Um grupo de complexos baseado em PAMAM e pontos quânticos usados em imunoensaios clínicos

Resumo

Nós relatamos um grupo de complexos usados em imunoensaios clínicos. Os complexos incluem uma cabra anti-IgG de coelho conjugada com PAMAM e uma cabra anti-IgG de camundongo conjugada com QDs. Quando o anti-antígeno de coelho e o anti-antígeno de camundongo são adicionados, o antígeno correspondente será detectado. O experimento, usando os complexos, é simples, conveniente, curto em tempo e em etapas curtas. Também é aplicável a diferentes métodos de experimento, como ser usado com FCM (citometria de fluxo), ICC (imunocitoquímica) e IHC (imunohistoquímica) para detectar muitos tipos de antígenos.

Introdução

Os pontos quânticos (QDs) são amplamente usados como luminárias por causa de seus altos rendimentos quânticos de fluorescência, alta fotoestabilidade e baixas propriedades de fotodegradação. Eles também são amplamente utilizados como fluoróforos orgânicos em imagens celulares e aplicações biotecnológicas. Em particular, QDs contendo cádmio (isto é, CdSe e CdTe) têm vantagens significativas porque sob irradiação do mesmo comprimento de onda na faixa de 430-660 nm, eles têm um espectro eletromagnético de emissão dependente do tamanho [1, 2]. Portanto, QDs conjugados com anticorpos são as sondas mais promissoras para imagens moleculares.

O dendrímero de poliamidoamina (PAMAM), como uma das macromoléculas dendríticas mais amplamente e profundamente estudadas, possui as seguintes características:um grande número de grupos funcionais de superfície, um grande número de cavidades dentro das moléculas, um tamanho em nanoescala e alta biocompatibilidade. Quando conjugados com drogas e anticorpos, esses dendrímeros podem melhorar a solubilidade de uma droga e a circulação sistêmica, mas não impedem a atividade biológica da droga [3]. Portanto, os anticorpos modificados com PAMAM são frequentemente usados na imunização clínica.

Os imunoensaios clínicos incluem muitos métodos, como WB, ELISA, IHC (imunohistoquímica), ICC (imunocitoquímica) e FCM (citometria de fluxo). Entre eles, o FCM, que utiliza sondas de anticorpos específicos, realiza uma análise rápida de uma única célula ou outras partículas biológicas no nível celular e molecular. Portanto, o FCM é um dos imunoensaios mais amplamente utilizados. Se a pesquisa de células for realizada, o uso da sonda de anticorpo correspondente é suficiente; no entanto, se a triagem de pequenas moléculas biológicas for desejada, como a de uma pequena proteína, vírus ou citocina, o método CBA (cytometric bead array) deve ser adotado porque o FCM não pode detectar diretamente pequenas citocinas. O método CBA utiliza grânulos marcados com corante construídos com anticorpos de captura específicos na superfície. Quando os grânulos CBA são misturados com a amostra e os anticorpos marcados com corante correspondentes, complexos sanduíche se formarão como no ELISA, e o antígeno pequeno pode ser detectado por FCM.

Neste estudo, apresentamos um grupo de complexos incluindo uma cabra anti-IgG de coelho conjugada com PAMAM e uma cabra anti-IgG de camundongo conjugada com QDs. Este grupo de complexos pode ser usado para FCM, ICC e IHC. Quando o anti-antígeno de coelho e o anti-antígeno de camundongo são adicionados, o antígeno correspondente será detectado. Este modelo pode detectar muitos tipos de antígenos, incluindo pequenas proteínas, vírus e citocinas quando os anticorpos de camundongo e coelho correspondentes estão presentes. Esquema 1 mostra os complexos usados em FCM, tomamos HSP27 como exemplo. A HSP27 também é conhecida como HSPB1 (família de proteínas de choque térmico B número 1) e é uma proteína importante envolvida na resistência a drogas, crescimento celular, apoptose, ocorrência de tumor e metástase, etc [4, 5]. Neste modelo, o IgG de cabra anti-coelho conjugado com PAMAM atua como um transportador e uma captura, semelhante aos grânulos CBA (cytometric bead array), permitindo que os antígenos de pequenas moléculas sejam detectados por FCM. O IgG de cabra anti-camundongo conjugado com QDs atua como uma sonda fluorescente. Se os antígenos são proteínas de membrana ou proteínas intracelulares, podemos usar o método FCM tradicional para detectar os antígenos. Precisamos apenas adicionar os QDs e não a porção PAMAM. Para proteínas intracelulares e proteínas de membrana, as células podem ser consideradas como alvos que podem ser detectados diretamente pelo método FCM; eles não precisam da porção PAMAM para constituir uma pseudocélula. Portanto, podemos dividir os complexos e usá-los individualmente.

Representação de como os complexos são formados e usados pelo FCM para detectar HSP27. Primeiro, o G5 amino PAMAM deve reagir com anidrido succínico para formar PAMAM neutro

Resultados e discussão

O grupo de complexos inclui duas partes, uma parte PAMAM e uma parte QDs. A parte PAMAM é uma IgG de cabra anti-coelho conjugada a PAMAM. Usamos dendrímeros PAMAM terminados em amino de quinta geração (G5 PAMAM) como um agente estabilizador de superfície para fornecer características de solubilidade ideais para ambientes aquosos, mas este dendrímero tem uma carga positiva forte que é prejudicial para a ligação de anticorpos. Para neutralizar a carga positiva, dissolvemos PAMAM em DMSO e adicionamos anidrido succínico (dihidro-2,5-dicetotetrahidrofurano) para neutralizar o grupo amino PAMAM. O grupo amino em PAMAM reage com anidrido succínico para formar ligações amida [6,7,8,9,10]. Após a reação, o produto foi dialisado, liofilizado, pesado e redissolvido, a produção é quase neutra e denominamos o produto “N-PAMAM”, que é capaz de se conjugar com IgG anti-coelho de cabra. PAMAM, especialmente G5 PAMAM, contém um grande número de cavidades, e o IgG pode ser encapsulado dentro dos espaços vazios de G5 PAMAM [11]. IgG anti-coelho de cabra foi primeiro dissolvido em tampão MES (0,1 mol / L, pH 6,0), então EDC e sulfo-NHS (a uma razão molar de 1:1) foram adicionados e a mistura foi incubada por 15 min. Finalmente, N-PAMAM (PAMAM neutro) foi adicionado seguido por incubação a 4 ° C em um leito agitador durante a noite. Este polímero se auto-montou em solução aquosa para formar micelas poliméricas que encapsularam os convidados de baixo peso molecular, de outra forma insolúveis [12]; após a reação, a diálise foi necessária para remover os materiais que não reagiram. Em seguida, a produção foi liofilizada, pesada e redissolvida em tampão de preservação e, por fim, foi feita a IgG de cabra anti-coelho conjugada com N-PAMAM.

Os espectros de fluorescência e UV-vis de N-PAMAM-IgG (cabra anti-coelho) em MES são mostrados na Fig. 1. Comparado com N-PAMAM (PAMAM neutro) e IgG, o pico de emissão de fluorescência de N-PAMAM-IgG era da intensidade mais baixa. O espectro de UV-vis mostra que, em comparação com IgG, tampão MES, PAMAM e N-PAMAM, apenas N-PAMAM-IgG teve um pico de absorção em um comprimento de onda de 200 nm. Quer seja o espectro de fluorescência ou espectro de UV-vis, N-PAMAM-IgG mostra características diferentes em comparação com N-PAMAM e IgG, o que prova indiretamente que N-PAMAM e IgG foram combinados em vez de simplesmente misturados. Para detectar a atividade do anticorpo de N-PAMAM-IgG, ELISA foi realizado. Como mostrado na Fig. 2, a resistência do anticorpo IgG (cabra anti-coelho) não foi perdida após o acoplamento com N-PAMAM.

a Espectro de fluorescência de PAMAM-IgG (cabra anti-coelho) em MES. O comprimento de onda de excitação foi de 548 nm. b Espectros UV-vis de PAMAM-IgG (cabra anti-coelho) em MES e espectros de emissão em uma faixa de comprimentos de onda

Método ELISA para detectar a resistência do anticorpo N-PAMAM-IgG (cabra anti-coelho). N-PAMAM-IgG foi usado como antígeno e diluído em diferentes concentrações. Coelho IgG-HRP foi usado como uma sonda de anticorpo para detectar a resistência de N-PAMAM-IgG. A medição da absorbância foi feita em um comprimento de onda de 450 nm

A parte de QDs é uma IgG de cabra anti-camundongo conjugada a QDs. Os QDs conjugados com anticorpos são geralmente formados por reações de acoplamento cruzado, onde as moléculas de anticorpo se ligam a grupos funcionais, como grupos carboxila ou grupos amino na superfície dos QDs [13, 14]. Neste estudo, usamos pontos quânticos de núcleo / casca CdSe / ZnS solúveis em água estabilizados com ligantes de carboxila e a reação de acoplamento de carbodiimida usando EDC (cloridrato de 1-etil-3- (3- dimetilaminopropil) -carbodiimida). Este método é um dos métodos mais populares para conjugar um anticorpo à superfície de QDs [15,16,17]. As micelas CdSe / ZnS QDs foram incubadas primeiro na presença de EDC e sulfo-NHS em tampão borato (5 mM BS, pH 7,2). Em seguida, foi adicionado IgG de cabra anti-camundongo e a mistura foi incubada a 4 ° C em um leito agitador durante a noite no escuro. Finalmente, 10% de BSA (albumina de soro bovino) foi adicionado para bloquear os QDs que não reagiram, e a produção foi purificada por centrifugação e redissolução sucessivas para remover os materiais que não reagiram. A atividade de anticorpos do IgG conjugado com QDs (cabra anti-camundongo) pode se manter por 3 meses após o armazenamento a 4 ° C no escuro.

O tamanho de partícula do QDs-IgG (cabra anti-camundongo) e QDs em tampão de preservação (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA) são mostrados na Fig. 3 a. Após a reação de acoplamento, o diâmetro dos produtos obviamente aumentou e os produtos apresentaram boa homogeneidade e estabilidade. Essas características são a chave para seu uso como sonda de detecção. Os espectros de fluorescência de QDs-IgG e QDs são mostrados na Fig. 3b, e como mostrado na Fig. 3a, o diâmetro de produção aumentado mostra que o IgG foi combinado com os QDs, mas o pico de emissão de fluorescência de QDs-IgG foi o mesmo como os QDs. Esse resultado significa que o acoplamento de IgG e QDs não alterou as características ópticas dos QDs, o que é útil para sua aplicação em imunoensaios. Para detectar a atividade do anticorpo do QDs-IgG, usamos um método ELISA com uma membrana de PVDF. O anticorpo anti-AKT de camundongo foi diluído para concentrações de 1 μg / ml, 10 μg / ml, 100 μg / ml e 200 μg / ml, e os quatro antígenos de gradiente de concentração foram hibridizados com QDs-IgG (cabra anti-camundongo) na mesma concentração de 0,1 mg / ml. Após hibridização por 40 min a 37 ° C no escuro, a membrana de PVDF foi lavada com PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 vezes, e a membrana de PVDF foi irradiada com luz UV. A intensidade de fluorescência foi mostrada na Fig. 3c, a intensidade de fluorescência aumentou com o aumento da concentração de antígeno, indicando que QDs-IgG tem alta atividade de anticorpo.

a Distribuição do diâmetro hidrodinâmico dos QDs e IgG conjugado com QDs (cabra anti-camundongo). ( a ) Diâmetros de QDs e ( b ) IgG conjugado com QDs (cabra anti-camundongo). O diâmetro médio dos QDs é 64,87 nm, e o do QDs-IgG é 211,4 nm, detectado por DLS. b Espectros de fluorescência de QDs-IgG (cabra anti-camundongo), QDs e tampão de preservação (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA). O pico de emissão de fluorescência de QDs-IgG foi o mesmo dos QDs, indicando que o acoplamento de IgG a QDs não alterou as características ópticas dos QDs. c Método ELISA para detectar a resistência do anticorpo de QDs-IgG (cabra anti-camundongo), a membrana de PVDF foi avaliada com UV

Esta seção apresenta como utilizar este grupo de complexos no FCM. Como mencionado acima, podemos detectar muitos tipos de antígenos, como pequenas proteínas, vírus e citocinas [18], e usamos a proteína HSP27 como exemplo, agora vamos examinar o processo em detalhes. HSP27 está localizado no citoplasma e é secretado em grandes quantidades nas células tumorais, especialmente no câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer epitelial urinário, câncer renal, câncer de mama e câncer de pele melanoma. Como uma pequena parte da HSP27 é secretada extracelular, precisamos lisar a célula para extrair a proteína. Neste experimento, selecionamos duas linhas de células, MCF-7 (células de câncer de mama humano) como o grupo de teste e L02 (células de fígado humano normal) como o grupo de controle. As células foram lisadas para extrair as proteínas intracelulares. As proteínas totais foram coletadas, em seguida, anti-HSP27 de coelho e anti-HSP27 de camundongo foram adicionados de acordo com a concentração de proteína, seguido por incubação a 37 ° C por 50 min. Em seguida, N-PAMAM-IgG foi adicionado à mistura, a mistura foi incubada a 37 ° C por 30 min, e então dividida em dois grupos iguais:um grupo de teste e um grupo PAMAM. Finalmente, QDs-IgG foi adicionado ao grupo de teste e incubado a 37 ° C por 30 min no escuro. A Figura 4 mostra a análise de fluorescência para os dois grupos de células por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência da curva de teste foi muito maior do que a da curva PAMAM no grupo MCF-7, enquanto no grupo L02, as duas curvas quase se sobrepuseram. Quando HSP27 existe em extratos celulares, N-PAMAM-IgG e QDs-IgG irão se ligar indiretamente para formar uma combinação sanduíche na presença de anti-HSP27 de coelho e anti-HSP27 de camundongo. Se o HSP27 não existir, apenas uma pequena quantidade de QDs-IgG se ligará a N-PAMAM-IgG por adsorção não específica. Portanto, se a intensidade de fluorescência da curva de teste for maior do que a da curva PAMAM de controle, HSP27 está contido na amostra. A Figura 4 mostra que as células MCF-7 secretaram mais proteína HSP27 do que as células L02.

Análise de fluorescência de HSP27 por citometria de fluxo. a Células L02. b Células MCF-7. O grupo teste foi incubado com N-PAMAM-IgG e QDs-IgG, grupo PAMAM como controle, que foi incubado apenas com N-PAMAM-IgG para formar uma pseudocélula para proteína micromolécula detectada por FCM. Quando as duas curvas quase se sobrepõem, pode ser determinado que não há HSP27 na amostra; portanto, se QDs-IgG é adicionado ou não, a intensidade de fluorescência não mudará

Como mencionado acima, esses complexos podem detectar proteínas intracelulares secretadas por FCM; em princípio, esses complexos podem ser aplicados a qualquer tipo de antígeno. Além disso, as duas partes da combinação podem ser usadas separadamente. Se o antígeno que queremos detectar está localizado na célula ou na superfície da célula, podemos usar apenas a parte dos QDs. Por exemplo, a β-actina é um dos principais componentes do citoesqueleto localizado nas células e existe amplamente em células eucarióticas. A Figura 5a mostra a análise de fluorescência usada apenas parte QD para β-actina em células HeLa por FCM. As células HeLa foram lavadas e tratadas com metanol para aumentar a penetração na membrana celular e então divididas em dois grupos iguais. O grupo β-actina foi incubado com anti-β-actina de camundongo a 37 ° C por 30 min, e o grupo controle foi incubado com BSA. Após lavagem com PBS, ambos os grupos foram incubados com QDs-IgG (cabra anti-camundongo) a 37 ° C por 30 min. Após lavagem com PBS duas vezes, ambos os grupos foram detectados por FCM. A intensidade de fluorescência da curva β-actina foi muito maior do que a curva de controle, o que indicou que as células HeLa continham a proteína β-actina.

a Análise de fluorescência para β-actina em células HeLa. O grupo β-actina foi incubado com anti-β-actina de camundongo e QDs-IgG (cabra anti-camundongo), e o grupo controle foi incubado com BSA e QDs-IgG. O grupo de controle pode permitir a exclusão da fluorescência de fundo causada pela adsorção inespecífica de QDs-IgG. b Imagens de microscopia de fluorescência de células HeLa sob irradiação UV-vis. DAPI corou os núcleos das células e emitiu fluorescência azul; QDs-IgG indiretamente combinado com β-actina e fluorescência vermelha emitida. Barra de escala 20 μm

Além disso, esses complexos também podem ser aplicados ao ICC. No entanto, para ICC, é necessário que o antígeno alvo esteja localizado na célula ou na superfície da célula e esteja presente em grandes quantidades [19]; caso contrário, o alvo experimental será difícil de distinguir do fundo. Pegamos a proteína β-actina por exemplo e semeou células HeLa em uma placa de células de 10 cm e colocou uma lamela de microscópio nela, use metanol para imobilizar as células. As células foram então incubadas com anti-β-actina de camundongo (PBS, 1% BSA) a 37 ° C por 1 h, lavadas duas vezes com PBST e incubadas com QDs-IgG (cabra anti-camundongo) a 37 ° C no escuro por 1 h. Após lavagem duas vezes com PBST e coloração do núcleo da célula com DAPI, a fluorescência foi detectada com um microscópio de fluorescência [20, 21]. A Figura 5b mostra as imagens do microscópio de fluorescência das células HeLa. A vantagem de QDs como um corante fluorescente é que o sinal de QDs e o sinal de DAPI podem ser observados simultaneamente sob a irradiação do canal ultravioleta; portanto, de acordo com o núcleo, o alvo pode ser obviamente localizado. Neste experimento, β-actina são proteínas do citoesqueleto em torno do núcleo da célula e podem ser obviamente observadas.

Conclusões

Em conclusão, demonstramos a aplicação dos complexos utilizados em imunoensaios clínicos, como FCM e ICC. O grupo de complexos inclui uma cabra anti-IgG de coelho conjugada com PAMAM e uma cabra anti-IgG de camundongo conjugada com QDs. Quando o anti-antígeno de coelho e o anti-antígeno de camundongo foram adicionados, o antígeno correspondente foi detectado. Esses complexos são vantajosos devido ao seu amplo espectro, alta biocompatibilidade, alta estabilidade à luz e baixa toxicidade biológica. Este complexo é um modelo universal que requer apenas que os anticorpos primários correspondentes sejam alterados. Neste artigo, usamos os complexos para detectar HSP27 e β-actina, mas, em teoria, esse processo pode ser aplicado a qualquer tipo de antígeno. Além disso, podemos escolher o método de detecção de acordo com as características dos antígenos, e também podemos dividir os complexos e utilizá-los individualmente de acordo com as reais necessidades. Esse método também permite que pequenas moléculas, como pequenas proteínas e vírus, sejam detectadas por citometria de fluxo. Acreditamos que, com a melhora adequada, também pode ser aplicado a outros métodos, como imunoflurescência (IF), western blot (WB) e fita imunocromatográfica de fluxo lateral (LCS).

Métodos / Experimental

Materiais

Os pontos quânticos CdSe / ZnS (QDs solúveis em água com grupos carboxila, cas no. N / A) foram adquiridos na NEPQD, China. PAMAM (com terminação amino de quinta geração, Lote no. CYD-150A) foi adquirido em CYD, China. IgG de cabra anti-coelho (ab6702) e anti-β-actina de camundongo (ab8226) foram adquiridos na Abcam, UK; anti-HSP27 de rato (BF0624) e anti-HSP27 de coelho (AF6082) foram adquiridos na Affinity, EUA; IgG anti-rato de cabra (bs0296G) foi adquirido na Bioss, China; EDC e sulfo-NHS foram adquiridos de Thermo Fisher; DMEM e soro fetal bovino foram adquiridos da Gibco; e membranas de PVDF (0,2 μm) foram adquiridas da Millipore. Todos os outros reagentes químicos eram do tipo reagente analítico.

Preparação de N-PAMAM-IgG (cabra anti-coelho)

a)
Preparação de N-PAMAM (PAMAM neutro):PAMAM (G5 terminado em amino, MW médio 28826) (60 mg, 2,081 mM) foi dissolvido em DMSO (2 ml) e anidrido succínico (dihidro-2,5-dicetotetrahidrofurano) (0,266 g, 2,66 mM) para neutralizar os grupos amino. Porque um mol de macromoléculas G5 PAMAM tem 128 moles de grupos amino, 60 mg de PAMAM contém grupos amino 0,266 mM, e a razão molar para grupos amino PAMAM e anidrido succínico é de aproximadamente 1:10. Em seguida, a mistura foi misturada em um leito agitador a 100 rpm por 4 h, após o que a solução foi dialisada através de uma membrana de diálise de 3500 MWCO por 24 h, e N-PAMAM foi obtido após liofilização.
b)
Preparação de N-PAMAM-IgG (cabra anti-coelho):tampão MES formulado (100 mM, pH 6,0), em seguida, tomar 100 μl de tampão MES em um tubo, adicionar 20 μM de EDC e 20 μM de sulfo-NHS e agitar usando um vórtice em baixa velocidade. Adicionar 35,7 μl de IgG (pH, 0,5 μM) e agitar em vórtice, depois adicionar 19 μg de N-PAMAM e incubar a 4 ° C durante a noite, finalmente a solução será dialisada através de uma membrana de diálise de 3500 MWCO e 8000 MWCO por 3 dias, após a liofilização o N-PAMAM-IgG será ganho.

Preparação de QDs-IgG (cabra anti-rato)

a)
Formulação de tampão BS:

1.
Prepare o tampão de bórax (50 mM):pese 19,07 g de bórax e dissolva em 1 L de água ultrapura.
2.
Prepare o tampão de ácido bórico (50 mM):pese 3,09 g de ácido bórico e dissolva em 1 L de água ultrapura.
3.
O tampão de pH 8,0 BS e o tampão de pH 7,2 BS foram preparados misturando as duas soluções anteriores.
4.
O tampão de lavagem, também usado como tampão de preservação, foi preparado diluindo o tampão BS de pH 8,0 a uma concentração de 5 mM e adicionando Tween 20 a 0,1%.
5.
A solução de ativação foi preparada diluindo o tampão BS de pH 7,2 até uma concentração de 5 mM e adicionando Tween 20 a 0,1%.
6.
O tampão EDC foi preparado dissolvendo 0,27 g de EDC em 5 ml de solução de ativação e o tampão sulfo-NHS foi preparado dissolvendo 0,378 g de sulfo-NHS em 5 ml de solução de ativação.

b)
Preparação de QDs-IgG (cabra anti-camundongo):

Primeiro, 450 μl de QDs (CdSe / ZnS, 5 mg / ml) foram dissolvidos em 2,25 ml de solução de ativação, então 150 μl de tampão EDC e 150 μl de tampão sulfo-NHS foram adicionados, e a solução foi sonicada em gelo por 5 min. Em segundo lugar, a solução foi centrifugada a 12.000 rpm durante 5 min para remover o sobrenadante e o precipitado foi dissolvido em 1,2 ml de tampão de lavagem. Após 30 min de mistura ultrassônica, 100 μg de anticorpo IgG foram adicionados e a solução foi incubada durante a noite em um leito agitador a uma temperatura de 4 ° C. Terceiro, 150 μl de BSA a 10% foram adicionados, seguido de incubação a 30 ° C por 30 min e centrifugação a 12.000 rpm por 2 min para remover o sobrenadante. O precipitado foi redissolvido em 1 ml de tampão de lavagem e então centrifugado a 12.000 rpm por 2 min, esta etapa foi repetida e finalmente o precipitado foi resolvido em 1 ml de tampão de preservação. No final, foi adicionado 10% de BSA; a mistura foi misturada com mistura de choque ultrassônico completo e centrifugada a 820 g / min para remover o precipitado, com o sobrenadante contendo QDs-IgG. QDs-IgG deve ser armazenado a 4 ° C no escuro por 3 meses. Deve-se ressaltar que as amostras só podem ser armazenadas a 4 ° C, não podendo ser congeladas nem mesmo com glicerina; caso contrário, será causado um grande número de pontos quânticos reunidos em aglomerados, formando precipitação que não pode ser lavada com PBST, o que leva a uma fluorescência de fundo grave.

Análise FCM para a proteína HSP27

O HSP27 está localizado no citoplasma e é secretado em grandes quantidades nas células tumorais. Neste experimento, selecionamos duas linhas de células, MCF-7 (células de câncer de mama humano) como o grupo de teste e L02 (células de fígado humano normal) como o grupo de controle. Os dois grupos de células foram semeados em uma placa de cultura de 10 cm e incubados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C. Quando as células cobriram 80% da placa, as células foram digeridas com tripsina e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram ressuspensas em 1 ml de PBS. Contadas as células com hemocitômetro, foi adicionado tampão de lise celular T-PER de acordo com a concentração celular, em seguida a proteína intracelular foi extraída do lisado celular. Em seguida, o lisado celular foi centrifugado a 14000 rpm por 10 min para coletar o sobrenadante, e a concentração de proteína foi medida pelo método BCA, de acordo com a concentração de proteína, o anti-HSP27 de coelho e o anti-HSP27 de camundongo foram adicionados e incubados em 37 ° C durante 50 min. Neste experimento, a concentração de proteína de L02 foi de aproximadamente 0,2 mg / ml e MCF-7 foi de 0,25 mg / ml, e o volume de ambos foi de 500 μl. Os dois anticorpos, anti-HSP27 de coelho e anti-HSP27 de camundongo, foram adicionados às células (0,625 μl para MCF-7 e 0,5 μl para células L02).

Em seguida, foi adicionado 1 mg / ml de N-PAMAM-IgG às misturas, seguido de incubação a 37 ° C durante 30 min; 6,25 μl foram adicionados ao grupo MCF-7 e 5 μl foram adicionados ao grupo L02. Após a incubação, a produção foi dividida em dois grupos iguais, o grupo teste e o grupo PAMAM. Finalmente, QDs-IgG foi adicionado ao grupo de teste, que foi incubado a 37 ° C por 30 min no escuro. Em seguida, os dois grupos de células foram analisados por citometria de fluxo.

Análise de FCM para a proteína β-actina

A β-actina é uma proteína intracelular que é um dos principais componentes do citoesqueleto e existe amplamente em células eucarióticas. As células HeLa foram semeadas em uma placa de cultura de 10 cm e incubadas em DMEM com FBS a 10% a 37 ° C por 2 dias, então o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram digeridas com tripsina, após o que as células foram centrifugadas a 800 rpm por 3 min para remover o sobrenadante, e 1 mL de metanol frio foi adicionado para ressuspender as células. Após 5 min, as células foram centrifugadas a 800 rpm durante 3 min para remover o sobrenadante e as células foram ressuspensas em 1 ml de PBS. Esta etapa foi repetida e as células HeLa foram divididas em dois grupos iguais. O grupo de teste foi incubado com anti-β-actina de camundongo a 37 ° C por 30 min, e o grupo controle foi incubado com BSA (albumina de soro bovino). Neste experimento, o anti-β-actina de camundongo foi dissolvido em PBST (1% BSA, 5 μg / ml) e 100 μl de IgG foram adicionados a 300 μl do grupo de teste, e uma quantidade equivalente de BSA foi adicionada ao grupo de controle. Após meia hora de incubação, ambos os grupos foram incubados com QDs-IgG (cabra anti-camundongo) a 37 ° C por 30 min. Depois de lavar duas vezes com PBS, ambos os grupos foram avaliados por FCM.

Análise de ICC para a proteína β-actina

As células HeLa foram semeadas em uma placa de cultura de 10 cm e incubadas em DMEM com FBS a 10% a 37 ° C por 1 dia. Em seguida, várias lamínulas esterilizadas foram colocadas no prato de células e as células foram posteriormente cultivadas por 2 dias. As lamínulas foram removidas e lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, as lamínulas foram incubadas em 400 μl de metanol por 20 min em temperatura ambiente. As lamelas foram lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, o tampão de bloqueio foi preparado com PBST (0,1% Tween 20), 22,52 mg / ml de glicina e 10% BSA. Uma lamela foi colocada em tampão de bloqueio e incubada por 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, o tampão de bloqueio foi removido e uma lamela foi incubada com anti-β-actina de camundongo (PBS, 1% BSA) a 37 ° C por 1 h, lavado duas vezes com PBST e incubado com QDs-IgG (anti-cabra mouse) a 37 ° C por 1 h no escuro. Após a lavagem duas vezes com PBST e coloração do núcleo da célula com DAPI por 2 min, a lamela foi enxaguada uma vez com PBS e uma vez com água para visualização em um microscópio de fluorescência.