Nanopartículas AuNC@PEG Altamente Biocompatíveis: Um Novo Agente de Contraste para TC com Imageamento In Vivo Aprimorado

Resumo

Nos últimos anos, agentes de contraste têm sido amplamente utilizados em tecnologia de imagem para melhorar a qualidade. Nanopartículas apresentam melhor capacidade de detecção in vivo do que agentes de contraste convencionais em escala molecular. Neste estudo, um novo tipo de nanopartículas de nanogaias de ouro@PEG (AuNC@PEG) com forte coeficiente de absorção de raios X foi sintetizado como agente de contraste para imagem por tomografia computadorizada (TC). Os resultados mostraram que as AuNC@PEG apresentaram boa dispersão aquosa, baixa citotoxicidade e forte capacidade de absorção de raios X. Além disso, estudos in vivo demonstraram que as AuNC@PEG sintetizadas possuem realce de contraste evidente, longo tempo de circulação sanguínea e toxicidade insignificante in vivo. Portanto, as AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas neste estudo têm grande potencial para aplicação clínica em imagem por TC.

Introdução

Nos últimos anos, a tomografia computadorizada (TC) tem sido a técnica de imagem diagnóstica mais comumente utilizada em ambientes clínicos, com ampla aplicação no estudo de vários tecidos humanos. Devido à forte capacidade de penetração, alto contraste e processamento de imagem relativamente simples, a TC é considerada a mais poderosa técnica diagnóstica de imagem não invasiva no sistema médico moderno [1, 2]. No entanto, durante a imagem, não há contraste natural entre a lesão e algumas estruturas circundantes. Assim, um agente de contraste — substância com densidade relativamente maior ou menor — deve ser usado para distinguir a estrutura-alvo, tecidos e órgãos. Além disso, essa substância possui capacidades de absorção variáveis em diferentes tecidos e pode ser observada via irradiação de raios X em tecidos moles. O uso de algumas moléculas e diversos agentes de contraste microparticulados em imagem por TC foi avaliado [3,4,5].

Atualmente, o agente de contraste mais comum para TC é uma molécula orgânica contendo iodo. Moléculas iodadas, como íon iodeto ou preparações não iônicas, são amplamente utilizadas como agentes de contraste para TC em ambientes clínicos. Embora as moléculas iodadas possam fornecer bom realce de contraste em TC, elas apresentam rápida taxa de clearance renal, curto tempo de circulação no corpo e propriedades alergênicas, o que limita significativamente aplicações futuras [6, 7]. Devido à rápida remoção do revelador de iodo, a janela de tempo efetiva de imagem do pool sanguíneo é seriamente limitada, dificultando a obtenção de imagens de alto contraste. Além disso, a rápida eliminação de uma grande dose de fármacos pode ter potenciais efeitos colaterais nos rins [8, 9].

Na última década, a aplicação de nanopartículas em biomedicina, particularmente em imagem diagnóstica, recebeu considerável atenção [10]. Comparadas com agentes de contraste baseados em iodo, as nanopartículas possuem cargas de características de contraste que moléculas pequenas não possuem, além de tamanho, forma e superfície específicos [11, 12]. Geralmente, nanopartículas com alto número atômico, como ouro, prata e outras nanopartículas metálicas, apresentam excelente coeficiente de absorção de raios X; assim, têm notável capacidade de realce de contraste [13, 14]. Entre estas, as nanopartículas de ouro têm sido rapidamente desenvolvidas no campo biomédico e consideradas substitutas para agentes de imagem baseados em iodo devido à sua significativa inércia biológica e facilidade de síntese e modificação de superfície [15,16,17]. Nanopartículas de ouro têm maior tempo de circulação sanguínea, menor risco de nefrotoxicidade e maior coeficiente de absorção de raios X do que compostos de iodo. Portanto, uma dosagem reduzida pode ser fornecida, e o risco de efeitos colaterais é baixo [18]. Diversas nanopartículas de ouro, incluindo nanoesferas, nanobastões e nanoestrelas, têm sido amplamente utilizadas como agentes de contraste para imagem por TC [19, 20], com efeitos promissores. Entre as várias nanoestruturas de ouro, as nanogaias de ouro possuem interior oco e parede fina porosa; assim, têm maior área de superfície e melhor capacidade de imagem por TC do que outras nanopartículas de ouro com diferentes morfologias [21, 22]. Nos últimos anos, nanogaias de ouro têm sido usadas como realçadores de contraste para tomografia de coerência óptica e tomografia fotoacústica, com bom desempenho. Enquanto isso, devido à grande área de absorção das nanogaias de ouro, elas também são transdutores fototérmicos eficazes [23, 24]. Para o melhor de nosso conhecimento, poucos estudos avaliaram o uso de nanogaias de ouro como agentes de contraste para TC. Baseados nos estudos acima, exploramos ainda o uso de nanogaias de ouro como agente de contraste para TC. A aplicação de nanopartículas em imagem por TC requer superfícies com biocompatibilidade e atividades biológicas. Polietileno glicol (PEG) é um polímero biodegradável e biocompatível, também usado como material "stealth" para prevenir captura pelo RES e melhorar biocompatibilidade, capacidade de depuração renal e tempo de circulação sanguínea; assim, nanopartículas PEGiladas podem ser retidas no sangue por longo período [15, 25,26,27,28].

Neste estudo, novas AuNC@PEG foram preparadas e caracterizadas. Em seguida, a biocompatibilidade in vitro das AuNC@PEG foi avaliada por colorimetria MTT, método de vazamento de lactato desidrogenase (LDH), ensaio de concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares, coloração Calcein-AM/PI e outras técnicas experimentais. Além disso, análises hematológicas e histológicas foram realizadas para determinar a toxicidade das AuNC@PEG in vivo. Os resultados mostraram que as AuNC@PEG tiveram excelente biocompatibilidade in vitro e in vivo. Além disso, as AuNC@PEG apresentaram maior capacidade de imagem por TC in vitro e in vivo. Estes resultados experimentais demonstraram que as AuNC@PEG sintetizadas possuem vantagens óbvias, como forte contraste, longo tempo de circulação sanguínea e baixo risco de nefrotoxicidade. Portanto, as AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas neste estudo têm grande potencial para aplicação clínica em imagem por TC.

Métodos

Todos os protocolos experimentais, incluindo quaisquer detalhes relevantes, foram aprovados pelo Comitê Regional de Ética da Universidade Médica de Jinzhou na Província de Liaoning, China.

Materiais e Instrumentos

Os kits de teste de LDH e ROS foram adquiridos do Instituto de Bioengenharia de Nanjing, China, e os kits de coloração Calcein-AM/PI da Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., China. Outros agentes químicos e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Todas as secções foram avaliadas usando microscópio de fluorescência (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Alemanha). As características das nanopartículas sintetizadas foram avaliadas com microscópio eletrônico de transmissão (MET). Um TC espiral de 256 fileiras e 512 fatias (Philips, Alemanha) foi utilizado, com os seguintes parâmetros de imagem: espessura de fatia, 0,625 mm; voltagem do tubo, 100 kVp; e corrente do tubo, 100 mA.

Síntese das AuNC@PEG

As nanogaias de Au foram preparadas usando uma simples reação de substituição galvânica entre nanocubos de Ag e solução de HAuCl₄, de acordo com estudo prévio [29, 30]. Tipicamente, nanocubos de Ag de 25 nm foram preparados em glicol dietileno e usados como modelos para síntese de nanogaias de Au de 30 nm. Em seguida, SH-PEG (PM ≈ 2000, 10 mg dissolvidos em 5 mL de tampão fosfato salino (PBS)) foi adicionado à solução de AuNC (pH 8,0, 6,55 nM, 6 mL) e agitado durante a noite no escuro sob proteção de nitrogênio. Após lavar as AuNC@PEG mais três vezes, foram dispersas em solução aquosa.

Avaliação da Toxicidade In Vitro

Neste estudo, colorimetria MTT, método de vazamento de LDH, ensaio de concentração de ROS intracelulares e coloração Calcein-AM/PI foram usados para detectar a toxicidade das AuNC@PEG sintetizadas in vitro. Células HUVEC foram inoculadas em placas de 96 poços com densidade de 1 × 10⁴/poço. O meio RPMI-1640 suplementado com 10% soro fetal bovino e penicilina (100 μg/mL) e estreptomicina foi usado. Em seguida, as células foram cultivadas a 37 °C e 5% dióxido de carbono em incubadora por 12 h. Depois, o meio com AuNC@PEG em diferentes concentrações (10, 20, 50, 100, 200, 500 e 1000 μg/mL) foi adicionado para cultura adicional. Após 24 h, o ensaio MTT foi obtido. O meio de cultura sem nanopartículas foi usado como controle em cada grupo.

Em seguida, o conteúdo de lactato desidrogenase (LDH) liberado de células HUVEC tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações foi determinado para avaliar toxicidade in vitro. As células foram inoculadas similarmente ao MTT e então tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (10, 20, 50, 100, 200, 500 e 1000 μg/mL) por 24 h. Em seguida, o sobrenadante foi separado, centrifugado e transferido para uma placa limpa de 96 poços. A atividade de LDH no meio de cultura foi avaliada conforme instruções do fabricante, e a absorbância foi determinada usando instrumento de marcação enzimática (450 nm).

Baseado no princípio de medição da concentração de ROS intracelulares usando o kit ROS, DCFH foi oxidado a diclorofluoresceína (DCF), que é uma substância verde fluorescente forte, na presença de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA). Células HUVEC foram cultivadas em placas de 24 poços por 12 h, tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (50, 100, 200 e 500 μg/mL) por 24 h, e incubadas com DCFH-DA a 37 °C por 40 min. Células tratadas com peróxido de hidrogênio (H₂O₂) foram usadas como controle positivo. A intensidade de fluorescência das células foi observada usando microscópio de fluorescência (λex, 485 nm; λem, 525 nm). Antes da avaliação, meio livre de soro e gelo foi usado três vezes para lavagem.

Para coloração vivo/morto, células HUVEC foram inoculadas em placas de 24 poços e cultivadas por 12 h. Em seguida, as células foram tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (10, 20, 50, 100, 200, 500 e 1000 μg/mL) por 24 h. Após digestão com tripsina-EDTA via centrifugação, as células foram lavadas com PBS (pH = 7,4); então, a suspensão celular preparada foi misturada com o reagente Calcein-AM/PI pré-configurado e cultivada a 37 °C por 15 min. Para detectar a toxicidade das AuNC@PEG, o número de células mortas foi avaliado via microscopia de fluorescência.

Modelo Animal

Todos os procedimentos de experimentos com animais foram realizados de acordo com critérios estabelecidos pelo Comitê de Proteção e Uso de Animais da Universidade Médica de Jinzhou. Após o experimento, os animais foram eutanasiados segundo princípios humanitários. Neste estudo, ratos Sprague Dawley adultos pesando 250–300 g (adquiridos do Centro de Animais da Universidade Médica de Jinzhou) foram utilizados. Neste experimento, todos os animais foram aleatoriamente divididos em grupos. Solução de cloral hidratado (10% p/p) foi administrada via cavidade abdominal; então, todos os materiais foram injetados via veia da cauda.

Imageamento por TC In Vitro e In Vivo

Para imageamento por TC in vitro, AuNC@PEG em diferentes concentrações e soluções de iodo foram colocadas em tubos EP e dispostas em ordem adequada, e uma TC foi realizada de frente para trás. No TC in vivo, após administrar anestesia, os animais foram escaneados da cabeça à cauda, com o centro da cavidade abdominal usado como referência. A posição dos animais não mudou a cada vez. Todos os dados originais (imagem de 0,625 mm) foram transmitidos para a estação de trabalho Philips para análise via TC.

Avaliação da Toxicidade In Vivo

Análise hematológica foi conduzida usando técnica padrão de coleta de sangue da veia safena. Os tecidos do coração, fígado, baço, pulmão e rim dos ratos foram fixados com 4% paraformaldeído por 48 h e incluídos em parafina após desidratação. A secção de parafina tinha 5 μm de espessura e foi montada em lâmina de vidro. Coloração hematoxilina e eosina (H&E) foi então realizada, e análise conduzida sob microscópio.

Análise Estatística

Dados foram analisados usando análise de variância unidirecional, e valor P foi usado como índice. Valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, expresso pelo valor médio de DP.

Resultados e Discussão

Síntese e Caracterização das AuNC@PEG

Funcionalização de superfície e controle de tamanho são dois fatores-chave para desenvolvimento de nanoagentes de contraste de alto desempenho [15]. A estrutura e características das AuNC@PEG foram determinadas por MET e DLS. A Fig. 1a mostrou que o tamanho das AuNC@PEG era de cerca de 40 nm com alta uniformidade; enquanto isso, o raio de hidratação das AuNC@PEG também foi usado para testar a dispersão na solução, como mostrado na Fig. 1b, o raio de hidratação das AuNC@PEG foi de cerca de 50 nm, mostrando que as AuNC@PEG eram muito estáveis sem qualquer agregação. As AuNC@PEG têm tamanho menor e inércia biológica relativamente boa, que são melhores para aplicações em nanomedicina. Além disso, a estrutura de gaias ocas indica grandes áreas de superfície interna e externa específicas e melhor capacidade de imagem por TC, e as paredes metálicas circundantes forneceram proteção adicional para cargas durante processamento, transporte e armazenamento. Com sua estrutura core-shell óbvia, o exterior foi coberto com PEG de aplicabilidade biológica, que pode efetivamente melhorar a biocompatibilidade e escapar da captura por macrófagos.

Imagens de MET das AuNC@PEG (a) e DLS das AuNC@PEG (b)

Segurança e Estabilidade das AuNC@PEG In Vitro

Antes de usar AuNC@PEG para imagem in vivo, avaliamos sua segurança e estabilidade. O efeito das AuNC@PEG na viabilidade de células HUVEC foi detectado usando ensaio MTT (Fig. 2a). As células foram tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (10, 20, 50, 100, 200, 500 e 1000 μg/mL) por 24 h. Os resultados do ensaio MTT mostraram que a taxa de sobrevivência celular das AuNC@PEG foi similar à do grupo controle e teve biocompatibilidade favorável quando a concentração das AuNC@PEG atingiu 200 μg/mL. A taxa de sobrevivência celular na concentração de 1000 μg/mL ainda foi > 75%.

Avaliação MTT da viabilidade de células HUVEC cultivadas com diferentes concentrações de AuNC@PEG por 24 h (a). Avaliação de lactato desidrogenase no sobrenadante induzido por AuNC@PEG com LDH (b). Exame de imagem de fluorescência de 24 h de células cultivadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (H₂O₂ (I), 0 μg/mL (II), 50 μg/mL (III), 100 μg/mL (IV), 200 μg/mL (V) e 500 μg/mL (VI)) pelo método ROS (c). *P < 0,05, ***P < 0,001. Barras de escala são 100 μm

Além disso, o ensaio LDH também foi usado para avaliar a biocompatibilidade das AuNC@PEG in vitro. Em células normais, LDH não pode passar pela membrana celular. Quando a membrana celular é danificada, LDH é liberada através da membrana celular [31]. Assim, avaliamos a segurança das AuNC@PEG medindo o conteúdo de LDH no sobrenadante celular (Fig. 2b) tratando células com AuNC@PEG em diferentes concentrações por 24 h. Os resultados mostraram que o nível de LDH liberado pelas células aumentou ligeiramente em comparação às células controle não expostas quando a concentração das AuNC@PEG foi < 200 μg/mL, e foi significativamente menor que o do grupo controle positivo (H₂O₂), consistente com os resultados do ensaio MTT, e 200 μg/mL de AuNC@PEG como concentração ótima apresentaram boa citocompatibilidade.

Além disso, testes de estresse oxidativo e avaliação de coloração imunofluorescente de células vivo/morto (Calcein-AM/PI) foram realizados para detectar a toxicidade das AuNC@PEG in vitro. Estresse oxidativo é condição prejudicial para todos os sistemas vivos, e espécies reativas de oxigênio (ROS) excessivas podem causar estresse oxidativo [32, 33]. Portanto, medimos o nível de ROS nas células. Após 24 h de indução por AuNC@PEG em diferentes concentrações, a intensidade de fluorescência verde das células induzidas na concentração de 50–200 μg/mL não diferiu significativamente da do grupo controle, e foi significativamente menor que a do grupo controle positivo (Fig. 2c). A intensidade de fluorescência foi proporcional ao nível de ROS. Como mostrado na Fig. 3, a taxa de sobrevivência de células HUVEC na concentração de 0–200 μg/mL foi > 90% (Fig. 3a–f). Os resultados acima validaram que AuNC@PEG na concentração de 200 μg/mL são estáveis e têm boa compatibilidade celular, podendo ser promissores agentes de contraste clínicos.

Imagens de microscopia de fluorescência de coloração vivo e morto. Taxa de sobrevivência de células HUVEC tratadas com AuNC@PEG em diferentes concentrações (0 μg/mL (a), 10 μg/mL (b), 20 μg/mL (c), 50 μg/mL (d), 100 μg/mL (e), 200 μg/mL (f), 500 μg/mL (g) e 1000 μg/mL (h)) por 24 h. Fluorescência verde representa células vivas e fluorescência vermelha representa células mortas. Barras de escala são 100 μm

Imageamento por TC In Vitro e Determinação do Valor CT

Para avaliar a viabilidade das AuNC@PEG em imageamento por TC, comparamos os realces de contraste de diferentes concentrações molares (AuNC@PEG) com o uso clínico de agente de contraste (iodo). Imagens de TC foram obtidas, e os valores CT medidos. AuNC@PEG foram comparadas com agentes de imagem de iodo em concentrações similares (50, 100, 200, 500 e 1000 μg/mL). Os resultados mostraram que o valor CT foi realçado com o aumento da concentração (Fig. 4a), e segundo análise dos valores CT das AuNC@PEG e agente de contraste de iodo (Fig. 4b), o coeficiente de absorção das AuNC@PEG foi melhor que o de agentes de contraste baseados em iodo em concentrações similares, indicando que o uso de AuNC@PEG para imageamento por TC é melhor.

Comparação de achados de tomografia computadorizada in vitro entre AuNC@PEG e agente de contraste baseado em iodo. À medida que a concentração aumenta, a intensidade de atenuação de raios X aumenta (a). Comparação de valores Hu entre AuNC@PEG e agentes de contraste baseados em iodo (b). ***P < 0,001

Imageamento por TC In Vivo

Devido à alta capacidade de contraste das AuNC@PEG, comparamos ainda a qualidade de imagem das AuNC@PEG com a de agentes de iodo in vivo. Duzentos microlitros de AuNC@PEG (200 μg/mL) foram injetados via veia da cauda dos ratos. O tempo de angiografia do pool sanguíneo nas AuNC@PEG foi avaliado via pré-injeção (0 min) e escaneamento contínuo de pontos temporais pós-injeção (10, 20, 30, 40, 60 e 90 min). Em seguida, os ratos do grupo controle foram injetados com meio de contraste de iodo em concentração apropriada. A dose de injeção e tempo de escaneamento foram similares aos das AuNC@PEG. Após injeção do agente de contraste, observamos simultaneamente os realces de contraste do rim (Fig. 5) e enchimento da bexiga (Fig. Suplementar 1). Os resultados mostraram que o rim no grupo AuNC@PEG atingiu o pico a 30 min e foi completamente excretado a 90 min, enquanto no grupo de agente de contraste baseado em iodo atingiu o pico a 20 min e foi completamente excretado a 60 min. Então, observamos que a bexiga foi gradualmente preenchida com agente de contraste ao longo do tempo. Este achado mostrou que o tempo de angiografia do pool sanguíneo das AuNC@PEG foi melhor que o do agente de contraste baseado em iodo. O maior tempo de circulação sanguínea das AuNC@PEG pode fornecer melhor diagnóstico, e a AuNC@PEG tem melhor perspectiva de desenvolvimento.

Imagens de TC in vivo dos ratos em diferentes pontos temporais após pós-injeção de AuNC@PEG

Segurança das AuNC@PEG In Vivo

Como mostrado na Fig. 6a, os parâmetros padrão de rotina sanguínea e análises de função hepática e renal foram refletidos pelo nível de hemoglobina, concentração média de hemoglobina corpuscular, volume corpuscular médio, contagem de plaquetas, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de glóbulos brancos, concentração de albumina, nível de alanina aminotransferase, nível de aspartato aminotransferase e nível de creatinina. Na análise estatística, nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos AuNC@PEG, agente de contraste de iodo e controle (P > 0,05). Além disso, os órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) dos ratos foram analisados histologicamente, como mostrado na Fig. 6b, 24 h após injeção de AuNC@PEG (200 μg/mL); fatiados; e corados (H&E). Comparado com o grupo controle (não injetado com nanomateriais), nenhuma mudança morfológica óbvia e lesões foram encontradas sob microscópio. Os resultados acima confirmaram ainda a segurança e confiabilidade das AuNC@PEG in vivo.

Avaliação de toxicidade in vivo das AuNC@PEG. Rotina sanguínea e função hepática e renal: nível de hemoglobina (I), concentração média de hemoglobina corpuscular (II), volume corpuscular médio (III), plaquetas (IV), contagem de glóbulos vermelhos (V), contagem de glóbulos brancos (VI), concentração de albumina (VII), nível de alanina aminotransferase (VIII), nível de aspartato aminotransferase (IX) e nível de creatinina (X) (a). Coloração H&E realizada nos órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) de ratos normais e injetados com AuNC@PEG por 24 h (b). Barras de escala de b são 100 μm

Conclusão

Desenvolvemos AuNC@PEG, um novo tipo de agente de contraste para TC, com características como tamanho pequeno, alto contraste, longo tempo de retenção sanguínea e baixo risco de toxicidade. Avaliações de toxicidade in vitro e in vivo mostraram que AuNC@PEG tiveram boa biocompatibilidade e baixo risco de efeitos colaterais. O desempenho de imageamento por TC in vitro e in vivo mostrou que AuNC@PEG têm maior coeficiente de absorção de raios X e maior tempo de angiografia do pool sanguíneo que agentes de imagem tradicionais baseados em iodo. Além disso, AuNC@PEG são superiores a agentes de imagem baseados em iodo, e o uso de AuNC@PEG é prático. Todos estes resultados mostraram que AuNC@PEG têm maior coeficiente de absorção de raios X que agentes de contraste tradicionais baseados em iodo e que o desempenho de imageamento de AuNC@PEG foi superior ao de agentes de contraste tradicionais baseados em iodo. Portanto, as AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas neste estudo têm grande potencial para aplicação clínica em imageamento por TC.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Os dados brutos/processados necessários para reproduzir estes achados não podem ser compartilhados neste momento, pois os dados também fazem parte de uma pesquisa e desenvolvimento em andamento.

Abreviações

TC:

Tomografia computadorizada

DCF:

Diclorofluoresceína

DCFH:

Diclorofluorescina

H₂O₂:

Peróxido de hidrogênio

LDH:

Lactato desidrogenase

MTT:

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo

PBS:

Tampão fosfato salino

PEG:

Polietileno glicol

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

MET:

Microscópio eletrônico de transmissão