exposição. Dados representados como μg / ml ± desvio padrão (SEM) ( n =3). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Biodistribuição e Farmacocinética

A fim de avaliar como o aptâmero anti-EpCAM afeta a biodistribuição de DOX, injetamos uma dose de 10 mg / kg de ED-lip e Caelyx® em camundongos com tumores de câncer de cólon C26 subcutâneos. A concentração de DOX no plasma em 3, 12, 24, 48 e 72 h após a injeção com Caelyx® e ED-lip é mostrada na Fig. 7. Os resultados mostram que o comportamento das concentrações de DOX no plasma em ambos os grupos foi semelhante e não não houve diferença significativa entre as duas formulações. Como mostrado na Tabela 3, a conjugação de aptâmero anti-EpCAM com a superfície lipossomal diminuiu ligeiramente a meia circulação de 39,3 h para 34,2 h e MRT de 47,6 para 42,9 h (ver Tabela 3). Os parâmetros farmacocinéticos indicaram que a conjugação do aptâmero anti-EpCAM no lipossoma diminuiu ligeiramente t _½ e MRT que foram consistentes com relatórios anteriores demonstraram que a conjugação de aptâmero na superfície lipossomal acelera a depuração de lipossomas [38]. A adsorção de proteínas e consequente remoção pelo sistema fagocítico mononuclear (MPS) pode ser a razão da aceleração da depuração sanguínea de nanopartículas conjugadas com ligante [45].

Nível plasmático de DOX. Os resultados da concentração em relação ao tempo da quantidade de DOX no sangue às 3, 12, 24, 48 e 72 horas após a injeção. Dados representados como média ± desvio padrão (SEM) ( n =3)

Conforme mostrado na Fig. 8, as concentrações de DOX nos principais órgãos colhidos nos grupos que receberam Caelyx® e ED-lip foram comparadas. Os efeitos colaterais mais importantes da DOX livre são a cardiotoxicidade, que Caelyx® diminui significativamente o risco desse efeito adverso [46]. A biodistribuição do lábio-ED no fígado, pulmão e baço é significativamente maior do que Caelyx® no tempo de 3 h. A presença de vasos sanguíneos com vazamento e aumento no tamanho e PDI do lábio ED após a pós-inserção podem ser as razões para mais acúmulo de lábio ED nesses tecidos em tempos anteriores. Foi demonstrado que o aumento no tamanho das nanopartículas para 150 nm aumenta o acúmulo de nanopartículas no fígado, pulmão e baço [47]. Enquanto isso, os resultados do estudo de biodistribuição mostram claramente o mecanismo de EPR no acúmulo de nanopartículas no tumor. A Figura 8 mostra claramente que ambos ED-lip e Caelyx® gradualmente se acumulam no local do tumor e atingem um máximo por volta das 12h, permanecem no patamar por até 24h e então diminuem em 48 e 72h, gradualmente. É interessante em todos os pontos de tempo de 3, 12, 24, 48 e 72 h; o acúmulo de ED-lip no tumor é significativamente maior do que Caelyx®, o que pode ser devido à eficácia do direcionamento ativo com aptâmero anti-EpCAM. Estes resultados indicaram que a fixação do aptâmero na dose de superfície do lipossoma não afetou a distribuição de DOX no rim. Portanto, parece que os aptâmeros anti-EpCAM promovem efetivamente a penetração específica do tumor em lipossomas, o que também pode ser devido à superexpressão de moléculas EpCAM em células endoteliais vasculares tumorais [48]. Anteriormente, foi indicado que aptâmeros anti-EpCAM poderiam aumentar a penetração do tumor em tumores de xenoenxerto [49]. As CSCs ou TICs também são alvos da terapia anti-EpCAM. A administração de aptâmeros anti-EpCAM como ligante de direcionamento a fim de direcionar EpCAM mostrou efeitos promissores no direcionamento de CSCs [22, 50]. Aqui, pode ser sugerido que parte do efeito antitumoral eficiente de ED-lip pode ser devido ao direcionamento bem-sucedido de CSCs.

Biodistribuição de tecidos. Os resultados da biodistribuição de DOX no coração, tumor, fígado, pulmão, baço e rim. As concentrações (μg / g) relatadas em 3, 12, 24, 48 e 72 h após a injeção para cada órgão. Dados representados como média ± desvio padrão (SEM) ( n =3). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Atividade antitumoral in vivo

A eficácia terapêutica do lábio-ED foi avaliada no modelo de tumor de carcinoma do cólon C26. O tamanho do tumor, o peso corporal e a sobrevivência foram monitorados durante quase 2 meses e os resultados estão resumidos na Fig. 9 e Tabela 4. Os dados indicam que ED-lip não tem nenhuma influência óbvia no peso corporal dos camundongos, bem como no Caelyx® (ver Fig. 9a ) Conforme mostrado na Fig. 9b, após a injeção intravenosa de Caelyx® e ED-lip, a taxa de crescimento do tumor é eficientemente inibida até o dia 30 após a injeção, e não há diferença significativa nos grupos de lipossomas. Após 30 dias após a injeção, a taxa de crescimento do tumor acelerou, no entanto, a taxa de crescimento nos grupos que receberam drogas foi ainda mais lenta do que no grupo que recebeu PBS. A diferença entre o grupo Caelyx® e o lábio-ED não foi significativa durante 30 dias após a injeção. Os resultados de sobrevivência são representados em um gráfico de Kaplan-Meier. A Figura 9c mostra o ED-lip melhora a curva de sobrevivência em comparação com PBS ou Caelyx®. Os principais indicadores do estudo de sobrevivência foram resumidos na Tabela 4. Os tumores em três camundongos do grupo ED-lábio foram completamente curados, então o MST para este grupo é indefinido. O tratamento com ED-lip aumentou o TTE de 41,1 para 49,7 dias e resultou em atividade antitumoral eficaz com 90,27% de TGD com MST indefinido devido à remoção completa do tumor em três camundongos (ver Tabela 4).

Eficácia terapêutica in vivo de formulações em camundongos BALB / c fêmeas com carcinoma do cólon C26. Os camundongos receberam injeção IV de uma dose única de formulações (10 mg / kg). a Representa o respectivo perfil percentual de peso do BALB / c em cada grupo experimental. b Descreve o acompanhamento do tamanho do tumor em camundongos BALB / c. c Mostra o gráfico de sobrevivência para BALB / c. Dados representados como média ± DP ( n =5)

Os dados do tamanho do tumor demonstraram que o lábio-ED pode inibir dramaticamente o crescimento do tumor. Os resultados da análise de sobrevivência mostraram que o tratamento com ED-lip aumentou o MST e o TTE. O grupo que recebeu ED-lip teve um maior TGD% e foi mais eficaz em comparação com Caelyx®. Nossos resultados são consistentes com o alto nível de concentração de DOX no tecido tumoral do grupo tratado com ED. Portanto, DOX lipossomal conjugado com aptâmero melhora sua penetração e, consequentemente, aumenta o acúmulo de droga no local do tumor, o que, por sua vez, leva ao aumento da eficácia do Caelyx® e maior TGD% nos dados de sobrevivência. Tomados em conjunto, esses achados indicam que aptâmeros anti-EpCAM podem servir como um importante agente de direcionamento para a entrega de drogas.

Conclusão

Aqui, temos Caelyx® funcionalizado em superfície com aptâmero anti-EpCAM (SYLC3) via pós-inserção (ED-lip). A citometria de fluxo e a microscopia fluorescente mostraram alto nível de captação de DOX em células C26, o que indicou que o aptâmero pode aumentar a taxa de processo de internalização do lábio-ED. Os dados farmacocinéticos indicaram que a pós-inserção de DSPE-mPEG-EpCAM não alterou a farmacocinética de DOX em comparação com Caelyx®. No entanto, a biodistribuição do tecido mostrou que o maior acúmulo de tumor de ED-lábio em comparação com Caelyx® mesmo após 72 h pós-injeção. Demonstramos que o ED-lip melhorou os efeitos terapêuticos em camundongos com tumores C26. Os parâmetros de sobrevivência melhorados em camundongos tratados com ED-lip, sugerem que o lipossoma EpCAM-alvo-DOX é um transportador de entrega de drogas promissor para o tratamento de cânceres e merece uma investigação mais aprofundada.

Materiais e métodos

Materiais

O aptâmero de DNA 5'-amina-anti-EpCAM (sequência de 5 '-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3') (SYL3C) foi adquirido da BIONEER (empresa de biotecnologia, Daejeon, Coreia do Sul). DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -COOH foi adquirido na Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-Hidroxissuccinimida (NHS), penicilina estreptomicina e Fluoroshield ™ com DAPI foram adquiridos na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O caelyx® disponível comercialmente foi adquirido na Behestan Darou Company (Teerã, Irã).

Conjugação de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ para Aptamer

O aptâmero anti-EpCAM foi vinculado a DSPE-mPEG ₂₀₀₀ através da ligação covalente das aminas primárias (-NH2) do aptâmero anti-EpCAM ao grupo carboxila (–COOH) de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ (Figura 1). A conjugação foi realizada via química de acoplamento EDC / NHS [51]. Resumidamente, DSPE-mPEG ₂₀₀₀ foi disperso em tampão de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico (MES) (pH 6,5) e EDC / NHS 400 mM EDC e 100 mM de NHS foram adicionados à dispersão. A dispersão permitiu a agitação por 15 min, a fim de ativar os grupos carboxila do lipídeo. Em seguida, aptâmero anti-EpCAM foi adicionado à dispersão e agitado durante as próximas 2 h em temperatura ambiente no escuro. A razão molar de lipídeo:aptâmero anti-EpCAM foi de 1:1 e a razão molar de EDC / NHS foi de 10 vezes a do lipídeo.

Modificação de Caelyx® com DSPE-mPEG-Anti-EpCAM Aptamer

ED-lip foi sintetizado pelo método pós-inserção. A fim de realizar a pós-inserção, micelas de aptâmero DSPE-mPEG-anti-EpCAM foram adicionadas a 1 ml de caelyx® por 30 min a 60 ° C. As quantidades de aptâmero DSPE-mPEG-EpCAM foram determinadas de acordo com o ensaio de fosfato de Bartlett [52]. Com base no número aproximado de lipossomas por mililitro de caelyx®, que é cerca de 10 ¹⁴ , o volume de DSPE-mPEG-anti-EpCAM foi ajustado para atingir 10 aptâmeros por cada lipossoma [36]. Eletroforese em gel de agarose usada para confirmar a pós-inserção [39].

Caracterização físico-química

O tamanho de partícula, o índice de polidispersidade (PDI) e a carga superficial foram determinados pelo instrumento Dynamic Light Scattering (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK). Para remover o DOX livre, os lipossomas foram misturados com resina Dowex® e girados por 60 min e executados em colunas Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) para remover o Dowex® [53]. As quantidades de DOX em formulações lipossomais foram determinadas usando espectrofotômetro de fluorescência LS-45 (Perkin-Elmer, UK), (excitação:emissão 485:590 nm).

Estudo de lançamento

Para avaliar a liberação de DOX, 1 ml de formulação adicionado à dextrose 9 ml (com 50% de soro fetal bovino (FBS)) e em determinados intervalos de tempo (0, 1, 2, 4, 6, 12, e 24 h), foram retiradas amostras. Após a remoção do DOX livre com a resina Dowex®, as quantidades de fármaco remanescentes nos lipossomas foram determinadas por espectrofotômetro de fluorescência e a porcentagem de liberação calculada [39].

Cultura de células

As linhas de células de carcinoma do cólon C26 e de ovário de hamster chinês (CHO-K1) foram adquiridas no Pasteur Institute of Iran. As linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado com 10% de FBS obtido da Gibco (Thermos Fisher Scientific, EUA) e 100 UI / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ^° C com 5% de CO ₂ e 95% de atmosfera umidificada com ar.

Ensaio de interação celular e captação celular

Cell interaction and cell uptake of formulations were evaluated in 4 °C and 37 °C, respectively. Two cell lines, CHO-K1 and C26, were selected in this test. The cells seeded in each well of 12-well plates (2.5 × 10⁵ per well). After overnight incubation in 37 °C, treatments added to the cells and plates were placed at 4 °C and 37 °C and incubate for another 3 h. Then cells washed with PBS, and trypsinized. The fluorescence intensity for DOX was determined using flow cytometry (BD FACSCalibur cytometer). The data were analyzed with FlowJo version 7.0 software.

Fluorescent Microscopy Evaluation

The number of 1 × 10⁶ cells per well C26 Cells were seeded into 6-well plates in which sterile microscopic cover glass were already inserted. After overnight incubation in 37 °C and 5% humidity, cells were treated with free DOX, Caelyx® and ED-lip for 24 h for complete cell uptake [54]. Then cells washed with PBS and fixed with 4% formaldehyde. Cover glasses stained with Fluoroshield™ with DAPI and were mounted on the glass slides. Treatments were performed in triplicate. From each slide, six zones were selected under × 200 magnification field. Intrinsic fluorescent of DOX was used for evaluation of drug cell uptake. Scaling was performed based on the percentages of cells which shown DOX cell uptake in each microscopic filed:

1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, and 5:80–100%

Evaluation of Cytotoxicity

The IC50 values of free DOX, caelyx®, and ED-lip were determined by MTT assay. In order to do this, CHO-K1 and C26 cells were seeded at density of 5 × 10³ cells per well in 96-well plates at 37 °C. After overnight incubation liposomal formulations and free DOX solution were serially diluted in FBS-free medium and added to cell cultures and incubated 1, 3, and 6 h at 37 °C. Then, cells were washed and allowed to incubate 72 h. The optical densities (ODs) were measured using a spectrometric absorbance of 570 nm against a background of 630 nm on Stat-Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology Inc. USA). Then the IC50 values were calculated.

Animal Study

Female BALB/c mice (4–6 weeks, 18–20 g) were kept in separate cages at 22 ± 2 °C and maintained on standard pellet diet and water ad libitum. Intraperitoneal (i.p) injection of ketamine and xylazine (100 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine) used to anesthetize the animals [55]. The number of 3 × 10⁵ C26 cells per mouse in 60 μl PBS injected at the right flank, subcutaneously. Two weeks after inoculation when tumor sizes grew about 5 mm³ , mice were randomly divided into 3 groups (n =3 for biodistribution and n =5 for antitumor study mice per group). All of the experimental protocols were approved by the Mashhad University of Medical Sciences committee for animal ethics and were performed according to the international rules considering the animal rights.

Biodistribution and Pharmacokinetic Studies

Fourteen days after tumor inoculation, mice were treated with dose of 10 mg/kg of caelyx® and ED-lip intravenously (i.v.) via the tail vain. Control group received 200 μl PBS solution. At certain time-intervals (3, 12, 24, 48, and 72 h) post-injection mice were euthanized and blood samples and tissue samples (liver, spleen, kidney, lung, heart, and tumor) were collected. Then, the concentration of doxorubicin in each sample measured based on fluorescent intensity of each samples using LS-45 fluorescence spectrophotometer (Perkin-Elmer, UK). Doxorubicin concentration of each sample was measured and non-compartmental analysis of the pharmacokinetic parameters were calculated from blood concentration vs. time profiles. Then the parameters including under the concentration-time curve (AUC) and area under the first moment curve (AUMC), half-life (t _1/2 ), volume of distribution (V _d ), C _máximo , T _max,, mean residence time (MRT), and clearance (Cl) were calculated.

In Vivo Antitumor Activity

In order to evaluate antitumor activity, 10 days after tumor inoculation, mice with palpable tumor size were received single i.v. dose of 10 mg/kg Caelyx® and ED-lip. PBS injected in mice which considered as negative control. The parameters including time to reach the endpoint (TTE), percentage of tumor growth delay (TGD), median survival time (MST), and survival were determined. During the study, mice were observed for health and body weight changes. The tumor volume was also measured using a digital caliper and calculated as follows:
$$ \mathrm{Tumor}\ \mathrm{Volume}=\left(\mathrm{Height}\times \mathrm{Length}\times \mathrm{Width}\right)\times 0.52 $$
Considering ethical aspects, mice were removed in case tumor growth was> 1000 mm³ , or> 20% weight loss or sign of weakness was observed.

Statistical Analysis

Data were analyzed using GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA). Data were demonstrated as mean ± SEM of at least three independent experiments. The t test was used in order to evaluate the results of release study, flow cytometry, and biodistribution of the formulations. ANOVA was employed to evaluate the results of fluorescent microcopy and tumor volumes. The Kaplan–Meier method used to calculate the survival parameters include TTE, MST and TGD%. P <0.05 was considered statistically significant.

Disponibilidade de dados e materiais

All data supporting the conclusions of this article are included within the article.

Abreviações

EpCAM:

Epithelial cell adhesion molecule

NDDSs:

Nano drug delivery systems

DOX:

Doxorubicin

EPR:

Enhanced permeability and retention

ECM:

Extra cellular matrix

CSC:

Cancer stem cell

TIC:

Tumor initiating cell

MFI:

Mean fluorescent intensities

MPS:

Mononuclear phagocytic system

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PDI:

Índice de polidispersidade

DLS:

Dynamic light scattering instrument

FBS:

Fetal bovine serum

OD:

Optical density

AUC:

Area under the concentration-time curve

AUMC:

Area under the first moment curve

t _½ :

Half-life

V _d :

Volume of distribution

MRT:

Mean residence time

Cl:

Clearance

TTE:

Time to reach the endpoint

TGD:

Percentage of tumor growth delay

MST:

Median survival time

i.p.:

Intraperitoneally

i.v.:

Intravenously

Um estudo teórico de caso WS2:Desempenho de armazenamento de hidrogênio melhorado por alteração de fase Efeitos do pós-recozimento no desempenho elétrico do fotodetector de Ga2O3 policristalino em safira

Nanomateriais

Metal

Resina

fibra

Material compósito

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias

Nanofibras e filamentos para entrega aprimorada de drogas
Estruturas Metálicas-Orgânicas de Meio Ambiente como Sistema de Administração de Medicamentos para Terapia de Tumor
A administração de nanopartículas de artesunato aumenta a eficiência antitumoral ao ativar a apoptose celular mediada por mitocôndrias
Nanopartículas lipídicas de PLGA rastreadas com 131I como transportadores de administração de drogas para o tratamento quimioterápico direcionado do melanoma
Nanopartículas de albumina carregadas de resveratrol com circulação sanguínea prolongada e biocompatibilidade aprimorada para terapia de tumor pancreático direcionada altamente eficaz
Estudo in vitro da influência das nanopartículas de Au nas linhas celulares HT29 e SPEV
Novel Biocompatible Au Nanostars @ PEG Nanopartículas para imagens In Vivo CT e propriedades de depuração renal
Biossegurança e capacidade antibacteriana do grafeno e do óxido de grafeno in vitro e in vivo
Síntese e desempenho in vitro de nanopartículas de ferro-platina revestidas com polipirrole para terapia fototérmica e imagem fotoacústica
Nanomontagens de ácido 5-aminolevulínico-esqualeno para fotodetecção e terapia de tumor:estudos in vitro

Lipossoma funcionalizado com aptâmero anti-Epcam (Syl3c) para distribuição direcionada de doxorrubicina:estudos de antitumorais in vitro e in vivo em camundongos com carcinoma do cólon C26

Resumo

Introdução

Resultado e discussão

Conjugação de DSPE-mPEG 2000 para Aptamer

Caracterização físico-química do lábio-ED

Perfil de versão DOX

Interação celular e captação celular por microscopia fluorescente

Estudo de Citotoxicidade

Biodistribuição e Farmacocinética

Atividade antitumoral in vivo

Conclusão

Materiais e métodos

Materiais

Conjugação de DSPE-mPEG 2000 para Aptamer

Modificação de Caelyx® com DSPE-mPEG-Anti-EpCAM Aptamer

Caracterização físico-química

Estudo de lançamento

Cultura de células

Ensaio de interação celular e captação celular

Fluorescent Microscopy Evaluation

Evaluation of Cytotoxicity

Animal Study

Biodistribution and Pharmacokinetic Studies

In Vivo Antitumor Activity

Statistical Analysis

Disponibilidade de dados e materiais

Abreviações

Conjugação de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ para Aptamer

Conjugação de DSPE-mPEG ₂₀₀₀ para Aptamer