Secreção de células parietais gástricas e de células caliciformes intestinais:uma nova via metabólica de nanopartículas de metal in vivo mediada por células aprimorada com diarreia por meio de ervas chinesas

Resumo

Até o momento, a forma como as nanopartículas metálicas são depuradas in vivo ainda não foi bem elucidada. Aqui, relatamos uma nova via de eliminação in vivo mediada por células caliciformes intestinais para remover nanopartículas de metal. Nanopartículas de metal típicas, como nanoplacas triangulares de prata, nanopartículas magnéticas, nanobastões de ouro e nanopartículas de ouro foram selecionadas como exemplos representativos. Essas nanopartículas de metal foram preparadas, caracterizadas e injetadas pela veia da cauda em um modelo de camundongo com ligação do ducto biliar comum (CBD). As fezes e urinas foram coletadas por 7 dias a serem seguidas do sacrifício dos camundongos e coleta dos tecidos intestinal e gástrico para posterior análise. Os resultados mostraram que todas as quatro nanopartículas de metal selecionadas estavam localizadas dentro das células caliciformes (GCs) de todo o tecido intestinal e foram excretadas no lúmen intestinal através da secreção de GC intestinal. Além disso, nanoplacas triangulares de prata e nanobastões de ouro foram localizados dentro das células parietais gástricas (PCs). É importante ressaltar que as nanopartículas não causaram alterações patológicas óbvias nos tecidos intestinais. Neste estudo, confirmamos que os glóbulos sanguíneos estão envolvidos na via de secreção de GCs. Além disso, descobrimos que a secreção de nanopartículas de GCs e PCs intestinais é acelerada pela diarréia induzida por meio de ervas chinesas. Em conclusão, nanopartículas de metal como nanoplacas triangulares de prata, nanopartículas magnéticas, nanobastões de ouro e nanopartículas de ouro podem ser removidas por GCs e PCs intestinais. Esta nova via de eliminação in vivo de nanopartículas de metal tem um grande potencial para aplicações futuras, como design e desenvolvimento de novos fármacos, marcação com base em nanopartículas e rastreamento in vivo e avaliação de biossegurança de nanopartículas in vivo.

Introdução

Com o rápido desenvolvimento da nanotecnologia e suas aplicações, uma ampla variedade de materiais nanoestruturados projetados são agora usados em produtos farmacêuticos, biomédicos e outras indústrias. Os produtos nanotecnológicos emergentes têm um enorme potencial para crescimento e desenvolvimento econômico futuro, mas os riscos da nanotecnologia para o meio ambiente e para a saúde humana ainda não são totalmente compreendidos. Para investigar o impacto das nanopartículas no corpo humano, suas interações com sistemas biológicos e suas avaliações de risco potencial, a nanotoxicologia tem sido vista como um novo assunto multidisciplinar, atraindo cada vez mais a atenção de governos e cientistas e estabelecendo a biossegurança dos nanomateriais como uma chave problema científico. Até o momento, muitos relatórios estão intimamente associados à interação entre nanopartículas e células humanas. Por exemplo, algumas nanopartículas, como óxidos de grafeno, nanoclusters de ouro e pontos de carbono podem entrar no citoplasma ou núcleo celular, induzindo a parada do ciclo celular ou apoptose celular, formação de granuloma pulmonar e estimulando a secreção celular imunológica de algumas citocinas [1,2, 3].

Com o desenvolvimento de novas técnicas de imagem molecular, nanopartículas de metal, como nanopartículas de ouro, nanopartículas de prata, nanopartículas magnéticas e pontos quânticos têm sido investigadas ativamente como reagentes teranósticos multifuncionais e são usadas para imagem direcionada in vivo, aquecimento magnético induzido, fototérmico ou terapia fotodinâmica, ou como sistemas de liberação de drogas de alta eficiência, entre outras aplicações. Foi observado que essas nanossondas multifuncionais baseadas em nanopartículas de metal estão localizadas em locais de tumor, e parte delas também estão localizadas nos tecidos do fígado e baço e podem se distribuir por todo o rim, pulmão e tecidos cerebrais [4,5,6, 7,8,9,10]. Porque o rim apenas limpa as nanopartículas com menos de 5 nm de diâmetro, a maioria das nanopartículas são muito difíceis de serem removidas desta maneira [11, 12]. Portanto, como limpar nanopartículas de metal in vivo tornou-se um problema científico chave desafiador. No entanto, até os dias de hoje, não existem caminhos alternativos convincentes e mecanismos detalhados para remover nanopartículas de metal do corpo humano. Assim, como limpar nanopartículas metálicas in vivo tornou-se nossa preocupação.

Até o momento, as nanopartículas metálicas são introduzidas no organismo principalmente por três vias, como as vias intravenosa, oral e intraperitoneal, entre as quais a injeção intravenosa é o método mais comum devido à sua rápida distribuição por todo o corpo [4, 13, 14] . Porém, a degradação dos núcleos metálicos desses tipos de nanopartículas pelo organismo é, se possível, extremamente difícil, levando ao problema principal, que são os efeitos do acúmulo de nanopartículas residuais. Deve-se notar que a qualidade das nanopartículas metálicas in vivo é determinada pelo equilíbrio entre a bioatividade induzida pelas nanopartículas e a toxicidade indesejada. Do ponto de vista toxicológico, um efeito tóxico é provocado apenas se quantidades suficientes de nanopartículas estiverem localizadas em um local alvo, e a excreção do organismo é a melhor maneira de cessar os efeitos de uma quantidade excessiva de nanopartículas localizadas nas células e tecidos. Portanto, uma compreensão adequada de suas vias de eliminação é crucial para qualquer aplicação médica e para uma avaliação de risco abrangente.

Existem alguns estudos associados à depuração de nanopartículas de tecidos ou órgãos in vivo, como rim, fígado e pulmão [15,16,17]. No entanto, esses experimentos apenas fornecem informações sobre o mecanismo de depuração para remover partículas de um único órgão em vez de todo o corpo [18]. Quanto à depuração sistêmica in vivo, duas vias principais de excreção de nanopartículas injetadas por via intravenosa foram relatadas, ou seja, a via de fezes do sistema hepato-biliar (HBS) para nanoestruturas maiores que não podem ser biodegradadas pelo organismo como alguns tipos de nanopartículas magnéticas [19, 20], e a via rim-urina para nanopartículas de pequeno porte, como pontos quânticos, fulerenos, nanopartículas de ouro e outros tipos de nanopartículas de ouro com menos de 5 nm de diâmetro [16, 21, 22]. No entanto, essas duas vias mostram taxa de eliminação limitada para nanopartículas metálicas in vivo.

Souris et al. demonstraram que nanopartículas de sílica se acumularam na parede intestinal em alta concentração e que a concentração de nanopartículas de sílica injetadas por via intravenosa de 50-100 nm localizadas no fígado era muito menor do que na parede intestinal e nas fezes [20]. Outro estudo mostrou que nanopartículas tão grandes quanto 500 nm, independentemente das modificações, podem ser eliminadas do corpo do peixe e que a taxa de eliminação de partículas de 500 nm foi mais rápida e mais eficiente do que a de partículas de 50 nm, apesar de as nanopartículas maiores estarem muito além da capacidade de HBS [23]. Esses dados mostram que a via de HBS pode não ser a principal via de excreção de nanopartículas in vivo e que podem existir outras vias de excreção de nanopartículas in vivo.

As células caliciformes intestinais (GCs) são células excretórias altamente polarizadas que estão presentes em todo o trato intestinal. Acredita-se que essas células epiteliais especializadas desempenhem um importante papel protetor no intestino, sintetizando e secretando vários mediadores [24,25,26]. Wang et al. relataram que as células caliciformes (GCs) podem captar nanopartículas [27] e Sun et al. descobriram que nanopartículas injetadas por via intravenosa são distribuídas nos GCs intestinais [28]. No entanto, até o momento, a interação entre as nanopartículas e os GCs intestinais ainda não foi investigada em detalhes. Especificamente, nenhum relatório esclarece totalmente como essas nanopartículas são capazes de entrar nas células de GCs, e se essas nanopartículas se distribuem nos GCs de todo o tecido intestinal. Para esclarecer a via de excreção de nanopartículas metálicas nos tecidos intestinais, é crucial elucidar qual papel os GCs intestinais desempenham nesta nova via de excreção de nanopartículas. Como as nanopartículas de metal podem ser excretadas através de HBS e entrar no intestino, nos concentramos em distinguir entre a excreção mediada por HBS daquela mediada por GCs intestinais (Esquema 1).

Neste estudo, selecionamos quatro tipos de nanopartículas de metal comuns, como nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triângulo de prata, nanoclusters de ouro e nanobastículas de ouro como alvos de pesquisa. Graças às propriedades ópticas características dos nanobastões de ouro, eles serviram como uma ferramenta para observar a distribuição intestinal das nanopartículas por excitação de dois fótons, enquanto os outros três tipos de partículas serviram como exemplos representativos de vários outros nanomateriais metálicos. Modelos de camundongos foram preparados com ligadura do ducto biliar comum para evitar a conexão entre HBS e o trato intestinal. As nanopartículas de metal foram injetadas em camundongos pela veia da cauda, em seguida, camundongos nus foram criados e as fezes foram coletadas por 7 dias, e os animais foram finalmente sacrificados, e os tecidos do trato intestinal e gástrico foram coletados, preparados em fatias e finalmente analisados usando eletroscópio de transmissão de alta resolução e ICP-MS para investigar a distribuição de nanopartículas de metal nos tecidos intestinais. Além disso, a presença de nanopartículas metálicas foi medida nas fezes dos camundongos com ligação de CBD. Além disso, neste estudo, a fim de descobrir ainda mais o mecanismo de secreção de nanopartículas de GCs e PCs, usamos um modelo de diarréia de camundongos recentemente desenvolvido induzida por meio de ervas chinesas.

Materiais e métodos

Síntese e caracterização de nanoplacas de prata triangulares

As nanoplacas triangulares de prata foram sintetizadas por meio de procedimentos previamente descritos por Mirkin [29] e colegas com algumas modificações [30]. Em um experimento típico em temperatura ambiente com ar, AgNO ₃ (0,1 mM, 100 mL), citrato trissódico (30 mM, 6 mL), PVP (peso molecular de 30 kDa, 0,7 mM, 6 mL) e 240 μL de H ₂ O ₂ (30% em peso) foram adicionados ordenadamente a um frasco de 250 mL. Após agitar vigorosamente as soluções combinadas no frasco, 0,8 mL de uma solução recém-preparada de NaBH 0,1 M ₄ foi injetado rapidamente. Em alguns segundos, a cor da solução ficou amarela, indicando a geração de nanoesferas de prata. Nas horas seguintes, o frasco foi colocado sob luz solar ou lâmpada fluorescente até a coloração azulada da solução, sem maiores alterações de cor (no máximo 5 h). E a solução final foi armazenada em refrigerador a 4 ° C para uso posterior.

O espectro de absorbância da solução preparada foi medido por espectrômetro UV-vis-NIR (UV-3600, Shimadzu, Japão) usando uma cubeta de trajeto óptico de 1 cm. Os espectros foram coletados em uma faixa de 200 a 950 nm com uma fenda de 2 nm. A análise por microscopia eletrônica de transmissão foi operada em JEM-200CX (JEOL, Japão) mergulhando a grade TEM de cobre revestida de carbono nas nanopartículas de coleta em 1 mL de água desionizada após centrifugação de um total de 10 mL da solução em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a 6000 rpm durante 30 min a 25 ° C. Um número total de 200 nanoplacas de prata triangulares foi selecionado a partir das imagens TEM para computar estatisticamente a distribuição de seus tamanhos de borda.

Magnetita superparamagnética (Fe ₃ O ₄ ) nanopartículas, nanoclusters de ouro e nanobastões de ouro foram sintetizados e caracterizados de acordo com nossos relatórios anteriores [31,32,33] e armazenados em temperatura ambiente.

Preparação de modelos animais com ligadura do ducto colédoco

Ratos Wistar fêmeas saudáveis (180–220 g) e ratos fêmeas rudes (20–22 g) foram obtidos no Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as leis relevantes e diretrizes institucionais. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da Shanghai Jiao Tong University (NO.SYXK2007-0025). O ducto biliar comum foi ligado seguindo um método originalmente descrito por Lee com algumas modificações [34]. Resumidamente, esses camundongos foram anestesiados com pentobarbital (25 mg / kg) e fixados em uma folha cirúrgica de madeira. Uma incisão abdominal média foi feita e os tecidos abdominais foram separados cuidadosamente para expor claramente o CBD. Duas suturas cirúrgicas médicas de náilon esterilizadas (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, China), 0,2 mm de diâmetro, foram colocadas sob o CBD, e três nós foram feitos em ambas as extremidades de um segmento do CBD (Fig. 1b, c). Finalmente, o CBD foi cortado entre as duas extremidades, seguido pelo fechamento final do abdômen. No 14º dia após a ligação do ducto biliar comum, amostras de sangue foram coletadas de cada camundongo para testar a função hepática principal.

Injeção de nanopartículas nos camundongos

Depois de terminar a ligação de CBD, 12 camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos:grupo controle 1, grupo de teste de nanoplacas de prata, grupo de teste de nanopartículas magnéticas e grupo de teste de nanopartículas de ouro. Um grupo de controle adicional foi composto por cinco camundongos sem ligação de CBD. Os camundongos nos grupos de controle foram tratados com uma injeção intravenosa de solução aquosa de NaCl a 0,9%, enquanto os grupos de teste foram injetados com uma suspensão de nanopartículas, como nanoplacas triangulares de prata, nanopartículas magnéticas, nanobastões de ouro e nanoclusters de ouro em uma dose de 150 μL ( 550 μg / mL). Todas as quatro suspensões de nanopartículas foram recentemente dispersas por sonicação por 1 min antes do uso. Os camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano a 5% até o relaxamento do tônus muscular e, em seguida, quatro tipos de suspensões de nanopartículas foram injetadas por via intravenosa com seringa de 1 mL, respectivamente.

Distribuição de nanopartículas nos tecidos

No sétimo dia após a injeção da suspensão de nanopartículas metálicas, os camundongos foram anestesiados e seus tecidos intestinais retirados, fixados em formol a 10% por 24 he, a seguir, embebidos em parafina. Um micrótomo giratório Leica RM2135 foi usado para preparar seções de 5 μm de espessura das amostras fixadas. Por fim, os cortes foram desidratados com álcool e corados em hematoxilina e eosina. Os cortes das amostras foram observados em microscópio de contraste de fase (Olympus, RX-71, Japão).

No sétimo dia após a injeção da suspensão de nanopartículas metálicas, os tecidos intestinais e gástricos foram coletados imediatamente após a escarificação dos camundongos e fixados em solução de glutaraldeído 2,5%. As amostras fixadas foram desidrogenadas serialmente em etanol e embebidas em resina epóxi. Em seguida, uma amostra intestinal ultrafina foi confeccionada e observada com TEM de alta resolução (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, EUA).

No mesmo dia, seus tecidos intestinais foram coletados imediatamente após o sacrifício e foram fotografados usando um sistema de imagem in vivo (sistema de imagem IVIS-100, Caliper) acoplado a uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e uma proteína fluorescente vermelha (DsRed) filtro (Caliper Life Sciences). Imagens e medições de sinais fluorescentes foram adquiridas e analisadas pelo software Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences).

Conteúdo de metal das fezes

Além disso, todas as fezes de camundongos foram coletadas 7 dias após a injeção, e as fezes foram pesadas e digeridas com água régia sob aquecimento. Finalmente, o conteúdo mental de metal na solução foi determinado por um ICP-MS (Agilent 7500a, EUA).

Preparação de extratos de ervas chinesas

Folha de senna 10 g, ruibarbo 2 g e extrato de fructus cannabis 1 g foram adicionados a 100 mL de água, aquecidos a 100 ° C por 10 min e, em seguida, filtrados por duas camadas de gaze [35]. Finalmente, os filtrados foram recolhidos e concentrados a 0,3 g / mL sob pressão reduzida. Os extratos de folha de senna foram preparados conforme abaixo e armazenados a 4 ° C antes da realização dos testes.

Análise de células caliciformes

Primeiramente, seis camundongos Kunming machos foram separados aleatoriamente em dois grupos:o grupo de controle e o grupo de diarréia; ambos foram tratados com solução salina e extratos de ervas chinesas diariamente por 7 dias via gavagem oral (0,1 mL), respectivamente. No sétimo dia após a administração de gavagem, os camundongos foram sacrificados, os tecidos intestinais foram coletados e os tecidos intestinal e gástrico foram congelados em Tissue Tek OCT e seccionados em um criostato Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, EUA). As seções de 8 μm foram coradas em Alcian Blue (1% Alcain Blue 8GX em 3% de ácido acético glacial) por 5 min, e finalmente enxaguadas em água destilada. Esta amostra foi oxidada em ácido periódico a 1% antes da lavagem e, em seguida, tratada por 15 min no reagente de Schiff. As imagens das seções de tecido foram registradas usando um microscópio invertido. Os tecidos gástricos foram coletados em lâminas carregadas positivamente para imagens de luminescência de dois fótons.

Conteúdo de ouro nos tecidos intestinais e fezes

Resumidamente, 9 camundongos Kunming machos foram divididos em cada um dos três grupos de acordo com os diferentes tratamentos:grupo controle, grupos de ligação e grupos de ligação + diarréia. Em seguida, esses camundongos foram injetados por via intravenosa com 100 μL de GNRs (1 mg / mL). No segundo dia após a injeção na veia da cauda, os grupos controle e ligadura foram tratados com solução salina, ao mesmo tempo que os grupos ligadura + diarréia foram tratados com extratos de ervas chinesas. A dose do tratamento foi mantida constante e administrada diariamente durante os 7 dias seguintes por gavagem oral (0,1 mL). No sétimo dia, os camundongos foram sacrificados e os tecidos intestinais congelados em Tissue Tek OCT e seccionados em criostato Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, EUA). Seções (8 μm) foram coletadas em lâminas carregadas positivamente para imagens de luminescência de dois fótons. Todas as fezes de camundongos foram coletadas após a injeção. As fezes foram pesadas e digeridas com água régia sob aquecimento. Finalmente, o conteúdo mental de ouro na solução foi determinado por um ICP-MS (Agilent 7500a, EUA).

Análise estatística

Cada experiência foi repetida três vezes em duplicado. Os resultados foram apresentados como média ± DP. As diferenças estatísticas foram avaliadas usando o t teste e considerado em P <0,05.

Resultados e discussão

Síntese e caracterização das nanopartículas

Nanoplacas triangulares de prata foram sintetizadas pelo método de síntese térmica rápida, exibindo boa solubilidade em água. Mais importante ainda, a forma triangular particular dessas nanopartículas torna mais fácil ser identificada por microscopia eletrônica. Como mostrado na Fig. 1, no espectro de UV-vis, as nanopartículas de prata preparadas mostraram um pico forte em 648,5 nm correspondendo à banda de plasmon de superfície dipolo no plano e dois picos modestos em comprimentos de onda mais baixos, correspondendo ao no plano (482 nm) e ressonâncias quadrupolo fora do plano (333 nm), indicando a formação da arquitetura do triângulo [36], que é posteriormente verificada pela imagem TEM das nanopartículas de prata coletadas após a centrifugação. A imagem TEM (Fig. 1b) revelou que os lotes preparados continham uma subpopulação de nanoesferas de prata, possivelmente contribuindo para o pico de SPR em 389 nm [36]. O comprimento da borda das nanoplacas de prata triangulares reunidas foi de 44,3 nm com boa distribuição monodispersa.

Nanopartículas magnéticas com 20 nm de diâmetro e nanoclusters de Au com 5 nm de diâmetro foram preparadas, e sua caracterização é mostrada no arquivo adicional 1:Figura S1 e S2, respectivamente. As imagens TEM e os espectros de UV / vis de nanobastões de Au são mostrados no arquivo adicional 1:Figura S3.

Preparação dos modelos de camundongos de ligação do CBD

A ligadura do ducto biliar comum (CBD) é um modelo experimental bem conhecido usado para induzir a fibrose colestática do fígado [37, 38]. Aqui, realizamos experimentos em camundongos com ligadura de CBD a fim de bloquear totalmente a conexão entre a HBS e o trato intestinal (Fig. 2a, b), garantindo que as nanoplacas metálicas fossem transportadas apenas pela corrente sanguínea para os tecidos intestinais após a injeção intravenosa. Em comparação com os controles normais, os grupos tratados mostraram um forte aumento no diâmetro e na espessura da parede do ducto biliar comum 14 dias após a ligadura de CBD devido à estase biliar (Fig. 2d). Além disso, como mostrado na Fig. 2e, os níveis de TBIL e AST no grupo de ligação foram significativamente maiores do que no grupo de contraste. Esses resultados sugeriram que, após construir com sucesso o modelo de camundongos de ligadura de CBD, o ducto biliar comum foi absolutamente bloqueado e que a conexão entre a HBS e o trato intestinal foi completamente cortada, induzindo colestase e fibrose colestática hepática [39].

O efeito de quatro tipos de nanopartículas nos tecidos intestinais

Normalmente, o epitélio intestinal fornece uma barreira semipermeável que permite que pequenas quantidades de moléculas de diferentes tamanhos e características cruzem o epitélio intacto por mecanismos ativos e passivos. Geralmente, quanto maior a molécula, menor é a probabilidade de ela cruzar essa barreira. No entanto, uma vez que o revestimento do intestino fica inflamado ou danificado, torna-se mais difícil para o epitélio intestinal manter as partículas estranhas e grandes do lado de fora à medida que os espaços entre as células se abrem [40, 41]. Considerando que as nanopartículas podem ser a causa das alterações patológicas dos tecidos intestinais e o consequente aumento da permeabilidade da parede intestinal, que leva as nanopartículas a passarem pela parede intestinal, foi realizado um exame histopatológico dos tecidos intestinais após serem expostos ao quatro tipos diferentes de nanopartículas:nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triângulo de prata, nanobastões de ouro e nanoclusters de ouro. Conforme mostrado na Fig. 3, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de controle e os grupos de teste, nem houve outras alterações histológicas, como infiltrado inflamatório [42]. Os resultados demonstram que essas nanopartículas metálicas não causaram alteração patológica nos tecidos intestinais, eliminando assim a possibilidade de que as nanopartículas vazem dos espaços entre as células.

Distribuição de nanopartículas de metal em GCs intestinais

Os GCs são um tipo dos quatro principais tipos de células presentes em todo o trato intestinal e são responsáveis pela produção e preservação de uma manta protetora de muco, sintetizando e secretando glicoproteínas de alto peso molecular conhecidas como mucinas, que promovem a eliminação do conteúdo intestinal e fornecem a primeira linha de defesa contra danos físicos e químicos causados por alimentos ingeridos, micróbios e o produto microbiano [43, 44]. Os GCs foram facilmente identificados graças ao seu alto volume de conteúdo de muco. Conforme mostrado na Fig. 6, as nanoplacas triangulares de prata estavam localizadas dentro dos GCs intestinais ao longo do trato intestinal, e as diferentes fases de sua secreção dos GCs puderam ser obtidas. A Figura 4d mostra como algumas nanoplacas de prata triangulares foram secretadas para fora e para o intestino por um GC. A Figura 4e mostra que algumas nanoplacas de prata triangulares encapsuladas no conteúdo de muco dos GCs intestinais estavam prontas para serem secretadas. Na Fig. 4f, é mostrado como algumas nanoplacas triangulares de prata foram expulsas de um GC, enquanto outras ainda estavam nele. A partir das imagens TEM, descobrimos que algumas nanoplacas de prata triangulares foram mostradas em um modo de agregação (Fig. 4 (a2, d e e), setas verdes), enquanto outras estavam em um modo de dispersão (Fig. 4 (a1, b1, b2, c1, c2 e f), setas brancas). A agregação é um fenômeno comum de nanopartículas e geralmente é observada quando sua concentração está muito aumentada nas células [45]. Ao contrário, uma diminuição na concentração de nanopartículas impede sua agregação.

Resultados semelhantes foram observados para nanoclusters de ouro, nanopartículas magnéticas e nanobastões de ouro, conforme mostrado no arquivo adicional 1:Figura S4, S5 e S6. Esses resultados mostraram claramente que esses três tipos de nanopartículas de metal estão localizados dentro de GCs do trato intestinal, indiretamente apoiando que essas nanopartículas de metal podem ser removidas pela via de GCs.

Embora os GCs sejam distribuídos ao longo de toda a linha do trato intestinal, sua contribuição para o volume epitelial total não é idêntica. No intestino delgado de camundongos, a densidade de volume dos GCs aumenta progressivamente do duodeno ao íleo. Essa tendência continua no trato intestinal grosso, com a densidade de GCs no epitélio colônico também aumentando de proximal para distal, do cólon para o reto [43]. Com base no fato de que nanoplacas triangulares de prata, nanopartículas magnéticas e nanoclusters de ouro existiam nos GCs intestinais em todo o trato intestinal, e que a contribuição dos GCs para o volume epitelial total é totalmente diferente, acreditamos que o intestino grosso pode ser o principal local de excreção para a via de excreção intestinal de GCs.

Devido à sua forma característica, as nanoplacas de prata triangulares foram facilmente distinguidas por imagens TEM nos locais descritos na via sugerida para alcançar os GCs. No entanto, embora nanopartículas magnéticas e nanoclusters de ouro não pudessem ser distinguidos de outras estruturas usando esta técnica, Arquivo adicional 1:A Figura S4 revela que o trato intestinal do grupo de ligação CBD ainda tem uma certa quantidade de nanoclusters de ouro que nos leva ao conclusão de que o mecanismo de excreção de GC acima mencionado também se aplica a outros tipos de nanopartículas metálicas.

Além disso, como arquivo adicional 1:Figura S7 mostrado, os resultados de ICP-MS exibem claramente que essas nanopartículas ainda podem ser segregadas do corpo de camundongos de ligação. Esses resultados comprovaram que as células caliciformes dos tecidos intestinais estão envolvidas em uma importante via de excreção de nanopartículas.

Mecanismo potencial de transporte de nanopartículas de metal no vaso sanguíneo intestinal

Os resultados mencionados acima demonstram que esses quatro tipos de nanopartículas de metal (nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triângulo de prata, nanobastões de ouro e nanoclusters de ouro) foram distribuídos nos GCs por todo o trato intestinal, mas a forma como as nanopartículas entram nos GCs ainda não era elucidado. Como os modelos de camundongos com ligação de CBD foram tratados com uma suspensão de nanopartículas de metal por meio de injeção na veia da cauda, essas nanopartículas só puderam ser transportadas pelo fluxo sanguíneo para os vasos intestinais. Conforme revelado por imagens TEM, algumas nanoplacas de prata triangulares foram de fato localizadas no corpúsculo sanguíneo (Fig. 5a, setas brancas). Além disso, estudos anteriores revelaram que nanopartículas com um tamanho pequeno podem ser entregues pelo corpúsculo de sangue em todo o sistema circulatório [46]. Pode-se observar na Fig. 5b que algumas nanoplacas triangulares de prata passam pela membrana dos vasos sanguíneos (setas verdes), enquanto algumas nanoplacas triangulares de prata estão localizadas no corpúsculo sanguíneo (setas vermelhas). Portanto, como a Fig. 8 revela, inferimos que nanoplacas triangulares de prata foram transportadas pelos corpúsculos sanguíneos e, em seguida, liberadas no plasma, passando pela membrana da parede vascular dos vasos intestinais e finalmente chegando aos GCs.

Ensaio de análise de células caliciformes

As células caliciformes desempenham um papel fundamental na via de excreção das nanopartículas. Neste estudo, descobrimos que nanopartículas de metal podem ser secretadas a partir dessas células caliciformes. Seguindo essa afirmação, se o processo de secreção das células caliciformes for acelerado, teoricamente seria possível que a excreção de nanopartículas também aumentasse. Para resolver isso, estabelecemos um modelo de diarreia induzida por uma erva chinesa usada na medicina tradicional. A fim de explorar como os processos diarreicos influenciam a secreção de GCs, foi realizada uma análise histológica dos GCs intestinais. Deve-se reconhecer que um maior número de células caliciformes do tecido intestinal aumenta a produção de mucina [47]. Conforme mostrado na Fig. 6, nos grupos de diarreia, o número total de células caliciformes no intestino delgado e no intestino grosso foi significativamente maior em comparação com os controles. Além disso, a porcentagem e o número de células caliciformes cavitadas nos tecidos intestinais foram significativamente maiores nos grupos com diarréia em comparação com os controles. Essas observações nos permitem afirmar que a quantidade de células do tecido intestinal aumenta em resposta à diarréia, sugerindo um aumento da excreção pelos GCs. Esses resultados são consistentes com os dados relatados anteriormente [47].

Conteúdo de ouro nos tecidos intestinais e nas fezes

Foi relatado que a seção transversal de ação de dois fótons (TPACS) de um nanorod pode chegar a 2320 GM, que é muito maior do que a de fluoróforos orgânicos e dentro da faixa de pontos quânticos, fornecendo uma abordagem promissora para detectar o distribuição dos nanobastões de ouro em tecidos biológicos usando excitação de dois fótons [48, 49]. Nesta parte do estudo, a fim de observar a distribuição intestinal das nanopartículas nos grupos ligadura e nos grupos ligadura + diarreia, foi medida a luminescência de dois fótons do núcleo dos AuNRs. Como mostrado na Fig. 7, os conteúdos de ouro do intestino delgado e grosso foram significativamente maiores para os grupos de ligadura em comparação com aqueles observados nos grupos de ligadura + diarreia. O conteúdo elementar de ouro nos tecidos intestinais foi quantificado por ICP-MS 7 dias após a injeção na veia da cauda. O conteúdo de ouro dos tecidos intestinais foi significativamente maior nos grupos de ligadura em comparação com os grupos de ligadura + diarreia ( P <0,001) ao longo do estudo (Fig. 7). Esses resultados indicam que o nível de nanopartículas excretadas pelas células caliciformes dos grupos com diarreia é superior ao de qualquer um dos outros grupos.

No próximo experimento, analisamos o conteúdo de ouro nas fezes de camundongos. Como mostrado na Fig. 8a, o conteúdo de ouro nas fezes foi significativamente maior no grupo de controle em comparação com os grupos de ligadura ou os grupos de ligadura + diarréia ( P <0,001). Além disso, nos grupos ligadura + diarreia, os teores de ouro foram significativamente maiores do que nos grupos ligadura (Fig. 8a). Esses resultados sugerem que a diarreia acelera o processo de secreção das nanopartículas pelas células caliciformes intestinais. Combinado com a análise quantitativa de elementos de ouro nas fezes, comprovamos ainda que as células caliciformes dos tecidos intestinais estão envolvidas em uma via importante para a excreção de nanopartículas.

Efeitos das células parietais na secreção gástrica de nanopartículas de metal

As células parietais são distribuídas principalmente na parte inferior do estômago e no corpo gástrico, que secretam ácido clorídrico e fator interno. Além disso, descobrimos que os nanoclusters de ouro distribuídos nos tecidos gástricos de camundongos com ligação CBD (arquivo adicional 1:Figura S4B). Portanto, hipotetizamos que as células parietais podem estar envolvidas na excreção de nanopartículas. Como esperado, a partir de imagens de luminescência de dois fótons, verificou-se que os nanobastões de ouro são distribuídos nos tecidos gástricos (Fig. 9a, b). Além disso, como mostra a Fig. 9c, d, observamos que nanoplacas triangulares de prata são distribuídas nas células parietais do tecido gástrico. Combinado com os resultados da pesquisa anterior, especulamos que as células parietais estão envolvidas na secreção de nanopartículas.

Conclusões

Em resumo, nós preparamos e aplicamos com sucesso nanoplacas de prata triangulares, nanopartículas magnéticas, nanobastões de ouro e nanoclusters de ouro como agentes de rastreamento. Camundongos com ligação de CBD foram tratados com as nanopartículas previamente preparadas via injeção na veia da cauda para estudar a distribuição do tecido gástrico-intestinal e a excreção dessas nanopartículas. Também analisamos as vias de excreção de nanoclusters de ouro e nanopartículas magnéticas. Deve-se afirmar que os nanopartículas de ouro são removidos principalmente pela via urinária renal, enquanto as nanopartículas magnéticas são removidas principalmente do organismo pela via HBS. Como as capacidades excretórias de rim e HBS para aplicações in vivo de nanopartículas metálicas são muito limitadas, a via de excreção de GCs e PCs pode fornecer outra alternativa importante para a excreção dessas nanopartículas. Em relação a essa questão, também descobrimos que o processo de nanopartículas secretadas de GCs e PCs é acelerado pela diarreia, comprovando ainda que os GCs e PCs representam uma via importante para a excreção de nanopartículas metálicas. Admitidamente, nosso conhecimento ainda é limitado no que diz respeito à depuração in vivo de nanopartículas como, por exemplo, o mecanismo concreto subjacente às vias de secreção de GCs e PCs e a eficiência de depuração de nanopartículas em GCs intestinais, portanto, mais investigações são necessárias com urgência. Resumindo, esta nova via de depuração in vivo de nanopartículas metálicas tem grande potencial em aplicações de curto prazo, como design e desenvolvimento de novos fármacos, marcação com base em nanopartículas e rastreamento in vivo e avaliação de biossegurança de nanopartículas in vivo.

Abreviações

CBD:: Ducto biliar comum
CCD:: Dispositivo de carga acoplada
GCs:: Células caliciformes
GNRs:: Nanobastões de ouro
HBS:: Hepatobiliar
PCs:: Células parietais
System Fe ₃ O ₄ :: Magnetita superparamagnética
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
TPACS:: Seção transversal de ação de dois fótons

Investigação de ZrO2 impresso a jato de tinta direto versus revestido por rotação para transistor de filme fino IGZO sputter Preparação fácil de nanocompósitos de nanotubo de carbono-Cu2O como novos materiais catalisadores para redução de P-nitrofenol

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias