Formação do Complexo Nanopartícula-HSA à Base de Pululano e Liberação de Droga Influenciada pela Carga de Superfície

Resumo

A composição nanomaterial das nanopartículas e sua adsorção de proteínas no sangue é de grande importância no projeto de nanopartículas carregadas de drogas. Para explorar a interação entre os diferentes componentes de superfície de nanopartículas (NPs) e proteína, sintetizamos três tipos de polímeros de pululano NP:pululano modificado hidrofobicamente (CH) colestérico (CHP), pululano animado modificado por CH (CHAP) e modificado por CH pululano carboxilado (CHSP). As NPs de pululano foram preparadas pelo método de diálise. O espalhamento de luz dinâmico foi usado para determinar a carga e o tamanho dos três NPs. O tamanho dos NPs foi alterado pelo número de grupos de carga quando os polímeros contêm o mesmo grau de substituição de colesterol. Os potenciais zeta foram + 12,9, - 15,4 e - 0,698 mV para CHAP, CHSP e CHP, respectivamente, e as dimensões foram 116,9, 156,9 e 73,1 nm, respectivamente. A calorimetria de titulação isotérmica foi usada para determinar as mudanças termodinâmicas de NPs com diferentes cargas de superfície, e o efeito da albumina sérica humana (HSA) na titulação foi investigado. As mudanças de entalpia e entropia demonstraram uma interação entre NPs e HSA; a constante de ligação ( K _b ) para CHSP, CHP e CHAP foi 1,41, 27,7 e 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ , respectivamente, com a carga positiva para CHAP – HSA, sem carga para CHP – HSA e carga negativa para o complexo CHSP – HSA. Espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular foram utilizadas para determinar a mudança na estrutura da proteína após a complexação entre NPs e HSA. A complexação de NP e HSA é um processo complicado composto pela redução do conteúdo da proteína α-helicoidal e a extensão da cadeia peptídica; Os NPs de CHP tiveram a maior redução no conteúdo de HSA α-helicoidal. As taxas de liberação de drogas de todos os compostos de NP e HSA foram significativamente menores do que aquelas de drogas livres e NPs carregadas de drogas após 48 h. As taxas mais altas e mais baixas foram observadas em CHSP – HSA e CHP – HSA, respectivamente. A liberação do fármaco foi significativamente influenciada pela adsorção de HSA em NPs, e o tamanho e a carga superficial dos NPs desempenharam um papel importante neste processo.

Histórico

Sistema de entrega de nanofármacos, como nanopartículas (NPs) carregadas com pequenas drogas antitumorais moleculares, tem propriedades de liberação sustentada e controlada de drogas, bem como efeito de direcionamento. A terapia direcionada com NPs tornou-se um foco no tratamento de tumores, porque eles podem reduzir significativamente os efeitos colaterais dos medicamentos e melhorar a eficácia dos medicamentos [1,2,3].

NPs carregados de drogas precisam passar por três caminhos para chegar ao local alvo, ou seja, a circulação sanguínea, o caminho do tecido para a célula e o movimento intracelular [4,5,6]. Eles também precisam superar a barreira vascular para atingir o tecido-alvo e, em seguida, a barreira da membrana celular para atingir a célula-alvo [7, 8]. A adsorção e a troca de proteínas estão envolvidas nas vias de todos os NPs. Finalmente, os NPs adsorvidos por proteínas alcançam as células-alvo e liberam as drogas [1, 9].

As proteínas de alta abundância, como albumina de soro humano (HSA), lipoproteínas e globulina são geralmente adsorvidas na superfície de NPs carregados de drogas, alterando assim o comportamento de liberação in vivo e os locais de direcionamento de NPs [10]. O número e o tipo de proteínas adsorvidas estão intimamente relacionados com a concentração de proteínas no plasma e a afinidade de NPs [11]. Quanto maior a concentração de proteína plasmática, maior será a adsorção superficial do NP [12]. Uma proteína com alta afinidade pode substituir aquela com baixa afinidade [13]. Portanto, a superfície do NP é ocupada pela proteína com alta concentração e forte afinidade, formando uma coroa de nanoproteínas [14]. Coroas de nanoproteínas são indispensáveis para a função in vivo dos NPs [15]. Por exemplo, se a superfície for modificada com polissorbato, os NPs podem entregar a droga através da barreira hematoencefálica até o tecido cerebral [16]; nanomateriais polissacarídicos modificados hidrofóbicos podem interagir com HSA no corpo, aumentando assim o controle da liberação do fármaco [17].

A captação de NPs pelas células é afetada por uma variedade de fatores, como as propriedades físicas e químicas dos NPs, concentração de nanofármacos, adsorção de proteínas e adesão celular [18]. Os tipos e quantidades de adsorção de proteínas afetam a função dos NPs, incluindo o controle e direcionamento da liberação do medicamento. Da mesma forma, as propriedades físicas e químicas das NPs, como tamanho de partícula, carga e hidrofobicidade da superfície, afetam a adsorção de proteínas [19]. A natureza do NP decide seu destino durante o processo in vivo [20]. Materiais macromoleculares anfifílicos, como polímeros de polissacarídeos modificados hidrofobicamente, podem ser automontados em nanopartículas. O tamanho do NP desempenha um papel importante em suas funções de direcionamento e controle de liberação de drogas [21]. O grupo hidrofóbico no polímero é uma força motriz para a formação da estrutura nuclear do NP. Quanto maior o grau de substituição do grupo hidrofóbico, menor o NP [22]. Materiais poliméricos com grupos carboxila, grupos amino e seus derivados estão envolvidos na automontagem de NPs, portanto, eles afetam o tamanho dos NPs e fornecem carga superficial para se ligarem facilmente à proteína com carga oposta [23]. NPs com diferentes cargas superficiais têm diferentes capacidades de adsorção de proteínas e diferentes funções biológicas [24]. Portanto, precisamos explorar a interação entre os diferentes componentes de superfície de NPs e proteínas.

HSA é a proteína mais abundante no sangue. É essencial para o transporte, distribuição e metabolismo de substâncias estranhas e endógenas. Muitas drogas de moléculas pequenas entram no corpo e formam adsorventes de drogas HSA no transporte de sangue, o que altera os efeitos farmacológicos das drogas [25]. NPs carregados de drogas são combinados com HSA após entrar no corpo; por causa da estrutura complexa dos NPs, as características de adsorção diferem das combinações de pequenas moléculas de HSA [26]. Por exemplo, a adsorção de drogas de moléculas pequenas a moléculas de HSA é rápida; entretanto, a adsorção de HSA a NPs é lenta e complexa [27].

Nanopartículas de CHP como carreador de fármacos têm sido estudadas há muito tempo, apresentando excelentes nanomateriais para entrega de fármacos [28, 29]. Em um experimento anterior, estudamos a interação entre HSA e NPs de pululano com diferentes graus de substituição de colesterol, pululano modificado hidrofobicamente (CH) colestérico (CHP), e encontramos principalmente dois processos:HSA rapidamente anexado à superfície de NP e, em seguida, inserido lentamente em o núcleo hidrofóbico de NPs [30]. As interações hidrofóbicas desempenharam um papel importante na formação de complexos CHP-HSA [31]. A hidrofobicidade e a estrutura shell – core das partículas foram principalmente responsáveis pelas mudanças na conformação da albumina durante a interação NP e HSA [30].

Neste estudo, fabricamos três NPs, CHP, pululano animado modificado com CH (CHAP) e pululano carboxilado modificado com CH (CHSP). Sua estrutura e propriedades foram caracterizadas por infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e NMR, e seus tamanhos e potenciais foram determinados por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e espectroscopia de fluorescência foram usadas para investigar as características de interação dos complexos NP-HSA e os efeitos dos três tipos de NPs na estrutura de HSA. Revelamos os efeitos na liberação de drogas com as propriedades dos complexos NP-HSA, que são vitais para a aplicação futura do sistema de distribuição de drogas.

Métodos

Materiais

O HSA foi adquirido da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). N , N -Imidazol era da biotecnologia de solução de estoque de Xangai (Xangai). Etilenodiamina, anidrido succínico foi fornecido por Tianjin Star Chemical Reagent (Tianjin). Todos os outros reagentes químicos eram de qualidade analítica e eram da Changsha Huicheng Co. (Changsha, China).

Síntese de CHP, CHSP e CHAP

Síntese de CHP

O succinato de colesterol (CHS) foi sintetizado conforme descrito anteriormente [32]. Uma quantidade de 2 g de polissacarídeo de pululano foi dissolvida em 10 mL de solução de dimetilsulfóxido desidratado (DMSO). Em seguida, 1,06 g de CHS, 0,505 g de EDC • HCl e 0,268 g de DMAP foram dissolvidos em uma quantidade apropriada de solução de DMSO. Os dois grupos de reagentes acima foram misturados e ativados à temperatura ambiente por 1 h, em seguida, incubados em um banho de óleo aquecido a 50 ° C por 48 h. Após a reação ser interrompida e resfriada à temperatura ambiente, uma quantidade apropriada de etanol anidro foi adicionada e o sólido branco foi precipitado por agitação e obtido por filtrações de sucção repetidas. Os produtos foram lavados com uma quantidade apropriada de etanol anidro, éter etílico e tetra-hidrofurano, em seguida, secos em um secador a 50 ° C para se tornar um sólido branco (Fig. 1).

Síntese de polímeros CHP, CHSP e CHAP

Síntese de CHAP

Uma quantidade de 1,80 g CHP e 1,00 g N , N -diimidazol foram dissolvidos em 100 mL de DMSO. Após aquecimento e agitação em um banho de óleo a 50 ° C por 4 h, 3,60 g de etilenodiamina foi adicionado seguido por aquecimento adicional e agitação por 24 h. Quando o líquido de reação resfriou à temperatura ambiente, ele foi dialisado em um saco de diálise de interceptação de 4000 com água duplamente destilada por 1 dia, em seguida, liofilizado para obter um sólido amarelo claro que era o produto de pululano animado modificado hidrofobicamente.

Síntese de CHSP

Uma quantidade de 1,80 g de CHP foi dissolvida em 100 mL de DMSO desidratado, então 0,5 g de anidrido succínico e 0,05 g de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) foram dissolvidos em 10 mL de DMSO ativado por 1 h; após aquecimento e agitação em um banho de óleo a 50 ° C durante 20 h, a reação foi interrompida. Quando o líquido de reação resfriou à temperatura ambiente, foi colocado em uma quantidade apropriada de etanol anidro e agitado para precipitar um sólido branco. O sólido branco foi lavado várias vezes com uma quantidade apropriada de etanol anidro, éter dietílico e tetra-hidrofurano e seco num secador a 50 ° C. O produto obtido foi o polissacarídeo de pululano carboxilado hidrofobicamente modificado.

Espectroscopia de FTIR e NMR

Os espectros FTIR para CHP, CHSP e CHAP foram obtidos como peletes KBr para espectroscopia FTIR (Nicolet NEXUS 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As estruturas químicas de CHP, CHSP e CHAP foram confirmadas por 500 MHz ¹ H-NMR, com DMSO-d6 como solvente. O grau de substituição do colesterol nos polímeros CHP foi determinado pela ligação glicosídica alfa-1,4 e alfa-1,6 e área do pico de metileno.

Preparação e caracterização de NPs

CHP, CHSP e CHAP NPs foram preparados pelo método de diálise [33]. Resumidamente, CHP, CHSP e CHAP foram dissolvidos em 10 mL de DMSO. Para a formação dos NPs, a solução da mistura foi injetada em uma bolsa de diálise por 24 horas para eliminação do DMSO. A solução de CHP, CHSP e CHAP NPs foi filtrada com um filtro de membrana (tamanho de poro 0,45 m, Millipore, Boston, MA, EUA) para remover os maiores agregados de CHP, CHSP e CHAP NPs. A distribuição de tamanho e o potencial zeta das partículas obtidas foram determinados por DLS (Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 11,4 V / cm, 13,0 mA.

ITC

Uma certa concentração de solução de HSA foi gotejada nas soluções CHP, CHSP e CHAP NP, e a mudança no calor foi medida por ITC (VP-ITC, Microcal, Northampton, MA, EUA). Uma quantidade de HSA 0,9 mM foi injetada em células de titulação CHP, CHSP e CHAP NP 0,01 mM, para titulação 20 vezes. A primeira gota foi de 2 μL e o tempo de reação foi de 180 s; as gotas restantes foram de 10 μL por gota e o tempo de reação foi de 210 s, e a temperatura foi fixada em 25 ° C. Os parâmetros termodinâmicos e curvas de conexão foram obtidos com 28 tempos de titulação.

Espectroscopia de fluorescência

HSA e CHP NPs foram misturados em uma proporção de moléculas de HSA para CHP de 3,6:1 para preparar misturas de CHP – HSA, CHSP – HSA e CHAP – HSA. As misturas obtidas foram colocadas em tubos EP de 2 mL e agitadas a 20 rpm a 25 ° C durante 24 h. Os espectros de fluorescência e a intensidade de fluorescência (FI) de HSA livre e HSA ligada a NP foram registrados por espectrofotometria de fluorescência (Shimadzu RF-4500, Japão). O cromóforo do triptofano na molécula de HSA foi excitado em 280 nm, e os espectros de emissão foram registrados em 290 a 450 nm. As larguras das fendas de excitação e emissão foram de 5 e 12 nm.

Sete soluções de NP em diferentes concentrações foram misturadas com solução de HSA. As soluções misturadas foram transferidas para tubos de EP de 2 mL para uma reação de 9 h. As amostras obtidas foram coletadas para medir espectros de fluorescência no comprimento de onda de 290-450 nm. Os espectros de fluorescência da solução de HSA pura foram usados como referência para determinar as constantes de ligação de acordo com a análise de Stern-Volmer. Os dados de extinção de fluorescência foram analisados usando a equação de Stern-Volmer melhorada [34]:
$$ {F} _0 / \ left ({F} _0-F \ right) =1 / {f} _ {\ mathrm {a}} + 1 / \ left ({f} _ {\ mathrm {a}} {K} _ {\ mathrm {q}} \ esquerda [Q \ direita] \ direita) $$
onde K _q é a constante de têmpera de Stern – Volmer, F ₀ e F são intensidades de fluorescência em 342 nm na ausência e presença de quencher, e [ Q ] é a concentração do inibidor.

Análise de dicroísmo circular

Os complexos CHP-HSA foram preparados de duas maneiras diferentes. O primeiro (complexo I) foi preparado simplesmente misturando soluções de HSA e CHP. O segundo (complexo II) foi mantido em tubos EP de 2 mL, os quais foram colocados em mesa agitadora com 20 rpm por 12 ha 25 ° C. Os espectros de dicroísmo circular (CD) para HSA livre e NPs adicionados à proteína foram registrados no comprimento de onda de 200-250 nm usando um espectrômetro de CD (JASCO J-810, Japão) a 37 ° C com uma célula de cubeta de 0,1 cm. A concentração de HSA foi de 1,0 mg / mL em todas as amostras. O conteúdo relativo da hélice α em HSA foi calculado da seguinte forma [35]:
$$ \ left [{\ theta} _ {208} \ right] =\ frac {\ theta M} {10 CL {N} _ {\ mathrm {r}}} $$
onde θ ₂₀₈ é a elipticidade média do resíduo (deg cm ⁻² dmol ⁻¹ ) a 208 nm, θ é a elipticidade, M é o peso molecular de HSA, C é a concentração de HSA (mg / mL), L é o comprimento da célula da cubeta (cm), e N _r é o número de aminoácidos na molécula de HSA.

Liberação de droga in vitro

NPs carregados com mitoxantrona (MTO) foram preparados por um método de diálise [36]. A curva padrão para mitoxantrona foi adquirida por espectrofotometria de UV. A carga de droga e a eficiência de encapsulamento foram calculadas conforme descrito [33]. A liberação de MTO foi estudada in vitro por diálise em solução salina tamponada com fosfato. Resumidamente, a solução de NPs carregados com MTO (2 mg / mL) foi colocada em tubo de diálise visking e dialisada contra o meio de liberação a 37 ° C em um agitador de banho de ar a 50 rpm. Em tempos predefinidos, a mídia de liberação foi coletada e a mídia de liberação fresca foi adicionada. A quantidade liberada de MTO foi determinada por espectrofotometria de UV (UV-384 plus, Molecular Devices, EUA) a 608 nm. A porcentagem de liberação acumulada ( Q %) foi calculado conforme descrito anteriormente [37]. Uma certa quantidade de solução de HSA (0,1 mg / mL) foi adicionada ao tubo de diálise para determinar a liberação do fármaco de três tipos de NPs.

Resultados

Caracterização de polímeros CHP, CHSP e CHAP

FTIR Spectra

A Figura 2 mostra os espectros de FTIR para CHP, CHSP e CHAP. Os dados para os espectros CHP foram 1731 cm ⁻¹ (–C =pico de vibração de alongamento O) e 1161 cm ⁻¹ (–C =pico de vibração de alongamento O). Este resultado demonstra a formação de ligações éster no pululano, indicando que o CHP foi sintetizado com sucesso.

Espectros de FTIR de CHP (a), CHAP (b) e CHSP (c)

Em comparação com os espectros de CHP, os dados para os espectros de CHAP foram 1648 cm ⁻¹ (–C =pico de absorção de vibração O), 1734 cm ⁻¹ (–C =pico de absorção de vibração O), 1539 cm ⁻¹ (Pico de vibração de flexão –N – H) e 3742 cm ⁻¹ (–NH ₂ alongamento do pico de vibração). De acordo com esses picos característicos, havia ligações amida no CHP, e o CHAP foi sintetizado com sucesso pela reação de esterificação.

Em comparação com os espectros CHP, os dados para os espectros CHSP foram 1710 cm ⁻¹ (–C =pico de vibração de alongamento O), 1158 cm ⁻¹ (–C =pico de vibração de alongamento O), 1560 cm ⁻¹ (duplo –C =pico de vibração de acoplamento O) e 1421 cm ⁻¹ (Pico de vibração de flexão –O – H). Isso mostra que havia grupos carboxila no CHP e parte deles se tornou sais.

¹ H NMR

A Figura 3 mostra o ¹ Espectro de H NMR para CHP, CHSP e CHAP. Um total de 0 a 2,40 ppm pertencia ao sinal de hidrogênio do colesterol, o que demonstrou o sucesso da síntese de CHP. Os picos característicos de DMSO-d 6 e metileno (–CH ₂ CH ₂ -) mostrou sinais a 2,49 e 2,53 ppm, respectivamente. Em comparação com o CHP, o CHAP mostrou sinais a 8–9 ppm, que pertenciam ao grupo amino e provou que a etilenodiamina foi enxertada no CHP. O grau de substituição do colesterol por 100 unidades de glicose no CHP pode ser calculado pela razão de prótons de metileno para prótons de açúcar com a seguinte equação [38]:
$$ \ mathrm {DS} =\ frac {A _ {\ parcial 2,53}} {4 \ esquerda ({A} _ {\ parcial 4,74} + {A} _ {\ parcial 5,01} \ direita)} $$

¹ Espectros de HNMR para NPs CHP (a), CHSP (b) e CHAP (c)

onde A _δ2,53 é a área do espectro sob o pico de absorção característico do metileno (hidrogênio), e A _δ4,74 e A _δ5,01 são a área do espectro sob os picos de absorção característicos para as ligações alfa-1,6 e alfa-1,4 glicosídicas, respectivamente.

Do ¹ Espectro de H RMN em CHP, o grau de substituição de succinato de colesterol (CHS) foi de 4,50%. Para CHSP NPs, os grupos metileno (–CH ₂ CH ₂ -) incluiu dois aspectos:anidrido succínico e CHS. O grau de substituição foi de 12,34% para grupos de metileno (–CH ₂ CH ₂ -) e 7,84% para grupos carboxila. Para CHAP NPs, os grupos de metileno (–CH ₂ CH ₂ -) incluiu dois aspectos:etilenodiamina e CHS. O grau de substituição foi de 18,6% para grupos de metileno (–CH ₂ CH ₂ -) e 14,1% para os grupos amino.

Propriedades de CHP, CHSP e CHAP NPs

Os polímeros anfifílicos podem ser automontados por diálise para formar NPs núcleo-casca com uma camada hidrofílica e um núcleo hidrofóbico, que podem ser carregados com drogas anticâncer para formar NPs carregados com drogas. As propriedades NP, como carga superficial e tamanho, tiveram uma influência vital na eficácia do tratamento como carreador de drogas [39, 40]. A distribuição de tamanho e o potencial zeta de CHP, CHSP e CHAP NPs medidos por DLS são apresentados na Fig. 4. O tamanho médio dos NPs foi 73,1, 116,9 e 156,9 nm para CHP, CHAP e CHSP, respectivamente. O potencial zeta era - 0,698, + 12,9 e - 15,4 mV, respectivamente (Tabela 1).

Potencial Zeta ( a ) e distribuição de tamanho ( b ) de NPs CHP (

), CHAP NPs (

), e CHSP NPs (

)

Para pululano NPs com o mesmo grupo hidrofóbico, o tamanho era maior para CHSP carregado negativamente e CHAP carregado positivamente do que CHP NPs neutros. Assim, o grupo carregado interfere no comportamento de automontagem dos NPs, formando NPs de maior tamanho e com estrutura solta em solução aquosa. Os potenciais zeta de CHP NPs, CHAP e CHSP NPs foram - 0,698 mV, + 12,9 mV e - 15,4 mV, respectivamente. Assim, os grupos amino e carboxila no polímero podem criar NPs com diferentes cargas de superfície e, assim, alterar as propriedades da superfície.

Análise Termodinâmica

A análise termodinâmica foi realizada usando ITC com titulação de HSA para soluções CHP, CHSP e CHAP NP. Como titulação de HSA para solução de NP de pululano com diferentes cargas, determinamos as mudanças de calor, ajustando as propriedades de conexão de três tipos de materiais, conexão e número de conexão de moléculas. O espectro original do termômetro de titulação isotérmica reflete a mudança no calor. O pico para cima indica uma reação de liberação de calor e o pico para baixo indica uma reação de absorção de calor [41, 42]. Quando os NPs CHP, CHAP e CHSP foram titulados com HSA, o calor liberado da combinação diminuiu gradualmente ao longo do tempo (Fig. 5). No geral, 26 gotas de solução de HSA foram tituladas na solução de CHP NP e os picos do espectro foram para cima, indicando a natureza exotérmica da reação. O mesmo fenômeno foi observado quando a solução de HSA foi titulada na solução de CHSP NP. No entanto, quando a solução de HSA foi titulada na solução CHAP NP, os picos do espectro para as primeiras quatro gotas foram para cima, enquanto a partir da quinta gota, os picos viraram para baixo, indicando uma reação endotérmica. A absorção de HSA de CHP e NPs de CHSP foi exotérmica, de modo que a reação foi espontânea. A absorção de HSA de CHAP NPs foi parcialmente endotérmica e parcialmente exotérmica, o que pode estar relacionado à carga positiva de CHAP.

Dados de calorimetria de titulação isotérmica para titulação de HSA em a CHP, b CHSP e c CHAP NPs a 25 ° C. A concentração de NP na célula (250 μL) foi de 12 μM e a concentração de proteína na seringa foi de 230 μM. Os gráficos superiores mostram dados brutos e os gráficos inferiores mostram aquecimentos integrados

O valor de entalpia reflete o calor liberado pela combinação de HSA e NPs. As alterações de entalpia de CHP, CHSP e CHAP NPs por HSA foram 42,827, 80,3712 e 22,3951 KJ / mol, respectivamente (Tabela 2). Combinada com a mudança de entalpia, a reação exotérmica, a estrutura química dos NPs anfifílicos e a carga negativa de HSA, a interação hidrofóbica pode conduzir principalmente a interação de HSA com CHP e CHSP NPs. Digno de nota, na titulação HSA de CHAP, o calor incluiu um valor negativo. As moléculas de HSA contêm uma bolsa hidrofóbica que pode ser combinada com o centro hidrofóbico do NP [43], de modo que a interação desencadeada pelas primeiras quatro gotas de HSA e CHAP é principalmente impulsionada por forças hidrofóbicas. Embora o HSA seja carregado negativamente e o CHAP esteja carregado positivamente, a partir da quinta gota, há também uma força de carga entre o HSA e o CHAP devido à natureza endotérmica da reação.

O valor da mudança de entropia pode refletir a dificuldade da reação entre HSA e NPs. As entropias de HSA e CHP, CHSP e CHAP NPs foram 0,251, 2,775 e 0,201 KJ / mol K, respectivamente (Tabela 2), então CHP e CHAP NPs são mais facilmente para se ligar a HSA, enquanto CHSP NPs são mais difíceis de ligar a HSA.

A cobertura de HSA e CHP, CHSP e CHAP NPs foi 1,17, 0,404 e 0,845, respectivamente. A concentração de NPs é calculada com base na concentração do polímero e não no número de partículas. Não sabemos quantas partículas de polímero contêm um único NP, então não podemos determinar exatamente quanto de cada NP é adsorvido por HSA, mas com base no valor da cobertura, podemos concluir que os NPs de CHP têm a maior adsorção de HSA.

Em experimentos anteriores, mostramos que o valor de afinidade, K _A , reflete a força da força de ligação entre NPs e HSA [32]. Quanto mais forte for a hidrofobicidade dos NPs do CHP, mais forte será a afinidade [44]. A constante de ligação de HSA e CHP era 27,7 × 10 ⁴ M ⁻¹ , o de HSA e CHSP era 1,41 × 10 ⁴ M ⁻¹ , e o de HSA e CHAP era 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ . Assim, a combinação de HSA e CHAP com carga positiva foi a mais forte, seguida por CHP com carga neutra e CHSP com carga negativa. A combinação mais forte de HSA e CHAP pode ser atribuída à força hidrofóbica, uma atração mútua da força de carga e provavelmente uma carga mutuamente exclusiva entre HSA e CHSP.

Espectroscopia de fluorescência

Com espectros de fluorescência, estudamos a interação entre HSA e os três NPs com diferentes cargas de superfície. HSA contém 585 resíduos de aminoácidos, com apenas um resíduo Trp em 214 (Trp214), e seu espectro de fluorescência domina a região UV. Quando outras moléculas interagem com HSA, o espectro de fluorescência de Trp pode mudar, dependendo da interação entre HSA e outras moléculas. Quando os três NPs foram misturados com HSA, o pico máximo de emissão do espectro de fluorescência de HSA não sofreu uma mudança química; apenas a intensidade foi enfraquecida até certo ponto (Fig. 6A). O pico máximo de emissão de HSA foi observado quando HSA combinado com CHAP NPs.

A Espectros de fluorescência para HSA (1,5 × 10 ^{- 5} mol / L) sem (a) e com (b) CHSP, (c) CHP e (d) CHAP NPs com a mesma concentração (4,2 × 10 ^{- 6} mol / L). B Intensidade de emissão de HSA com CHSP, CHP e CHAP NPs a 343 nm ao longo do tempo

Estudo experimental mostrou que a combinação de HSA e NPs de pululano exibiu um processo complexado [45]. Adicionamos os três NPs à solução de HSA e descobrimos que a intensidade de fluorescência dos três complexos NP-HSA diminuiu gradualmente (Fig. 6B). O equilíbrio foi alcançado para HSA – CHSP em 556,3 nm após 12 h, para CHP – HSA em 534,3 nm após 10 h, e para CHAP – HSA em 512,3 nm após 8 h. O tempo necessário quando a intensidade de fluorescência de diferentes complexos NP-HSA é equilibrada está relacionado à carga transportada pelo NP. O tempo mais longo necessário para atingir o equilíbrio foi observado em CHP-HSA com carga negativa, seguido por CHP-HSA sem carga.

A rápida redução na intensidade de fluorescência inicial dos três complexos NP-HSA (mostrado na Fig. 6A) é devido à rápida adsorção de NPs e HSA. A intensidade de fluorescência subsequente mostra uma diminuição lenta para o status constante porque a interação de NPs com HSA é um processo lento de combinação. A intensidade de fluorescência constante reflete o estado de saturação da complexação. A interação entre os três NPs com cargas diferentes e HSA passou por um processo de recombinação rápida precoce e um processo de recombinação lento posterior. A combinação de HSA com carga negativa com CHSP com carga negativa exigiu mais tempo para atingir a saturação complexa em comparação com CHP sem carga. A combinação de HSA de carga negativa com CHAP de carga positiva exigiu o menor tempo para atingir a saturação complexa.

A Figura 7A-C mostra os espectros de HSA combinados com diferentes concentrações de CHSP, CHP e CHAP NPs para formar complexos NP-HSA. Com o aumento da concentração de NPs, o pico máximo de absorção do complexo NP-HSA diminuiu, mostrando uma correlação reversa.

Espectros de fluorescência de HSA (1,5 × 10 ^{- 5} mol / L) com CHSP ( A ), CHP ( B ) e CHAP ( C ) em diferentes concentrações (a) 0, (b) 2,07 × 10 ⁻⁷ , (c) 3,31 × 10 ⁻⁷ , (d) 4,14 × 10 ⁻⁷ , (e) 8,28 × 10 ⁻⁷ , (f) 20,7 × 10 ⁻⁷ , (g) 33,1 × 10 ⁻⁷ , e (h) 41,4 × 10 ⁻⁷ mol / L. D Plotagens ( n =7) para F ₀ / ( F ₀ - F) vs 1 / [ Q ], Q é a concentração de CHSP (- ◆ -), CHP (- ■ -) e CHAP (- ▲ -), respectivamente

O CHAP-HSA carregado positivamente exibiu o tempo mais curto para atingir o equilíbrio.

Usamos uma equação de Stern-Volmer modificada para analisar os dados de extinção de fluorescência:
$$ {F} _0 / \ left ({F} _0-F \ right) =1 / {f} _ {\ mathrm {a}} + 1 / \ left ({f} _ {\ mathrm {a}} {K} _ {\ mathrm {q}} \ esquerda [Q \ direita] \ direita) $$
onde f _a é a fração de contato da substância fluorescente com o inibidor, K _q é a constante de têmpera de Stern-Volmer, F ₀ é a intensidade de fluorescência em 342 nm sem o inibidor, F é a intensidade de fluorescência em 342 nm com o inibidor, e [ Q ] é a concentração do inibidor.

Da imagem funcional de F ₀ / ( F ₀ - F ) par 1 / [ Q ], podemos obter os valores de f _a e K _q da encosta e da interceptação (Fig. 7D). Assumindo que a intensidade de fluorescência observada muda principalmente devido à interação entre NPs e HSA, a constante de extinção pode ser vista como uma constante de ligação para a formação de complexos. As constantes de ligação para moléculas de HSA e CHSP, CHP e CHAP foram 2,02, 2,99, 4,72 × 10 ⁵ M ⁻¹ , respectivamente. No estudo anterior, discutimos a interação entre HSA e CHP NPs com diferentes substituições de hidrofobicidade [30]. The hydrophobic interaction between HSA molecules and CHP cholesterol played an important role in the formation of CHP–HSA. The greater the hydrophobic substitution of CHP, the greater the binding constant of CHP and HSA.

In the present study, we found that the value of the binding constant (K _b ) is related to the electrical properties of the NP. A surface with a positive charge, such as CHAP, has the largest K _b , and a surface without a charge, such as CHP, has the second largest K _b . The K _b for CHSP, with a negative charge, was the lowest. Therefore, in addition to the hydrophobic interaction between NPs and HSA, the electrostatic interaction between them also plays an essential part in the formation of NP–HSA complexes.

In addition, the f _a values for CHSP, CHP, and CHAP NPs were 0.269, 0.288, 0.38, respectively, so part of the Trp residue was involved in this reaction. Furthermore, the amount of HSA was too much at a given NP/HSA concentration, so free HSA molecules presented in the reaction system.

CD Spectrum Analysis

Figure 8A shows the CD spectra (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. There are two negative bands at 208 and 222 nm of the UV region in HSA spectra, which are the characteristic peaks of the α -helical structure. O α -helical content of free HSA was 55%. At the beginning of the complex, with the recombination of HSA and CHSP, CHAP, and CHP NPs, the α -helical content of HSA was reduced to 52.0%, 48.57%, and 48.0%, respectively.

A CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. B CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. C Ellipticity at 208 nm for HSA interacting with CHSP (–▲–), CHAP (–●–) and CHP (–■–) over time

Figure 8C shows that the ellipticity changes of the three samples at 208 nm over time. The ellipticity of HSA combined with CHAP and CHP NPs increased from 0 to 12 h and leveled off at 12 h, but that of HSA with CHSP NPs increased faster, i.e., the ellipticity increased from 0 to 9 h and leveled off at 9 h. Therefore, the ellipticity of the three samples gradually increased over time and the α-helical content gradually decreased; when the ellipticity maintained constant, the recombination of the sample and HSA was completed.

Figure 8C illustrates that the fastest surface absorption rate was presented on the combination of CHSP and HSA. The size, charge, and hydrophobicity of NPs can influence the migration rate of HSA to the center of NPs. The surface of CHP is not charged, the surface of CHSP is negatively charged, and the surface of CHAP is positively charged. Owing to the presence of the negative-charge mutual exclusion between CHSP and HSA, the resistance of HSA migrating to the CHSP NP center becomes larger. The traction of NPs on HSA is driven by the hydrophobic interaction forces. The traction of the three NPs on HSA is identical, so the lowest velocity of HSA migrating to the center of NPs was observed on the combination of HSA and CHSP NPs. Because the particle size is in the order of CHSP> CHAP> CHP, the particle density displays a reverse order, i.e., CHSP
The ITC results show that the amount of HSA migrating toward the center of CHSP NPs is the smallest but with the fastest speed compared with other types of NPs. Table 3 shows that the α-helix content of HSA migrating toward the center of CHP NPs was the lowest. The more the secondary structure of HSA was damaged, the faster the HSA migrated toward the center. The fastest speed was observed on HSA migrating to the center of CHSP NPs (Fig. 8C).

Figure 8B shows CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. After the complexation is completed, the α -helical content of HSA recombined with CHSP, CHAP, and CHP was reduced to 46.27%, 44.55%, and 42.91%, respectively (Table 3). With the increase in interaction time, the secondary structure of HSA was changed and the α -helical content was reduced during the process of complexation with NPs.

Drug Release

We measured the drug release rate of MTO with the three kinds of drug-loaded NPs and drug-loaded NP–HSA complexes. The drug release for free MTO was about 99.8% at 4 h (Fig. 9). The release rate in 48 h for CHP, CHAP, and CHSP NPs was 53.68%, 58.54%, and 63.24%, respectively. The drug release from all NPs was fast in the first 8 h, which was a burst release process, and the drug release remained stable after 12 h, which was a sustained release process. In vitro drug release from NPs is not affected by gastrointestinal pH and enzymes, and the dissolution of nanomaterials results in little drug release. The release is mainly determined by dissolution and diffusion [46]. The 48-h drug release rate was in the order of CHSP> CHAP> CHP, corresponding to the size of NPs. The fastest release rate was found on CHSP, which was negatively charged with the largest size. The second fast drug release rate was found on which was positively charged with the size smaller than CHSP. CHP was electrically neutral, and its drug release rate was minimal. Hence, the polymer surface groups involved in the formation of NPs affect the size of NPs and ultimately the drug release of NPs.

Mitoxantrone (MTO) release of pullulan NPs in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C in vitro (□:free mitoxantrone, ○:CHP, △:CHAP, ▽:CHSP, ◁:CHAP–HSA,◇:CHP–HSA, ▷:CHSP–HSA)

The drug release rate from the combinations of HSA and CHAP, CHP, and CHSP in 48 h was 32.45%, 33.86%, and 35.76%, respectively. After the combination of NPs and HSA, the drug release in 48 h was significantly decreased as compared with HSA-free NPs, which was mainly attributed to the resistive effect and adsorption effect of HSA. At 48 h, the drug release of the compounds was in the order of CHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSA, while the drug release of HSA-free NPs was in the order of CHSP> CHAP> CHP. Although NP–HSA compounds showed significantly slow drug release, the total release of CHP-HSA decreased by 21.23% in 48 h, whereas the total release of CHAP-HSA decreased by 25.68% and that of CHSP-HSA by 28.48%. The drug release of the NPs is related to the size of the NPs and the polymer hydrophobic groups on NP surface. The adsorption of HSA can lead to significant slowdown in drug release, which is related to the hydrophobicity of NPs and also to the surface charge of NPs [46]. The adsorption of HSA is closely related to the size of the NPs and the degree of substitution of the hydrophobic groups of the polymer during the self-assembly process. Nevertheless, the drug release of the NPs is ultimately determined by the properties of the NP itself.

Discussion

As shown in Fig. 10, the formation of the NP–HSA complex is driven by a hydrophobic force between cholesterol groups of the particle core and the aromatic amino acid of the hydrophobic domain of HSA. After mixing, HSA interacts with the surface cholesterol unit and is rapidly adsorbed to the NP surface. Then, the adsorbed HSA on the NP surface is processed because of the hydrophobic forces derived from the cholesteric unit in the particle core. When overcoming the steric hindrance of polysaccharide chains in the NP shell, the adsorbed HSA gradually migrates to the core. After the hydrophobic interaction and resistance of the hydrophilic polysaccharide chain are balanced, the HSA molecule enters the particle core to become hydrophobically bound to cholesterol groups to form the NP–HSA complex.

Adsorption of HSA to NPs

For CHAP and CHSP NPs, the recombination of HSA is a complex process also subjected to the charge interaction with HSA under the traction of the hydrophobic driving force. The binding constants of the three kinds of NPs with the same hydrophobic substitution and different surface charge were in the order of CHAP> CHP> CHSP. The electrical properties also play a major part in the formation of NP–HSA. In this process, the formation of the CHSP–HSA complex was blocked by the structure of the NP shell and the repulsive force between the negative charges, which led to their loose connection. During the rapid adsorption and slow recombination, the degree of spiraling of HSA is lower for CHSP NPs than CHP NPs and CHAP NPs. Therefore, the surface charge of NPs not only changes the nature of the particles themselves but also affects the protein complex.

In the current study, we investigated the effect of NP surface charge on the interaction between NPs and proteins (Fig. 10). Three different charges of pullulan NPs with HSA adsorption still showed rapid adsorption and slow recombination. The number of HSA molecules with positively charged CHAP complex was the most, including rapid adsorption of NP–HSA by hydrophobic forces, HSA molecule migration to the center, and the HSA molecules adsorbed on the surface of NPs by charge action. CHP- and CHSP-adsorbed HSA molecules were mainly distributed in the hydrophobic center of NPs, with CHSP adsorbing fewer HSA molecules. The adsorbed number of HSA molecules is related to the hydrophobicity of NPs. The greater the degree of substitution of hydrophobicity, the more HSA is adsorbed [41]. The cholesterol substitutions of the three NPs were the same, and the number of HSA molecules adsorbed by positively charged NPs was the highest, so the adsorption of NPs and HSA was related to the hydrophobicity and surface charge of the NPs.

The surface adsorption capacity between NPs and HSA is also related to the hydrophobicity and charge of NPs. The binding force between HSA and NPs is determined by the hydrophobicity, surface charge, size, and structure of NPs. The α-helicity was decreased most at the beginning of adsorption and the complete CHP–HSA complex. CHP NP has the smallest size and highest density. The CHP NPs migrated toward the center by the hydrophobic traction; the sugar chain of the CHP NP shell was larger to inhibit the migration toward the center. The extension of the peptide chain of HSA is larger, with the α -helix decreased the most. Although CHAP NPs have hydrophobic and charge forces, they possess relatively large size, loose structure, small resistance in the periphery, small extension of the peptide chain, and small content of the α -helix. Some HSAs remained on the surface of NPs through the charge force of adsorbing, and the α -helical content is also smaller in this part of the HSA. O α -helix content of CHAP decreased less than that of CHP, mainly due to the peptide chain extension-induced central pulling force which led to α-helix content decline. During the process of the CHSP and HSA complexation, the role of the central pulling force has a reverse direction of the charge force, thereby resulting in weakening the center of the migration force. CHSP NPs are larger than CHAP NPs, and the structure of CHAP NPs is loose. Because the adsorbed number of HSA on CHAP is higher than that on CHSP, the decrease of α -helicity in CHSP is less than that in CHAP NPs. Therefore, the interaction between NPs and HSA and the decrease in α -helicity are all related to the size, density, hydrophobicity of substitution, surface charge of the NPs, and number of HSA connections.

After the NPs enter into the blood, protein adsorption affects the functions of NPs, such as the slow and controlled drug release, the travel from the blood circulation passing through the vascular barrier, targeting tissue, and entering cells. NPs interact with the HSA in the body and affect the in vivo behavior of NPs. The number of adsorbed proteins is closely related to the properties of the NPs. HSA adsorbs NPs, which affects the distribution in organs and removal of NPs, thereby altering the concentration of the drug in the body and the efficacy of the drug.

Finally, the properties of NPs, such as size, hydrophobicity, and surface charge, affect the drug release of NPs in vivo. We can design specific materials to perform specific functions with specific protein adsorption.

Conclusions

In this study, three kinds of nano-drug carriers were constructed, CHP, CHSP, and CHAP. The size, charge, drug loading properties of NPs, interaction between NPs and HSA, and drug release were all closely related to charge amount and charge type of nanomaterials. With the same degree of substitution of hydrophobicity, CHAP NPs with larger amino substitutions were the largest, CHSP NPs the second largest, and CHP NPs the smallest. The size and surface charge of the NPs were essential to the coverage of HSA, the binding constant, and the slow drug release. The positively charged CHAP binding constant was the strongest, showing the fastest drug release, and CHP NPs had the highest coverage. The combination of HSA further retarded the drug release of NPs. CHAP NPs adsorbed HSA had the slowest drug release rate.