Complexos Avançados PAMAM-Pontos Quânticos para Imunoensaios Clínicos Rápidos

Resumo

Relatamos um grupo de complexos usados em imunoensaios clínicos. Os complexos incluem um PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra e um QDs conjugado a IgG anti-camundongo de cabra. Quando anticorpos anti-antígeno de coelho e camundongo são adicionados, o antígeno correspondente será detectado. O experimento, usando os complexos, é simples, conveniente, curto em tempo e curto em etapas. Também é aplicável a diferentes métodos experimentais, como ser usado com FCM (citometria de fluxo), ICC (imunoquímica), e IHC (imuno-histoquímica) para detectar muitos tipos de antígenos.

Introdução

Pontos quânticos (QDs) são amplamente usados como luminóforos devido aos seus altos rendimentos quânticos de fluorescência, alta fotostabilidade e baixas propriedades de fotobranqueamento. Eles também são amplamente usados como fluoróforos orgânicos em imagem celular e aplicações biotecnológicas. Em particular, QDs contendo cádmio (CdSe e CdTe) têm vantagens significativas porque, sob irradiação do mesmo comprimento de onda na faixa de 430-660 nm, eles têm espectro de emissão eletromagnética dependente do tamanho. Portanto, QDs conjugados a anticorpos são as sondas mais promissoras para imagem molecular.

O dendrímero poliamidoamina (PAMAM), como um dos macromoléculas dendríticas mais amplamente e profundamente estudadas, tem as seguintes características: um vasto número de grupos funcionais de superfície, um grande número de cavidades dentro das moléculas, tamanho na nanoescala e alta biocompatibilidade. Quando conjugados com fármacos e anticorpos, esses dendrímeros podem melhorar a solubilidade e a circulação sistêmica de um fármaco, mas não impedem sua atividade biológica. Portanto, anticorpos modificados com PAMAM são frequentemente usados em imunização clínica.

Imunoensaios clínicos incluem muitos métodos, como WB, ELISA, IHC (imuno-histoquímica), ICC (imunoquímica) e FCM (citometria de fluxo). Entre eles, o FCM utilizando sondas de anticorpos específicas realiza uma análise rápida de célula única ou outras partículas biológicas nos níveis celular e molecular. Portanto, o FCM é um dos imunoensaios mais amplamente usados. Se a triagem celular for realizada, o uso da sonda de anticorpo correspondente é suficiente; no entanto, se a triagem de pequenas moléculas biológicas for desejada, como a de uma pequena proteína, vírus ou citocina, o método CBA (array de esferas citométrico) deve ser adotado porque o FCM não pode detectar diretamente pequenas citocinas. O método CBA utiliza esferas marcadas com corante construídas com anticorpos de captura específicos na superfície. Quando esferas CBA são misturadas com a amostra e anticorpos marcados com corante correspondentes, complexos sanduíche se formarão como no ELISA, e o pequeno antígeno pode ser detectado por FCM.

Neste estudo, apresentamos um grupo de complexos incluindo um PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra e um QDs conjugado a IgG anti-camundongo de cabra. Este grupo de complexos pode ser usado para FCM, ICC e IHC. Quando anticorpos anti-antígeno de coelho e camundongo são adicionados, o antígeno correspondente será detectado. Este modelo pode detectar muitos tipos de antígenos, incluindo pequenas proteínas, vírus e citocinas quando os anticorpos de camundongo e coelho correspondentes estão presentes. O Esquema 1 mostra os complexos usados em FCM, tomamos HSP27 como exemplo. HSP27 também é conhecido como HSPB1 (proteína de choque térmico família B membro 1) e é uma proteína importante envolvida em resistência a fármacos, crescimento celular, apoptose, ocorrência e metástase de tumor, etc. Neste modelo, o PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra atua como carreador e captura, similar às esferas CBA (array de esferas citométrico), permitindo que pequenos antígenos moleculares sejam detectados por FCM. O QDs conjugado a IgG anti-camundongo de cabra atua como sonda fluorescente. Se os antígenos são proteínas de membrana ou intracelulares, podemos usar o método FCM tradicional para detectar os antígenos. Só precisamos adicionar os QDs e não a parte PAMAM. Para proteínas intracelulares e de membrana, as células podem ser consideradas alvos que podem ser detectados diretamente pelo método FCM; elas não precisam da parte PAMAM para constituir uma pseudocélula. Portanto, podemos dividir os complexos e usá-los individualmente.

Resultados e Discussão

O grupo de complexos inclui duas partes, uma parte PAMAM e uma parte QDs. A parte PAMAM é um PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra. Usamos dendrímeros PAMAM de quinta geração terminados em amino (G5 PAMAM) como agente estabilizador de superfície para fornecer características de solubilidade ideais para ambientes aquosos, mas este dendrímero tem uma forte carga positiva que é prejudicial para a ligação do anticorpo. Para neutralizar a carga positiva, dissolvemos PAMAM em DMSO e adicionamos anidrido succínico (di-hidro-2,5-dicetotetrahidrofurano) para neutralizar o grupo amino do PAMAM. O grupo amino no PAMAM reage com anidrido succínico para formar ligações amida. Após a reação, o produto foi dialisado, liofilizado, pesado e redissolvido, o produto é quase neutro e nomeamos o produto "N-PAMAM", que é capaz de conjugar com IgG anti-coelho de cabra. O PAMAM, especialmente G5 PAMAM, contém um grande número de cavidades, e o IgG pode ser encapsulado nos espaços vazios do G5 PAMAM. IgG anti-coelho de cabra foi primeiro dissolvido em tampão MES (0,1 mol/L, pH 6,0), então EDC e sulfo-NHS (na razão molar de 1:1) foram adicionados, e a mistura foi incubada por 15 min. Finalmente, N-PAMAM (PAMAM neutro) foi adicionado seguido por incubação a 4 °C em agitador orbital durante a noite. Este polímero auto-montou em solução aquosa para formar micelas poliméricas que encapsularam os convidados de baixo peso molecular insolúveis; após a reação, diálise foi necessária para remover materiais não reagidos. Então, o produto foi liofilizado, pesado e redissolvido em tampão de preservação, e finalmente, o N-PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra foi feito.

A fluorescência e espectros UV-vis do N-PAMAM-IgG (anti-coelho de cabra) em MES são mostrados na Fig. 1. Comparado com N-PAMAM (PAMAM neutro) e IgG, o pico de emissão de fluorescência do N-PAMAM-IgG foi de menor intensidade. O espectro UV-vis mostra que, comparado com IgG, tampão MES, PAMAM e N-PAMAM, apenas o N-PAMAM-IgG teve um pico de absorção no comprimento de onda de 200 nm. Seja o espectro de fluorescência ou UV-vis, o N-PAMAM-IgG mostra características diferentes comparado com N-PAMAM e IgG, o que indiretamente prova que N-PAMAM e IgG foram combinados em vez de simplesmente misturados. Para detectar a atividade do anticorpo do N-PAMAM-IgG, ELISA foi realizado. Como mostrado na Fig. 2, a resistência do anticorpo IgG (anti-coelho de cabra) não foi perdida ao acoplar com N-PAMAM.

A parte QDs é um QDs conjugado a IgG anti-camundongo de cabra. QDs conjugados a anticorpos são geralmente formados por reações de acoplamento cruzado, onde moléculas de anticorpo ligam-se a grupos funcionais como grupos carboxila ou amino na superfície dos QDs. Neste estudo, usamos pontos quânticos core/shell CdSe/ZnS solúveis em água estabilizados com ligantes carboxila e a reação de acoplamento carbodiimida usando EDC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida). Este método é um dos métodos mais populares para conjugar um anticorpo à superfície de QDs. As micelas de QDs CdSe/ZnS foram primeiro incubadas na presença de EDC e sulfo-NHS em tampão borato (5 mM BS, pH 7,2). Então, IgG anti-camundongo de cabra foi adicionado, e a mistura foi incubada a 4 °C em agitador orbital durante a noite no escuro. Finalmente, 10% BSA (albumina sérica bovina) foi adicionado para bloquear os QDs não reagidos, e o produto foi purificado por centrifugação sucessiva e redissolução para remover materiais não reagidos. A atividade do anticorpo do QDs conjugado IgG (anti-camundongo) pode manter por 3 meses após armazenamento a 4 °C no escuro.

O tamanho de partícula do QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) e QDs em tampão de preservação (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA) são mostrados na Fig. 3a. Após a reação de acoplamento, o diâmetro dos produtos aumentou obviamente, e os produtos tiveram boa homogeneidade e estabilidade. Essas características são a chave para seu uso como sonda de detecção. Os espectros de fluorescência do QDs-IgG e QDs são mostrados na Fig. 3b, e como mostrado na Fig. 3a, o aumento do diâmetro do produto mostra que o IgG foi combinado com os QDs, mas o pico de emissão de fluorescência do QDs-IgG foi o mesmo que o dos QDs. Este resultado significa que o acoplamento de IgG e QDs não alterou as características ópticas dos QDs, o que é útil para sua aplicação em imunoensaios. Para detectar a atividade do anticorpo do QDs-IgG, usamos um método ELISA com membrana PVDF. O anticorpo anti-AKT de camundongo foi diluído para concentrações de 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml e 200 μg/ml, e os quatro antígenos de gradiente de concentração foram hibridizados com QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) na mesma concentração de 0,1 mg/ml. Após hibridização por 40 min a 37 °C no escuro, a membrana PVDF foi lavada com PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 vezes, e a membrana PVDF foi irradiada com luz UV. A intensidade de fluorescência foi mostrada na Fig. 3c, a intensidade de fluorescência aumentou com o aumento da concentração de antígeno, indicando que QDs-IgG tem alta atividade de anticorpo.

Esta seção introduz como utilizar este grupo de complexos em FCM. Como mencionado acima, podemos detectar muitos tipos de antígenos, como pequenas proteínas, vírus e citocinas, e usamos a proteína HSP27 como exemplo, agora vamos revisar o processo em detalhes. HSP27 está localizado no citoplasma e é secretado em grandes quantidades em células tumorais, especialmente em câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer epitelial urinário, câncer renal, câncer de mama e melanoma. Como uma pequena parte de HSP27 é secretada extracelularmente, precisamos lisar a célula para extrair a proteína. Neste experimento, selecionamos duas linhagens celulares, MCF-7 (células de câncer de mama humano) como grupo de teste e L02 (células hepáticas humanas normais) como grupo controle. As células foram lisadas para extrair proteínas intracelulares. As proteínas totais foram coletadas então anticorpos anti-HSP27 de coelho e camundongo foram adicionados de acordo com a concentração de proteína, seguido por incubação a 37 °C por 50 min. Então N-PAMAM-IgG foi adicionado à mistura, a mistura foi incubada a 37 °C por 30 min, e então dividida em dois grupos iguais: grupo de teste e grupo PAMAM. Finalmente, QDs-IgG foi adicionado ao grupo de teste e incubado a 37 °C por 30 min no escuro. A Figura 4 mostra a análise de fluorescência para os dois grupos de células por citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência da curva de teste foi muito maior que a da curva PAMAM no grupo MCF-7, enquanto no grupo L02, as duas curvas quase se sobrepuseram. Quando HSP27 existe nos extratos celulares, N-PAMAM-IgG e QDs-IgG se ligarão indiretamente para formar uma combinação sanduíche na presença de anticorpos anti-HSP27 de coelho e camundongo. Se HSP27 não existe, apenas uma pequena quantidade de QDs-IgG se ligará a N-PAMAM-IgG por adsorção inespecífica. Portanto, se a intensidade de fluorescência da curva de teste for maior que a da curva controle PAMAM, HSP27 está contido na amostra. A Figura 4 mostra que células MCF-7 secretaram mais proteína HSP27 que células L02.

Como mencionado acima, esses complexos podem detectar proteínas intracelulares secretadas por FCM; em princípio, esses complexos podem ser aplicados a qualquer tipo de antígeno. Além disso, as duas partes da combinação podem ser usadas separadamente. Se o antígeno que queremos detectar está localizado na célula ou na superfície celular, podemos usar apenas a parte QDs. Por exemplo, β-actina é um dos principais componentes do citoesqueleto localizado nas células e amplamente existe em células eucarióticas. A Figura 5a mostra a análise de fluorescência usando apenas a parte QD para β-actina em células HeLa por FCM. Células HeLa foram lavadas e tratadas com metanol para aumentar a penetração da membrana celular e então divididas em dois grupos iguais. O grupo β-actina foi incubado com anti-β-actina de camundongo a 37 °C por 30 min, e o grupo controle foi incubado com BSA. Após lavagem com PBS, ambos os grupos foram incubados com QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) a 37 °C por 30 min. Após lavagem com PBS duas vezes, ambos os grupos foram detectados por FCM. A intensidade de fluorescência da curva β-actina foi muito maior que a da curva controle, o que indicou que as células HeLa continham a proteína β-actina.

Além disso, esses complexos também podem ser aplicados a ICC. No entanto, para ICC, é necessário que o antígeno alvo esteja localizado na célula ou na superfície celular e esteja presente em grandes quantidades; caso contrário, o alvo experimental será difícil de distinguir do fundo. Tomamos a proteína β-actina como exemplo e semeamos células HeLa em uma placa de células de 10 cm e colocamos uma lamínula de microscópio nela, usamos metanol para imobilizar as células. As células foram então incubadas com anti-β-actina de camundongo (PBS, 1% BSA) a 37 °C por 1 h, lavadas duas vezes com PBST, e incubadas com QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) a 37 °C no escuro por 1 h. Após lavagem duas vezes com PBST e coloração do núcleo celular com DAPI, a fluorescência foi detectada com microscópio de fluorescência. A Figura 5b mostra as imagens de microscópio de fluorescência das células HeLa. A vantagem dos QDs como corante fluorescente é que o sinal dos QDs e o sinal do DAPI podem ser observados simultaneamente sob irradiação do canal ultravioleta; portanto, de acordo com o núcleo, o alvo pode ser obviamente localizado. Neste experimento, β-actina são proteínas do citoesqueleto ao redor do núcleo celular e podem ser obviamente observadas.

Conclusões

Em conclusão, demonstramos a aplicação dos complexos usados em imunoensaios clínicos, como FCM e ICC. O grupo de complexos inclui um PAMAM conjugado a IgG anti-coelho de cabra e um QDs conjugado a IgG anti-camundongo de cabra. Quando anticorpos anti-antígeno de coelho e camundongo foram adicionados, o antígeno correspondente foi detectado. Esses complexos são vantajosos devido ao seu amplo espectro, alta biocompatibilidade, alta estabilidade de luz e baixa toxicidade biológica. Este complexo é um modelo universal que apenas requer a mudança dos anticorpos primários correspondentes. Neste artigo, usamos os complexos para detectar HSP27 e β-actina, mas, em teoria, este processo pode ser aplicado a qualquer tipo de antígeno. Além disso, podemos escolher o método de detecção de acordo com as características dos antígenos, e também podemos dividir os complexos e usá-los individualmente de acordo com as necessidades reais. Este método também permite que pequenas moléculas, como pequenas proteínas e vírus, sejam detectadas por citometria de fluxo. Acreditamos que, com melhorias apropriadas, também pode ser aplicado a outros métodos, como imunofluorescência (IF), western blot (WB) e tira imunocromatográfica de fluxo lateral (LCS).

Materiais e Métodos

Materiais

Pontos quânticos CdSe/ZnS (QDs solúveis em água com grupos carboxila, cas no. N/A) foram comprados da NEPQD, China. PAMAM (quinta geração terminada em amino, lote no. CYD-150A) foi comprado da CYD, China. IgG anti-coelho de cabra (ab6702) e anti-β-actina de camundongo (ab8226) foram comprados da Abcam, Reino Unido; anti-HSP27 de camundongo (BF0624) e anti-HSP27 de coelho (AF6082) foram comprados da Affinity, EUA; IgG anti-camundongo de cabra (bs0296G) foi comprado da Bioss, China; EDC e sulfo-NHS foram comprados da Thermo Fisher; DMEM e soro fetal bovino foram comprados da Gibco; e membranas PVDF (0,2 μm) foram compradas da Millipore. Todos os outros reagentes químicos eram de grau analítico.

Preparação do N-PAMAM-IgG (anti-coelho de cabra)

1. Preparação do N-PAMAM (PAMAM neutro): PAMAM (G5 terminado em amino, PM médio 28826) (60 mg, 2,081 mM) foi dissolvido em DMSO (2 ml) e anidrido succínico (di-hidro-2,5-dicetotetrahidrofurano) (0,266 g, 2,66 mM) foi adicionado para neutralizar os grupos amino. Como um mol de macromoléculas G5 PAMAM tem 128 mols de grupos amino, 60 mg de PAMAM contém 0,266 mM de grupos amino, e a razão molar para grupos amino do PAMAM e anidrido succínico é aproximadamente 1:10. Então, a mistura foi misturada em agitador orbital a 100 rpm por 4 h, após o que a solução foi dialisada através de membrana de diálise 3500 MWCO por 24 h, e N-PAMAM foi obtido após liofilização.

2. Preparação do N-PAMAM-IgG (anti-coelho de cabra): formulado tampão MES (100 mM, pH 6,0), então pegue 100 μl de tampão MES em um tubo, adicione 20 μM EDC e 20 μM sulfo-NHS então agite usando vórtex em baixa velocidade. Adicione 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) e agite por vórtex, depois adicione 19 μg N-PAMAM e incube a 4 °C durante a noite, finalmente a solução será dialisada através de membranas de diálise 3500MWCO e 8000MWCO por 3 dias, após liofilização o N-PAMAM-IgG será obtido.

Preparação do QDs-IgG (anti-camundongo de cabra)

1. Formulação do tampão BS:

1. Prepare tampão borax (50 mM): pese 19,07 g de borax e dissolva em 1 L de água ultrapura.

2. Prepare tampão ácido bórico (50 mM): pese 3,09 g de ácido bórico e dissolva em 1 L de água ultrapura.

3. Tampão BS pH 8,0 e tampão BS pH 7,2 foram preparados misturando as duas soluções acima.

4. Tampão de lavagem, também usado como tampão de preservação, foi preparado diluindo o tampão BS pH 8,0 para concentração de 5 mM e adicionando 0,1% Tween 20.

5. Solução de ativação foi preparada diluindo o tampão BS pH 7,2 para concentração de 5 mM e adicionando 0,1% Tween 20.

6. Tampão EDC foi feito dissolvendo 0,27 g de EDC em 5 ml de solução de ativação, e tampão sulfo-NHS foi feito dissolvendo 0,378 g de sulfo-NHS em 5 ml de solução de ativação.

2. Preparação do QDs-IgG (anti-camundongo de cabra):

Primeiro, 450 μl de QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) foi dissolvido em 2,25 ml de solução de ativação, então 150 μl de tampão EDC e 150 μl de tampão sulfo-NHS foram adicionados, e a solução foi sonicada em gelo por 5 min. Segundo, a solução foi centrifugada a 12.000 rpm por 5 min para remover o sobrenadante, e o precipitado foi dissolvido em 1,2 ml de tampão de lavagem. Após 30 min de mistura ultrassônica, 100 μg de anticorpo IgG foi adicionado, então a solução foi incubada durante a noite em agitador orbital a temperatura de 4 °C. Terceiro, 150 μl de 10% BSA foi adicionado seguido por incubação a 30 °C por 30 min e centrifugação a 12.000 rpm por 2 min para remover sobrenadante. O precipitado foi redissolvido em 1 ml de tampão de lavagem então centrifugado a 12.000 rpm por 2 min, esta etapa foi repetida e finalmente resolveu o precipitado em 1 ml de tampão de preservação. No final, 10% BSA foi adicionado; a mistura foi misturada com choque ultrassônico completo e centrifugada a 820 g/min para remover o precipitado, com o sobrenadante contendo QDs-IgG. QDs-IgG deve ser armazenado a 4 °C no escuro por 3 meses. Deve-se notar que as amostras só podem ser armazenadas a 4 °C, e não podem ser congeladas mesmo com glicerina; caso contrário, causará um grande número de pontos quânticos reunidos em aglomerados, formando precipitação que não pôde ser lavada com PBST, isso leva a fluorescência de fundo séria.

Análise FCM para Proteína HSP27

HSP27 está localizado no citoplasma e é secretado em grandes quantidades em células tumorais. Neste experimento, selecionamos duas linhagens celulares, MCF-7 (células de câncer de mama humano) como grupo de teste e L02 (células hepáticas humanas normais) como grupo controle. Os dois grupos de células foram semeados em prato de cultura de 10 cm e incubados em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% soro fetal bovino (FBS) a 37 °C. Quando as células cobriram 80% do prato, as células foram digeridas com tripsina e lavadas duas vezes com PBS. Então, as células foram ressuspensas em 1 ml de PBS. Contou-se as células com hemocitômetro, tampão de lise celular T-PER foi adicionado de acordo com a concentração celular, depois a proteína intracelular foi extraída do lisado celular. Então, o lisado celular foi centrifugado a 14000 rpm por 10 min para coletar o sobrenadante, e a concentração de proteína foi medida pelo método BCA, de acordo com a concentração de proteína, anticorpos anti-HSP27 de coelho e camundongo foram adicionados e incubados a 37 °C por 50 min. Neste experimento, a concentração de proteína de L02 foi aproximadamente 0,2 mg/ml e MCF-7 foi 0,25 mg/ml, e o volume de ambos foi 500 μl. Os dois anticorpos, anti-HSP27 de coelho e camundongo, foram adicionados às células (0,625 μl para MCF-7 e 0,5 μl para células L02).

Então, 1 mg/ml N-PAMAM-IgG foi adicionado às misturas seguido por incubação a 37 °C por 30 min; 6,25 μl foi adicionado ao grupo MCF-7, e 5 μl foi adicionado ao grupo L02. Após incubação, o produto foi dividido em dois grupos iguais, grupo de teste e grupo PAMAM. Finalmente, QDs-IgG foi adicionado ao grupo de teste, que foi incubado a 37 °C por 30 min no escuro. Então, os dois grupos de células foram analisados por citometria de fluxo.

Análise FCM para Proteína β-actina

β-actina é uma proteína intracelular que é um dos principais componentes do citoesqueleto e amplamente existe em células eucarióticas. Células HeLa foram semeadas em prato de cultura de 10 cm e incubadas em DMEM com 10% FBS a 37 °C por 2 dias, então o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram digeridas com tripsina, após o que as células foram centrifugadas a 800 rpm por 3 min para remover o sobrenadante, e 1 ml de metanol frio foi adicionado para ressuspender as células. Após 5 min, as células foram centrifugadas a 800 rpm por 3 min para remover o sobrenadante, e as células foram ressuspensas em 1 ml de PBS. Esta etapa foi repetida, e as células HeLa foram divididas em dois grupos iguais. O grupo de teste foi incubado com anti-β-actina de camundongo a 37 °C por 30 min, e o grupo controle foi incubado com BSA (albumina sérica bovina). Neste experimento, anti-β-actina de camundongo foi dissolvido em PBST (1% BSA, 5 μg/ml), e 100 μl de IgG foi adicionado a 300 μl do grupo de teste, e quantidade equivalente de BSA foi adicionada ao grupo controle. Após meia hora de incubação, ambos os grupos foram incubados com QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) a 37 °C por 30 min. Após lavagem duas vezes com PBS, ambos os grupos foram avaliados por FCM.

Análise ICC para Proteína β-actina

Células HeLa foram semeadas em prato de cultura de 10 cm e incubadas em DMEM com 10% FBS a 37 °C por 1 dia. Então, várias lamínulas esterilizadas foram colocadas no prato de células, e as células foram cultivadas further por 2 dias. As lamínulas foram removidas e lavadas duas vezes com PBS, então as lamínulas foram incubadas em 400 μl de metanol por 20 min à temperatura ambiente. As lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS. Então, tampão de bloqueio foi preparado com PBST (0,1% Tween 20), 22,52 mg/ml glicina e 10% BSA. Uma lamínula foi colocada no tampão de bloqueio e incubada por 30 min à temperatura ambiente. Então, o tampão de bloqueio foi removido, e uma lamínula foi incubada com anti-β-actina de camundongo (PBS, 1% BSA) a 37 °C por 1 h, lavada duas vezes com PBST, e incubada com QDs-IgG (anti-camundongo de cabra) a 37 °C por 1 h no escuro. Após lavagem duas vezes com PBST e coloração do núcleo celular com DAPI por 2 min, a lamínula foi enxaguada uma vez com PBS e uma vez com água para visualização sob microscópio de fluorescência.