Estudo de toxicidade de nanopartículas de perovskita em células epiteliais das vias respiratórias

Resumo

A pesquisa sobre a toxicidade das nanopartículas tem se desenvolvido nos últimos anos devido à sua crescente prevalência em materiais comuns do dia-a-dia. Foi relatado que várias nanopartículas promovem e induzem a secreção de muco, o que pode levar a danos nas vias aéreas e complicações respiratórias. Lantânio estrôncio manganita (LSM) é uma nanopartícula amplamente utilizada em células de combustível solar oxidadas (SOFCs) devido à sua alta condutividade elétrica, alta atividade eletroquímica para O ₂ reação de redução, alta estabilidade térmica e compatibilidade de eletrólitos SOFC e, o mais importante, sua estabilidade microestrutural e desempenho de longo prazo. Muito poucos estudos foram realizados sobre a toxicidade do LMS, portanto, seu efeito nas células das vias aéreas foi investigado neste estudo. Depois de tratar as células da traqueia com concentrações crescentes de LSM variando até 500 μg / ml, descobrimos que ele tem um efeito moderado na viabilidade celular, produção de ROS, citocromo C e expressão da caspase 3. Apesar de seu impacto mínimo nas características declaradas de indução de apoptose, o LSM ilustrou um efeito inibidor na secreção de muco. Obtivemos uma tendência de diminuição na secreção de muco com o aumento da concentração do tratamento com LSM. No geral, o avanço do LSM em SOFCs exigiu um estudo de toxicidade e, embora não mostre uma toxicidade significativa para as células da traqueia, o LSM reduz a secreção de muco e pode potencialmente interferir na limpeza das vias aéreas.

Introdução

Lantânio estrôncio manganita (LSM) é uma nanopartícula equipada com uma estrutura de cristal à base de perovskita. Ele assume a forma geral de “ABO3,” onde lantânio e estrôncio estão no sítio A e manganês no sítio B. Isso leva à sua fórmula geral de La _{1 - x} Sr _x MnO ₃ , em que x representa os níveis de dopagem de estrôncio que dependem da aplicação da nanopartícula. O LSM pode ser usado na forma de pó como fundição de fita, spray de ar / térmico / plasma e para aplicações em células de combustível [1,2,3,4].

No esforço recente para reduzir a poluição e criar uma economia baseada no hidrogênio, muitas pesquisas têm se concentrado nas células a combustível de óxido sólido (SOFCs) [5, 6]. Por sua vez, as perovskitas LSM têm atraído a atenção da pesquisa devido ao seu papel significativo em SOFCs como um de seus materiais de eletrodo mais importantes [4, 7]. As nanopartículas do LSM são partículas esféricas de metal de alta superfície que aparecem como um pó cristalino marrom ou preto. Embora numerosos estudos sobre as propriedades mecânicas e elétricas do LSM tenham sido conduzidos [1, 3, 8, 9], muito pouca pesquisa se concentrou em seus efeitos biológicos [10,11,12]. Numerosas nanopartículas ilustraram tendências para promover a secreção e o acúmulo de muco, portanto, estão relacionadas a doenças respiratórias [13, 14]. Pesquisas sobre nanopartículas de LSM mostram idéias promissoras para aplicações biomédicas [15,16,17]. Recentemente, pesquisas sobre LSM mostraram seu potencial para terapia anticâncer [12, 18, 19]. Com os procedimentos de síntese e modificações de superfície corretos, o LSM tem a capacidade de ser um contraste de ressonância magnética e um agente de hipertermia, bem como um portador de drogas [20,21,22]. No entanto, a possibilidade de toxicidade deve ser avaliada antes de novas aplicações médicas. Existem apenas estudos limitados sobre o efeito de toxicidade da perovskita [10, 23], e não há nenhum efeito de toxicidade significativo que tenha sido relatado até agora.

Neste estudo, investigamos a toxicidade de nanopartículas de LSM, enquanto eram expostas a células epiteliais traqueais primárias para determinar a faixa de concentração de toxicidade. Em seguida, analisamos a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os danos às mitocôndrias, juntamente com a resposta da secreção de muco com microscopia fluorescente [24]. O nível de progressão da apoptose com ou sem nanopartículas de LSM foi examinado com citocromo C e ensaios de caspase 3 [25].

Resultados e discussões

Caracterização de NPs e ensaio de viabilidade celular

A toxicidade das nanopartículas depende de suas propriedades físicas, como geometria, distribuição de tamanho e área de superfície. Antes dos experimentos de toxicidade, essas características foram analisadas usando MEV. As nanopartículas LSM ilustraram aspereza de superfície significativa e foram distribuídas em agregados de vários tamanhos, aproximadamente 35 nm a 200 nm de diâmetro (Fig. 1).

Imagem SEM das características físicas do LSM. O tamanho de partícula única tinha cerca de 35 nm de diâmetro e a agregação do tamanho do LSM variou de 200 nm a alguns μm

Conduzimos vários experimentos de toxicidade em células das vias aéreas da traqueia com uma variedade de NPs em nosso estudo anterior [26, 27], portanto, essa linha celular foi escolhida para este estudo biológico. A fim de avaliar a toxicidade geral do LSM nas células da traqueia, o ensaio colorimétrico de viabilidade das células CCK8 foi realizado [25, 27]. Conforme visto na Fig. 2; ensaio de viabilidade celular, houve uma mudança dramática na população ocorrendo nas concentrações de 50 a 100 μg / ml de LSM. No entanto, em concentrações de LSM superiores a 100 μg / ml, a população manteve-se em uma faixa relativamente estável, não mostrando alterações significativas.

Viabilidade das células da traqueia após aumentar a concentração de LSM, mostrada aqui como Log [ng / ml]. O ensaio colométrico de viabilidade de células CCK8 foi usado para medir, e sua média por incremento de concentração foi calculada. ( n > 6)

Produção de ROS e liberação de Mucin

A produção de ROS estimula a apoptose e, portanto, contribui para a citotoxicidade das nanopartículas. De acordo com a Fig. 3; A produção de ROS, aumentando a concentração de LSM não afeta muito a produção de ROS. A concentração de LSM de 250 μg / ml diferiu mais do controle, mas seu desvio não foi significativo, indicando que o LSM não tem efeito notável na produção de ROS.

Produção de ROS de células da traqueia após aumentar as concentrações de LSM. As razões de produção de ROS por cada tratamento de concentração de LSM foram calculadas em comparação com o grupo de controle. ( n > 100)

Da Fig. 4; muco bata, após um tratamento de 15 minutos, não houve efeito significativo na viabilidade celular e, à medida que as concentrações de LSM aumentaram, a secreção de mucina diminuiu. A liberação de mucina foi reduzida para até 40% quando as células foram tratadas com 500 μg / ml de LSM e poderia ser reduzida ainda mais com concentrações ainda maiores de LSM. Esta redução sugere que o LSM tem um efeito inibitório na liberação de muco.

A secreção de mucina resulta após tratamentos de 15 min de concentrações crescentes de LSM. As proporções foram calculadas para cada concentração de LSM comparando-a com o grupo de controle. A avaliação das secreções de mucina da superfície celular foi feita por ELLA (ensaio de lectina ligada a enzima). (*: n > 6, p <0,05)

Dano mitocondrial e processos de apoptose

O estágio inicial da apoptose é tipicamente representado por dano mitocondrial. Para analisar esse fenômeno, o corante JC-1 foi usado como indicador do potencial da membrana mitocondrial. A razão de intensidade induzida pelo corante JC-1 se correlaciona com a perda de integridade mitocondrial e, de acordo com a Fig. 5, conforme as concentrações de LSM aumentaram, o dano mitocondrial aumentou significativamente após 100 μg / ml de tratamento com LSM. Embora os resultados mostrem que o dano mitocondrial é significativo após 100 μg / ml de tratamento com LSM, a caspase3 e o citocromo C mostram ligeiras diminuições, conforme detalhado abaixo. Este resultado sugere que o LSM pode causar danos às mitocôndrias, mas as células ainda têm a capacidade de permanecer em um nível baixo na progressão da apoptose e reduzir a expressão do marcador de apoptose.

Resultados de intensidade fluorescente do corante indicador JC-1 em quatro condições diferentes de tratamento em células da traqueia para indicar integridade mitocondrial. (*, **, ***: n > 100, p <0,05)

A apoptose também pode ser medida através da expressão de citocromo C e caspase 3. Como mostrado na Fig. 6a; resultado de apoptose no citocromo C, houve uma diminuição moderada nas taxas de apoptose entre as diferentes concentrações de LSM e o grupo de controle. Essa mesma tendência pode ser vista na Fig. 6b; resultado de apoptose na caspase 3, indicando toxicidade mínima devido ao LSM. No geral, o dano mitocondrial e os resultados de apoptose nas células da traqueia das vias aéreas devido ao LSM foram muito baixos, sugerindo que o LSM não tem efeito tóxico significativo nas células epiteliais da traqueia.

Resultados de apoptose medidos por meio de a expressão do citocromo C, b expressão da caspase 3. As proporções foram obtidas por tratamento de concentração de LSM em comparação com o grupo de controle (HBSS). (*: n > 100, P <0,05)

Conclusões

Estudos recentes de nanotoxicidade têm atraído muita atenção sobre os efeitos tóxicos dos NPs devido ao seu amplo uso em produtos industriais e comerciais. A maior preocupação da nanotoxicidade é devido à geração de ROS. Por exemplo, TiO ₂ NPs estão sendo considerados um tipo de material cancerígeno devido à grande quantidade de ROS geradas que podem levar à morte celular e mutações [28]. Existem diferentes tipos de materiais e compostos classificados como perovskita que foram relatados nos últimos anos em uma variedade de aplicações diferentes. Este é o primeiro estudo a determinar a toxicidade do LSM nas células epiteliais das vias aéreas, que são um dos principais caminhos para as células captarem NPs. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito do LSM nas células da traqueia em um esforço para avaliar sua toxicidade. Os resultados mostraram que o LSM não tem nenhum efeito significativo na progressão da apoptose medida pelas expressões do citocromo C e caspase 3, integridade da mitocôndria medida pela fluorescência JC-1, sobrevivência celular e produção de ROS. No entanto, o tratamento mostrou um efeito de supressão na secreção de muco, diminuindo a produção de muco à medida que as concentrações de LSM aumentaram. Em última análise, por meio dos resultados obtidos neste estudo, o LSM foi considerado não tóxico para as células epiteliais das vias aéreas, não causando alterações significativas nos estágios de apoptose, além de diminuir a secreção de muco que pode comprometer a viabilidade celular. Isso sugere o potencial do LSM de interferir na eliminação de muco das vias aéreas. Em nosso estudo, demonstramos o potencial de toxicidade para os NPs do LSM e os resultados mostram que o risco potencial do efeito tóxico é relativamente menor do que outros NPs que foram usados para aplicação industrial e comercial. No entanto, pesquisas adicionais devem ser feitas para determinar se o LSM pode ser incorporado com segurança como um ingrediente ativo em produtos comerciais de armazenamento de energia e energia solar.

Materiais e métodos

Cultura de células primárias da traqueia

As células epiteliais primárias da traqueia foram isoladas do epitélio brônquico bovino normal seguindo protocolos previamente publicados [26]. As células foram cultivadas e mantidas em meio sem soro (SFM) suplementado com fator de crescimento epidérmico recombinante humano pré-qualificado 1-53 (EGF 1-53) e extrato de hipófise bovina (BPE) (Thermo Fisher). As células primárias da traqueia foram cultivadas em placas Falcon de 15 cm pré-revestidas de colágeno () e incubadas em uma incubadora umidificada a 37 ° C, 5% de CO ₂ . As contagens de células foram realizadas usando exclusão de azul de tripano (Sigma) e um hemocitômetro Bright-Line. As células foram eliminadas quando a confluência atingiu 80%.

Preparação da célula

As células foram semeadas em 5 × 10 ⁴ células por poço em uma placa de 96 poços revestida com colágeno (75% de confluência) para ensaios de viabilidade celular, 5 × 10 ⁵ células por poço em uma placa de 4 poços revestida com colágeno (75% de confluência) para Ca ²⁺ sinalização, ROS e análise de mitocôndrias. Após a semeadura, as células foram incubadas por 24 h em SFM suplementado com EGF humano recombinante pré-qualificado 1-53 e BPE (Thermo Fisher). Após 24 h de incubação, o meio foi removido das células e a cultura foi lavada com solução salina tamponada com fosfato duas vezes. A lavagem de PBS foi substituída por nanopartículas sonicadas em Ca ²⁺ contendo Hanks ou Ca ^{2 +} - Hanks grátis.

Ensaio de viabilidade celular

A determinação fotocolorimétrica de citotoxicidade foi avaliada usando o corante CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tóquio, Japão) [27, 25]. CCK-8, sendo não radioativo, oferece uma determinação colorimétrica da porcentagem de células viáveis sujeitas a concentrações variadas de NP. Este kit de ensaio mede a atividade metabólica das desidrogenases dentro das células viáveis para converter o sal de tetrazólio WST-8 em formazan solúvel em água. Foi preparado pela adição de CCK-8 em HBSS em uma diluição de 1:10. As células foram enxaguadas com HBSS e 100 μL do corante foram carregados em cada poço. Em seguida, as células foram incubadas a 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora por 6 h. A absorbância foi medida usando um leitor de placa Thermo Multiscan EX (leitor de placa Thermo Multiskan EX, VWR, CA, EUA) na densidade óptica de 450 nm (referência de 650 nm). Uma média foi calculada a partir de três conjuntos de dados separados para cada concentração, incluindo o controle não tratado, de três experimentos independentes e foi tabulada como uma porcentagem do controle não tratado.

A viabilidade celular foi calculada por \ (\ frac {OD_ {450 \ mathrm {tratamento}} - {OD} _ {650 \ mathrm {tratamento}}} {O {D} _ {450 \ mathrm {controle}} - O {D} _ {650 \ mathrm {controle}}} \ ast 100 \% \).

Nanopartícula de lantânio estrôncio manganita

Lantânio estrôncio manganita (La _0,15 Sr _0,85 MnO ₃ ) (LSM) nanopartículas (35 nm, 99,5%) (Nanostructured &Amorphous Materials Inc.) foi usado neste estudo. Todas as amostras NP foram sonicadas antes do uso. As concentrações utilizadas foram 500 μg / ml, 250 μg / ml, 100 μg / ml e 50 μg / ml. A faixa de concentrações usadas foi decidida de acordo com as concentrações de TiO ₂ NPs encontrados em relatórios anteriores (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). Os NPs LSM foram reconstituídos com solução de Hanks (Invitrogen, CA, EUA) antes de serem testados individualmente e sonicados por aproximadamente 5 minutos imediatamente antes do uso.

Microscópio Eletrônico de Varredura

LSM NPs foram preparados em 5 μg / ml e drop cast em wafer de silício limpo e secos ao ar para remover água residual. O tamanho dos NPs foi confirmado independentemente usando um microscópio eletrônico de varredura (Gemini SEM, Zeiss).

Produção de espécies reativas intracelulares de oxigênio

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi avaliada por microscopia de fluorescência usando a oxidação do corante CM-H2DCFDA (Invitrogen, CA, EUA) [24]. As células (1 × 105 células / poço) foram cultivadas por 24 h antes de serem enxaguadas com solução de PBS. As amostras foram coradas aplicando um tampão de carregamento contendo 2 μM de corante CM-H2DCFDA reconstituído em meio por 30 min. As amostras coradas foram lavadas com PBS três vezes e reservadas por 5 min de tempo de recuperação para esterases celulares para hidrolisar os grupos AM ou acetato e tornar o corante responsivo à oxidação. O tampão de Hanks, contendo LSM NPs em concentrações variando de 0 a 500 μg / ml em 50 μg / ml, foi então incubado com as células por 15 min em 37 ° C seguido por lavagem com PBS. Imagens fluorescentes de ROS geradas nas células foram capturadas e analisadas calculando a razão de aumento na intensidade fluorescente entre os diferentes tratamentos e grupos de controle.

Medição de danos à mitocôndria

O potencial da transmembrana interna mitocondrial foi avaliado usando iodeto de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbenzimidoazolil-carbocianio policromático (JC-1 Sigma) [25]. O JC-1 é um cátion lipofílico fluorescente que pode ser incorporado à membrana mitocondrial, onde é dependente dos agregados do estado potencial da membrana. A agregação altera as propriedades de fluorescência de JC-1, mudando de fluorescência verde para vermelha. As membranas mitocondriais intactas coradas com JC-1 exibem uma fluorescência mitocondrial vermelha pronunciada que é detectável por microscopia de fluorescência. A quebra do potencial da membrana mitocondrial resulta em uma diminuição subsequente da fluorescência verde e aumento da fluorescência vermelha. Antes da estimulação de NPs, as células foram lavadas com PBS duas vezes e incubadas com o reagente de coloração JC-1 (1:1000) em meio a 37 ° C por 30 min, seguido por lavagem com PBS e tratamento celular. O potencial de membrana mitocondrial foi detectado por microscopia de fluorescência em intervalos de tempo de 10 min.

Medição de [Ca ²⁺ ] _c

Todos os experimentos foram realizados no escuro. As células foram carregadas com um corante Rhod-2 AM (1 μM) ( K _d =570 nM, λ _Ex =552 nm, e λ _Em =581 nm) (Invitrogen, CA, EUA) durante 45 min. As células foram então lavadas com PBS duas vezes antes de serem incubadas com tampão de Hanks e tratadas com a concentração de NPs apropriada. Todos Ca ²⁺ os experimentos de sinalização foram realizados em um estado termorregulado a 37 ° C montado em um microscópio Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tóquio, Japão) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Secreção de mucina e ELLA

As células foram semeadas em 1 × 10 ⁶ células por poço em uma placa de 6 poços e cultivadas por 24 h. As células primárias da traqueia foram então enxaguadas com PBS e estimuladas por 15 min com as concentrações LSM NP correspondentes (500 μg / ml, 250 μg / ml e 100 μg / ml) preparadas em PBS. O sobrenadante contendo mucina secretada foi coletado e brevemente centrifugado a 8000 rpm para remover os NPs residuais. O sobrenadante foi então incubado em uma placa de 96 poços (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, EUA) durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, a placa de 96 poços foi lavada com PBST (PBS + Tween-20 a 0,05%) e então bloqueada com BSA a 1%. A placa de 96 poços foi lavada novamente com PBST e incubada com lectina (aglutinina de germe de trigo, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, EUA), conjugada com peroxidase de rábano (HRP; 5 mg / ml) (Sigma-Aldrich, MO, EUA), a 37 ° C durante 1 h. O substrato, 3,3 ′, 5,5′-tetrametilbenzidina (TMB; Sigma-Aldrich, MO, EUA), foi adicionado a cada poço em temperatura ambiente, seguido por H ₂ SO ₄ (Sigma-Aldrich, MO, EUA) para encerrar a reação. A densidade óptica foi medida em 450 nm (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Preparação para ensaio imunossorvente (ELISA)

As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 ⁶ densidade celular em uma placa de 6 poços e cultivadas por 24 h. As células da traqueia foram então enxaguadas com PBS. As células foram estimuladas por 2 h com as concentrações de NPs LSM apropriadas (0–500 μg / ml) preparadas em PBS. A lise celular foi preparada pelo reagente de lisado de células Peirce RIPA, e o lisado foi coletado e transferido para um tubo de microcentrífuga. As amostras foram centrifugadas a ~ 14.000 × g por 15 min para sedimentar os restos de células e NPs. O sobrenadante foi então incubado em uma placa de 96 poços durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, a placa de 96 poços foi lavada com PBST (PBS + Tween-20 a 0,05%) e então bloqueada com BSA a 1%. A placa de 96 poços foi lavada novamente com PBST e incubada com anti-caspase 3 de coelho, anticorpo de forma ativa (Millipore, anticorpo policlonal) e anti-citocromo C de camundongo (Invitrogen, anticorpo monoclonal) em temperatura ambiente por 2 h. Em seguida, use o anticorpo secundário (anti-coelho e anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano, HRP, Millipore) e seguido pelo mesmo procedimento que o ELLA para medir a intensidade de absorbância [25].

Análise de imagem

A análise da imagem foi realizada com um microscópio fluorescente Nikon Eclipse TE2000-U invertido. Cada foto foi tirada com aumento de 10 × e analisada usando Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, EUA). Os dados mostrados para as concentrações de cálcio citosólico são representados por fluorescência de Rhod-2. As imagens foram tiradas a cada 0,5 se convertidas automaticamente em tons de cinza para análise. PCI simples forneceu as intensidades de pixel (valor médio de cinza) de áreas selecionadas, cada uma com uma fluorescência média por quadro para 200 células em 100 s (~ 200 quadros) imediatamente após a estimulação de nanopartículas. Os dados mostrados para a coloração de imunofluorescência são uma representação da expressão da proteína após 1–2 h de tratamentos com grafeno. Todos os experimentos foram conduzidos e corroborados de forma independente pelo menos três vezes.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± DP. Cada experiência foi realizada de forma independente pelo menos três vezes. A significância estatística foi determinada usando análise de teste ANOVA de uma via com p valores <0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA).