Morfologia de superfície regulada de nanofibras compostas de polianilina / ácido polilático por meio de vários dopagem de ácidos inorgânicos para aumentar a biocompatibilidade em engenharia de tecidos

Resumo

Os andaimes nanofibrosos condutores e degradáveis ​​têm grande potencial na promoção do crescimento, proliferação e diferenciação celular sob um campo elétrico externo. Embora o problema de condutividade elétrica inferior em fluidos corporais ainda exista, nanofibras degradáveis ​​à base de polianilina (PANI) podem promover a adesão, crescimento e proliferação celular. Para investigar se o efeito é causado pela morfologia da PANI, selecionamos três ácidos inorgânicos como dopantes no processo de polimerização oxidativa da PANI:ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido perclórico. As nanofibras de compósito de polianilina / ácido polilático (PANI / PLA) obtidas foram caracterizadas por meio de análise SEM, FTIR e XPS, e confirmamos que as nanofibras de PLA foram revestidas com sucesso por PANI sem qualquer alteração na estrutura porosa das nanofibras de PLA. As propriedades mecânicas e degradabilidade in vitro indicaram que a oxidação de dopantes ácidos deve ser considerada e que era provável que tivesse um maior efeito de degradação da oxidação nas nanofibras de PLA. O teste do ângulo de contato demonstrou que as nanofibras de compósito PANI / PLA com diferentes morfologias de superfície têm boa molhabilidade, o que implica que atendem aos requisitos de andaimes de engenharia de tecido ósseo. A rugosidade da superfície e a viabilidade celular demonstraram que diferentes morfologias de PANI na superfície podem promover a proliferação celular. Quanto maior for a rugosidade da superfície da PANI, melhor será a biocompatibilidade. Consequentemente, a morfologia da superfície regulada de nanofibras de compósito PANI / PLA via dopagem com diferentes ácidos tem efeito positivo na biocompatibilidade na engenharia de tecidos.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) é um tipo de rede macromolecular secretada pelas células no estroma extracelular. Apresenta a base de células, tecidos e órgãos, acompanhados de órgãos, e é caracterizada por uma estrutura de grade complexa [1, 2]. Além disso, fornece um local adequado para a sobrevivência e atividade das células, determinando sua forma, controlando sua diferenciação, participando de sua migração e metabolismo e, em última instância, afetando sua sobrevivência, crescimento e morte [3, 4]. Nanofibras de eletrofiação podem simular a ação da matriz extracelular para regular o comportamento celular devido à sua alta área de superfície específica, propriedades mecânicas adequadas e biodegradabilidade. Além disso, as nanofibras de eletrofiação podem ser multifuncionais por modificação de superfície com base na manutenção de sua estrutura porosa. Portanto, as nanofibras de eletrofiação tornaram-se um material candidato promissor na engenharia de tecidos, que é amplamente aplicada na entrega de drogas, regeneração ortopédica, regeneração de nervos e reparo [5,6,7,8,9,10].

Polímeros condutores (por exemplo, polipirrol [PPy], politiofeno [PTH] e polianilina [PANI]) têm boa biocompatibilidade in vitro e in vivo, que pode afetar significativamente a adesão, proliferação e diferenciação celular, bem como a regeneração de tecidos [11,12 , 13]. Dentre esses polímeros condutores, a PANI é considerada um material potencial para engenharia de tecidos e medicina regenerativa devido à sua boa processabilidade, excelente condutividade, boa estabilidade redox e biocompatibilidade [14, 15]. Sob estimulação elétrica, a PANI pode regular a adesão, proliferação, migração e diferenciação celular [16, 17]. Na verdade, vários relatórios concluíram que as nanofibras de compósito condutivo degradável à base de PANI promovem o comportamento da célula sob um campo elétrico [18,19,20,21]. No entanto, isso envolve uma questão crucial de que a condutividade da PANI em ambiente fisiológico (pH =7,4) será enfraquecida por causa da PANI desdopada, que, como estudos anteriores demonstraram, diminui as vantagens da atividade elétrica de promover a proliferação e diferenciação celular [22] . Embora isso apresente claramente uma limitação das nanofibras degradáveis ​​condutivas baseadas em PANI na engenharia de tecido ósseo sob estimulação elétrica externa, elas ainda podem promover a proliferação e o crescimento celular em uma extensão significativa [23, 24]. Aqui, especulamos que a morfologia da superfície da PANI aumenta a rugosidade das nanofibras compostas, o que conduz à adesão, crescimento e proliferação celular.

A polianilina dopada com ácidos inorgânicos geralmente tem boa condutividade elétrica. No entanto, os ânions introduzidos por vários dopantes de ácido inorgânico afetarão a condutividade e a estrutura da polianilina [25,26,27]. Neste artigo, três ácidos inorgânicos comuns, ou seja, ácido clorídrico (HCl, HA), ácido sulfúrico (H ₂ SO ₄ , SA) e ácido perclórico (HClO ₄ , PA), foram selecionados como dopantes em uma polimerização oxidativa in situ PANI. Em seguida, as propriedades mecânicas, molhabilidade, morfologia da superfície, biocompatibilidade e adesão celular de nanofibras de PANI / ácido polilático (PLA) foram investigadas sob diferentes dopantes ácidos. Os resultados indicaram que quanto maior a rugosidade da superfície da PANI, melhor será a proliferação celular, apresentando assim melhor biocompatibilidade.

Métodos / Experimental

Químicos

A anilina (AN) foi adquirida na Sigma, PLA ( M w =60.000) foi adquirido de Solarbio, diclorometano (DCM) foi adquirido de Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., e N, N-dimetilformamida (DMF) foi adquirido de Macklin. Enquanto isso, o persulfato de amônio (APS) foi adquirido da Aladdin, HCl e H ₂ SO ₄ foram adquiridos de Guangzhou Chemical Co., Ltd., e HClO ₄ foi comprado da Macklin.

Preparação de nanofibras de polianilina / ácido polilático

Fabricação de nanofibras de ácido polilático por eletrofiação

Partículas de PLA com uma massa específica foram adicionadas a uma solução mista de DCM e DMF (proporção de volume de 7:3) antes de serem agitadas até se dissolverem, e uma solução mista de PLA a 10% foi obtida. A solução de PLA foi então dispensada em uma seringa e conectada a uma fonte de alimentação de alta voltagem. A máquina de eletrofiação (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) foi ajustada com uma voltagem de 15 kV e a uma distância de 15 cm. As nanofibras de PLA obtidas foram secas a vácuo durante a noite a 40 ° C.

Preparação de nanofibras de polianilina / ácido polilático dopadas com diferentes ácidos inorgânicos

As nanofibras de PLA foram colocadas na câmara da máquina de limpeza de plasma (PCE-6, MTI Corporation, EUA) e descarregadas por 2 min a 30 W de potência de RF. Neste artigo, três ácidos inorgânicos comuns, a saber HCl, H ₂ SO ₄ , e HClO ₄ , foram usados ​​como dopantes para polimerização oxidativa in situ na preparação de nanofibras PANI / PLA [24], e as nanofibras PANI correspondentes foram marcadas como PANI-HA, PANI-SA e PANI-PA, respectivamente, enquanto PANI / PLA nanofibras de nanocompósitos foram rotuladas como PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA e PANI / PLA-PA, respectivamente. O processo de preparação de nanofibras de compósito PLA e PANI / PLA é mostrado na Fig. 1.

Esquema que descreve o processo de preparação de nanofibras de compósito PLA e PANI / PLA

Nanofibras de nanocompósitos PANI / PLA foram preparadas em condições de banho de gelo [16, 28]. O APS e o AN foram adicionados a uma solução ácida 1 M de acordo com uma razão molar de 1:1. Aqui, tomamos o HCl como um exemplo para ilustrar o processo de preparação de nanofibras PANI / PLA. Sob condições de banho de gelo, o AN (930 mg, 0,01 mol) foi adicionado gota a gota a APS (2.280 mg, 0,01 mol) e dissolvido em 50 mL de HCl 1 M. Imediatamente, a membrana de nanofibra de PLA tratada com plasma foi imersa na solução e agitada por 2 ha 0 ° C. Após a reação, a membrana de nanofibra de PLA foi limpa várias vezes com HCl e etanol para remover a PANI não anexada antes de ser seca durante a noite a 40 ° C para obter nanofibras de PANI / PLA-HA, que foram colocadas de lado para uso posterior. As nanofibras compostas PANI / PLA-SA e PANI / PLA-PA foram obtidas seguindo uma abordagem semelhante.

Caracterização

Os testes de tração uniaxial para as nanofibras de PLA e nanofibras de compósito PANI / PLA foram conduzidos por meio de um teste de tensão-tensão (Shimadzu AGX-PLUS, Japão). Aqui, a amostra foi cortada em formato de haltere, com a velocidade de tração mantida em constante 3 mm / min. O módulo de Young foi calculado a partir da região linear de deformação de 0-15% na curva de tensão-deformação e a resistência à tração e a taxa de tração de fratura da curva foram determinadas a partir da fratura da membrana de nanofibra.

A morfologia dos scaffolds de nanofibras foi caracterizada via microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japão) para observar as diferentes morfologias da PANI dopada com diferentes ácidos inorgânicos. Antes da observação SEM, as amostras de nanofibras foram pulverizadas com ouro por 60 s para permitir uma observação mais clara da morfologia. Enquanto isso, a rugosidade da superfície das nanofibras de compósito PANI / PLA foi medida usando microscopia de força atômica (AFM, Bruker Dimension Edge). Para confirmar que a PANI foi completamente carregada nas nanofibras de PLA, a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) foi usada para medir a mudança de comprimento de onda de 2.000 ~ 500 cm ⁻¹ . Espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS; Thermo ESCALAB 250) e Al-Kα foram usados ​​como fontes de emissão de raios-X para determinar a composição da superfície das nanofibras PANI / PLA, enquanto sua molhabilidade foi medida em termos do ângulo de contato de as gotas de água à temperatura ambiente através da análise do ângulo de contato (OCA 15 plus, Alemanha). A degradação das nanofibras foi avaliada usando um método de perda de massa [29, 30]. As membranas de nanofibras foram cortadas em discos de 16 mm e colocadas em 20 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) com um pH de 7,4 antes dos andaimes serem incubados a 37 ° C por 7, 14 e 21 dias e secos a um peso constante .

Biocompatibilidade de andaimes nanofibrosos compostos PANI / PLA

Biocompatibilidade

Neste artigo, a biocompatibilidade dos andaimes nanofibrosos do compósito PANI / PLA foi caracterizada por um experimento de atividade celular de osteossarcoma humano (HOS). As células HOS foram adquiridas do banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai. As células HOS foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco de baixa glicose (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina e 100 U / mL de estreptomicina antes de serem incubadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Quando o crescimento celular atingiu um grau de fusão de 90%, as células foram passadas na proporção de 1:3.

As células HOS tiveram que ser semeadas nas nanofibras PANI / PLA antes do teste de proliferação celular. Aqui, as nanofibras foram colocadas em uma placa de 96 poços de modo que cobrissem completamente o fundo da placa antes de serem esterilizadas por UV por 30 min e por meio de uma solução de etanol a 75% por 30 min. Em seguida, foram lavados com PBS. As nanofibras foram então inoculadas com 1 × 10 ⁴ densidade do poço, enquanto um grupo em branco e um grupo de controle foram configurados simultaneamente. As células foram então incubadas em uma incubadora de células a 37 ° C por um, três e cinco dias, com o meio atualizado a cada dois dias.

A viabilidade celular das nanofibras PANI / PLA foi avaliada usando um ensaio de brometo de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT). Após a incubação em um, três e cinco dias, o meio foi removido da placa de 96 poços e lavado com PBS três vezes antes de ser adicionado 1 mL de DMEM contendo 10% de 5 mg / mL de MTT. O meio foi então incubado a 37 ° C por 4 h e então removido antes de DMSO ser adicionado para dissolver a metilprednisolona. O meio foi vibrado por 10 min e, em seguida, foi determinada a absorbância (BioTek Synergy HTX, EUA).

Imunocoloração fluorescente

As células HOS foram incubadas na incubadora de nanofibras PANI / PLA por 24 he foram lavadas com PBS três vezes. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% por 10 min em temperatura ambiente. As células fixadas foram lavadas com PBS três vezes (10 min de cada vez) e 10 μL de 100 nM de peptídeo marcado com FITC foram adicionados antes de as células serem incubadas por 30 min em temperatura ambiente e, em seguida, lavadas com PBS três vezes (5 min de cada vez ) A actina extracelular das células HOS foi corada, com microscopia confocal (Tipo A1, Nikon, Japão) usada para observar a coloração das células em um aumento de 20 ×.

Adesão celular

A adesão das células HOS nos arcabouços nanofibrosos do compósito PANI / PLA foi observada via MEV. Aqui, o meio de cultura foi removido após a cultura de células HOS de nanofibra PANI / PLA de 24 h e foi então lavado com PBS três vezes antes da adição de PFA a 4%. O meio foi fixado durante a noite a 4 ° C, lavado com PBS três vezes, desidratado com solução gradiente de etanol (30%, 50%, 70%, 85%, 90% e 100%, respectivamente; 20 min de cada vez), e em seguida, liofilizado por 24 h. Antes da observação SEM, as nanofibras foram pulverizadas com platina por 120 s para permitir uma melhor observação.

Atividade da fosfatase alcalina (ALP)

ALP é um dos marcadores de diferenciação de osteoblastos iniciais comumente usados ​​que dependem da expressão da enzima fosfatase alcalina. Aqui, a atividade ALP foi realizada usando o ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S) . As células HOS foram cultivadas em diferentes suportes compostos PANI / PLA para o 7d designado. As células foram lisadas usando 50 μL de Tris-HCl (0,1 M, pH 8) com 0,1% (v / v) de triton X-100. A atividade ALP é analisada pela quantificação da concentração de p -nitrofenol de p -nitrofenilfosfato (PNPP), que é estimado registrando a absorbância a 405 nm. A porcentagem de atividade ALP das células cultivadas ao longo das nanofibras PANI / PLA é calculada comparando a atividade ALP das células cultivadas em nanofibras PLA puras.

Análise estatística

A significância estatística dos resultados foi avaliada por meio de uma análise de variância (ANOVA) usando GraphPad Prism (versão 8.02). Aqui, as diferenças nas propriedades mecânicas, biodegradabilidade in vitro e viabilidade celular entre os diferentes andaimes nanofibrosos de compósito PANI / PLA foram analisadas. Os resultados foram considerados significativos quando p <0,05 (∗) e muito significativo quando p <0,005 (∗∗).

Resultados e discussão

As propriedades mecânicas dos andaimes de engenharia de tecido são indicadores importantes na avaliação de se os andaimes podem suportar a dinâmica dos fluidos. A presença de ácidos inorgânicos pode afetar as propriedades físicas e químicas da matriz de PLA de nanofibras de compósito PANI / PLA no processo de polimerização por oxidação química in situ de PANI. Portanto, é necessário explorar as propriedades mecânicas das nanofibras de compósito PANI / PLA dopadas com ácidos inorgânicos. Aqui, as propriedades mecânicas das nanofibras de compósito PANI / PLA foram avaliadas por meio de um teste de tração, que é mostrado na Fig. 2, incluindo tensão-deformação, módulo de Young, resistência à tração e alongamento na ruptura. Conforme mostrado na Fig. 2a, as nanofibras de PLA exibiram um comportamento elástico linear, e as nanofibras de compósito PANI / PLA-HA e PANI / PLA-SA exibiram comportamento de rendimento claro, enquanto as nanofibras de compósito PANI / PLA-PA quebraram imediatamente após a deformação elástica . O módulo de Young (Fig. 2b) das nanofibras de compósito PANI / PLA foi maior do que o das nanofibras de PLA. Em comparação com PLA, o aumento no módulo de elasticidade de PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA e PANI / PLA-PA foi de 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 e 28,43 ± 8,34 MPa, respectivamente. Em termos de resistência à tração (Fig. 2c) e razão de tração à fratura (Fig. 2d), os de PANI / PLA-HA e PANI / PLA-PA diminuíram, enquanto os de PANI / PLA-SA aumentaram ligeiramente; a resistência à tração e o alongamento na ruptura de PANI / PLA-PA foram os mais baixos. Em comparação com as nanofibras de PLA, a resistência à tração de PANI / PLA-HA e PANI / PLA-PA diminuiu em 0,15 ± 0,01 e 0,64 ± 0,03 MPa, respectivamente, enquanto a de PANI / PLA-SA aumentou ligeiramente em 0,13 ± 0,05 MPa. O alongamento na ruptura de PANI / PLA-HA e PANI / PLA-PA diminuiu em 16,93 ± 1,38% e 35,42 ± 3,94%, respectivamente, enquanto o de PANI / PLA-SA aumentou em 3,32 ± 0,13%.

Propriedades mecânicas de nanofibras de PLA e nanofibras de compósito PANI / PLA. a Curvas de tensão-deformação representativas, b Módulo de Young, c resistência à tração na ruptura, d alongamento na ruptura

Conforme mostrado na Fig. 2, os ácidos inorgânicos selecionados podem aumentar o módulo de elasticidade das nanofibras de PLA através da conexão do revestimento PANI. Em termos de resistência à tração e alongamento na ruptura, em comparação com nanofibras de PLA, as propriedades mecânicas de PANI / PLA-HA e PANI / PLA-SA variaram em graus diferentes, enquanto as de PANI / PLA-PA diminuíram mais claramente, e logo como a tensão foi aplicada durante o teste, uma fratura ocorreu em menos de 5 s. Esses resultados podem ser devido à oxidação de HClO ₄ , que resultou na clivagem da ligação éster na cadeia molecular do PLA e na decomposição oxidativa do grupo carboxila, subsequentemente levando a propriedades mecânicas inferiores [31]. Enquanto isso, as diferentes propriedades mecânicas de PANI / PLA-HA e PANI / PLA-SA podem estar relacionadas à densidade diferente da PANI dopada por HCl e H ₂ SO ₄ , enquanto a introdução do APS no processo de reação também pode ter tido um leve impacto nas nanofibras de PLA, com o efeito abrangente desses fatores exibindo diferentes propriedades mecânicas [32].

A adesão, proliferação e diferenciação celular são afetadas pela morfologia, com uma superfície rugosa geralmente considerada favorável à adesão celular [33]. A hidrofobicidade das nanofibras de PLA implica que a polimerização uniforme da PANI apresenta uma barreira, enquanto o tratamento da superfície das nanofibras de PLA com plasma pode melhorar significativamente a molhabilidade [34]. Após a polimerização in situ à base de PANI com diferentes dopantes de ácido inorgânico, nanofibras de compósito PANI / PLA com deposição superficial uniforme foram obtidas.

A morfologia PANI na superfície das diferentes fibras PANI / PLA foi observada via FE-SEM (Fig. 3). A figura mostra claramente que a superfície das nanofibras de PLA foi coberta por muitas nanopartículas irregulares e que as nanofibras de compósito PANI / PLA dopadas com os ácidos inorgânicos foram capazes de manter uma boa morfologia da fibra e estrutura de nanofibras porosas. As observações da morfologia revelaram que as nanofibras de compósito PANI / PLA foram carregadas com sucesso com PANI, que forneceu uma base para a adesão e proliferação celular. Enquanto isso, AFM foi usado para medir a rugosidade da superfície das nanofibras de compósito PANI / PLA, como mostrado na Fig. 4. Ra, o valor médio da rugosidade da superfície em três posições diferentes de cada amostra, é geralmente usado para avaliar a rugosidade da superfície da amostra. Além disso, o Ra das nanofibras de compósito PANI / PLA foi maior do que o das nanofibras de PLA, e o Ra de PANI / PLA-PA foi o mais alto. Este aumento na rugosidade da superfície acelerou a área de superfície e a polaridade, potencialmente fornecendo mais locais de crescimento para as células e promovendo a adesão celular.

Morfologia de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA e d Nanofibras compostas PANI / PLA-PA

Imagem AFM e rugosidade da superfície (Ra) de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA e d Nanofibras compostas PANI / PLA-PA

A adesão, migração e proliferação celular são significativamente afetadas pela molhabilidade dos andaimes [35, 36]. Em geral, a molhabilidade é avaliada em termos do ângulo de contato entre o andaime e a água. Dado que o PLA é hidrofóbico, medimos o ângulo de contato das gotículas de água na membrana de nanofibra em 1 s, como mostrado na Fig. 5, e os ângulos de contato das nanofibras PANI / PLA após o tratamento diminuíram significativamente. Os ângulos de contato correspondentes de PLA, PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA e PANI / PLA-PA foram 112 °, 61,6 °, 36,7 ° e 37,2 °, respectivamente. A morfologia da PANI da PANI / PLA aumentou a energia superficial do sistema, com a área de contato aumentando no contato inicial com a água, resultando na diminuição do ângulo de contato e na melhora da molhabilidade. O ângulo de contato das nanofibras compostas mudou para 0 ° após 5 s de contato com a água, demonstrando boa hidrofilicidade. Este arcabouço hidrofílico também forneceu condições favoráveis ​​para adesão e difusão celular [37], uma vez que os grupos funcionais contendo oxigênio (por exemplo, –OH e –COOH) na superfície do PLA foram mais ligados à superfície da nanofibra após o tratamento de plasma, e o PANI morfologia e grupos funcionais contendo oxigênio trabalharam juntos para garantir que as nanofibras de compósito PANI / PLA fossem, no final das contas, completamente umedecidas [38, 39].

Ângulo de contato de a Nanofibras de PLA, b PANI / PLA-HA, c PANI / PLA-SA e d Nanofibras compostas PANI / PLA-PA

Os espectros de FTIR de PANI pura e nanofibras de compósito PANI / PLA dopados por diferentes ácidos inorgânicos são mostrados na Fig. 6. No espectro de PANI dopado puro (Fig. 6a), os picos característicos fortes em 1.565, 1.485, 1.298 e 1.125 cm ⁻¹ correspondem a um alongamento C =C dos anéis quinóide e um alongamento C =C, alongamento C – N e alongamento =C – H dos anéis benzenoides, respectivamente. No espectro de PANI dopado puro (Fig. 6b), além do pico de PANI característico, um pico de PLA também pode ser visto (picos de vibração de alongamento C – O de 1092 e 1184 cm ⁻¹ , C =O pico de vibração de alongamento de 1757 cm ⁻¹ ) Esses resultados indicam que a PANI foi carregada com sucesso na superfície das nanofibras PANI / PLA dopadas com ácidos inorgânicos. Para investigar melhor a composição química das nanofibras PANI / PLA, o XPS foi usado para analisar sua composição de superfície. Além disso, nos espectros de XPS (Fig. 7a), picos claros de N1s eram visíveis a ~ 400 eV em nanofibras de compósito PANI / PLA. Além disso, os picos de Cl2p foram visíveis a ~ 200 eV em PANI / PLA-HA e PANI / PLA-PA, enquanto a intensidade de pico de Cl2p com PANI / PLA-PA foi maior do que com PANI / PLA-HA. Um pico de S2p apareceu em ~ 210 eV no espectro XPS em PANI / PLA-SA. Os espectros de XPS indicaram que Cl ^- , SO ₄ ²⁻ , e ClO ₄ ^- foram dopados nas nanofibras PANI / PLA correspondentes. Além disso, os átomos de nitrogênio imino da PANI foram completamente ou parcialmente oxidados para produzir uma série de estados de oxidação acompanhados por vários graus de protonação. As mudanças no estado de oxidação e o nível de protonação de PANI foram medidos em termos de espectros de nível nuclear N1s (Fig. 7b-d). Cada espectro N1s pode ser deconvoluído em quatro componentes principais com energias de ligação de aproximadamente 398,7, 399,6, 400,4 e 401,8 eV, que podem ser atribuídos à quinonoide imina (–N =), amina benzenoide (–NH -), amina protonada (- N ⁺ ) e imina protonada (=N ⁺ ), respectivamente [40, 41]. Com referência ao estudo de Kumar [42], o pico de ajuste do espectro N1s foi considerado afetado pela carga nos ânions ligados pelos átomos N protonados, o que resultou em deslocalização e uma ligeira mudança.

Espectros FTIR de a PANI, b Nanofibras de compósito PLA e PANI / PLA

Espectro XPS ( a ) de andaimes de nanofibras de compósito PANI / PLA preparados e PANI / PLA-HA ( b ), PANI / PLA-SA ( c ), e PANI / PLA-PA ( d ) do sinal de nível central de N1s

Como um modelo para a reparação e regeneração de tecidos, os andaimes bioativos são degradados e excretados para fora do corpo após a reparação induzida de células e tecidos [43]. Neste artigo, as propriedades de degradação dos andaimes de nanofibras foram avaliadas usando um método de perda de massa, como mostrado na Fig. 8. A perda de massa de todas as amostras aumentou em 7, 14 e 21 dias, e as taxas de perda de massa do PLA as nanofibras foram 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% e 12,65 ± 0,83%, respectivamente. Enquanto isso, a perda de massa das nanofibras de compósito PANI / PLA-PA aumentou gradualmente após a polimerização oxidativa in situ, com as taxas de perda de massa de 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% e 40 ± 2,54% em 7, 14 e 21 dias, respectivamente, que foram significativamente maiores do que as nanofibras PANI / PLA-HA e PANI / PLA-SA. No processo de polimerização oxidativa PANI in situ, a presença do oxidante APS poderia ter destruído a ligação éster no PLA e induzido uma reação de hidrólise, resultando em microfissuras nas nanofibras de PLA. Com o prolongamento do tempo de imersão do PBS, as microfissuras gradualmente se acumularam e a matriz do PLA começou a se degradar gradativamente. A PANI carregada na superfície também caiu, resultando em uma taxa de perda de qualidade da nanofibra. Com o aumento do tempo, a relação de perda de massa tornou-se mais clara. Aqui, a forte oxidação de HClO ₄ agravou a degradação do PLA e acelerou a perda de massa das nanofibras PANI / PLA-PA, o que é consistente com as propriedades mecânicas apresentadas na Fig. 2.

Propriedades de degradação de nanofibras de PLA e PANI / PLA

A biocompatibilidade dos andaimes bioativos é a base para a promoção da adesão, crescimento e proliferação celular [44]. Aqui, estudamos a proliferação celular de HOS em nanofibras de compósito PLA e PANI / PLA para ilustrar a adesão e biocompatibilidade concomitante. Durante o tratamento químico e funcionalização [45], uma série de fatores potenciais de influência podem entrar em jogo na preparação de andaimes bioativos. Portanto, investigar sua biocompatibilidade é fundamental para avaliar sua aplicação prática.

Para investigar a biocompatibilidade de nanofibras de compósito PANI / PLA, sua viabilidade celular foi avaliada usando um método MTT. A Figura 9 mostra a atividade celular incubada em nanofibras de compósito PLA e PANI / PLA após 1, 3 e 5 dias. A figura mostra claramente que com o prolongamento do tempo de incubação, a atividade celular das nanofibras aumentou gradativamente; as células PANI / PLA-PA exibiram a melhor atividade, e a atividade celular após uma cultura de cinco dias foi a mais alta.

Viabilidade celular HOS cultivada por 1, 3 e 5 dias em nanofibras de PLA e nanofibras de compósito PANI / PLA (* p <0,05; ** p <0,005)

O PLA é biodegradável, mas hidrofóbico, o que significa que não conduz à adesão, crescimento e proliferação celular. Após o tratamento com plasma, a superfície das nanofibras de compósito PANI / PLA foi carregada com grupos contendo oxigênio, e a superfície funcional demonstrou boa hidrofilicidade. A morfologia acima e os resultados de AFM indicam que a PANI dopada com diferentes ácidos inorgânicos exibiu diferentes morfologias e níveis de rugosidade na superfície das nanofibras de PLA. Enquanto isso, as nanofibras de compósito PANI / PLA exibiram excelente molhabilidade. Portanto, consideramos que as diferentes morfologias da PANI dopada com ácidos inorgânicos levaram ao aumento da energia de superfície e da polaridade das nanofibras de compósito PANI / PLA, o que consequentemente afetou o crescimento, migração e proliferação celular, resultando em melhor desempenho em termos da atividade celular [46].

Para estudar ainda mais o comportamento celular das nanofibras de compósito PANI / PLA, o crescimento e a adesão nas nanofibras foram observados por meio de imunocoloração por fluorescência (Fig. 10) e SEM (Fig. 11). Aqui, comparamos a actina e a morfologia celular na superfície de diferentes nanofibras. Quando as células cresceram nas fibras PLA e nanofibras PANI / PLA, os feixes de actina demonstraram um bom estado de alongamento. Enquanto isso, a densidade celular das nanofibras de compósito PANI / PLA foi maior do que a das nanofibras PLA do grupo controle, com a densidade de crescimento celular seguindo a ordem PANI / PLA-PA> PANI / PLA-SA> PANI / PLA-HA. As células HOS cresceram nas nanofibras PANI / PLA e aderiram em uma forma multipolar plana. Claramente, muitas células foram incorporadas nos poros das fibras PANI / PLA, mas foram mal esticadas nas nanofibras de PLA e não puderam ser totalmente expandidas. Esses resultados indicam que as nanofibras de compósito PANI / PLA podem promover a adesão e proliferação de células HOS.

Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h

SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h

Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.

As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.

Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)

Conclusões

In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.

Disponibilidade de dados e materiais

The authors declare that the materials and data are promptly available to readers without undue qualifications for material transfer agreements. Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo.

Abreviações

PANI:

Polianilina

PLA:

Polylactic acid

ECM:

Extracellular matrix

PPy:

Polypyrrole

PTH:

Polythiophene

AN:

Aniline

DCM:

Diclorometano

DMF:

N , N -Dimethylformamide

APS:

Ammonium persulfate

HOS:

Human osteosarcoma cells

DMEM:

Meio Eagle modificado de Dulbecco

PBS:

Phosphate buffer saline

MTT:

3–2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

FE-SEM:

Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo

XPS:

espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

ALP:

Alkaline phosphatase

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