Carga Superficial Governa Complexação de Nanopartículas de Pululana com Albumina Sérica Humana e Liberação Controlada de Fármaco

Resumo

O design de nanopartículas depende de como a química de superfície governa a adsorção de proteínas na corrente sanguínea. Sintetizamos três polímeros baseados em pululana — pululana modificada com colesterol (CHP), pululana animada modificada com CH (CHAP) e pululana carboxilada modificada com CH (CHSP) — e formamos nanopartículas via diálise. Espalhamento dinâmico de luz revelou que o tamanho das partículas variou com o número de grupos carregados: CHP (73,1 nm, −0,698 mV), CHAP (116,9 nm, +12,9 mV) e CHSP (156,9 nm, −15,4 mV). Calorimetria de titulação isotérmica mostrou perfis termodinâmicos distintos para ligação à HSA: constantes de ligação (K_b) de 1,41 × 10⁴, 27,7 × 10⁴ e 412 × 10⁴ M⁻¹ para CHSP, CHP e CHAP, respectivamente, refletindo a influência da carga superficial. Análises de fluorescência e dicroísmo circular confirmaram que a HSA sofre redução α-helical upon complexação, com CHP induzindo a maior mudança conformacional. Estudos de liberação de fármaco in vitro usando mitoxantrona demonstraram que a adsorção de HSA desacelerou marcadamente a liberação: após 48 h, CHSP-HSA liberou 35,8%, CHP-HSA 33,9% e CHAP-HSA 32,5%, comparados a 53,7%, 58,5% e 63,2% para seus equivalentes de nanopartículas livres. Estes resultados ressaltam que tamanho de nanopartícula, carga superficial e formação de coroa proteica ditam criticamente a cinética de liberação de fármaco e, por extensão, a eficácia terapêutica.

Introdução

A administração de fármacos nano-direcionada emergiu como pedra angular da oncologia moderna, oferecendo liberação sustentada e toxicidade sistêmica reduzida (1-3). Para uma nanopartícula (NP) atingir tecido tumoral, ela deve navegar na circulação sanguínea, atravessar o endotélio vascular, penetrar a matriz extracelular e entrar nas células cancerosas (4-6). Adsorção de proteínas — particularmente de proteínas plasmáticas de alta abundância como albumina sérica humana (HSA) — forma uma "coroa proteica" que pode alterar biodistribuição da NP, captação celular e liberação de fármaco (10-14). A composição da coroa é impulsionada por concentração de proteína, afinidade da NP e propriedades de superfície, incluindo carga, hidrofobicidade e tamanho (15-19).

Pululana, um polissacarídeo neutro, pode ser quimicamente modificada para introduzir grupos colesterol hidrofóbicos, produzindo polímeros anfifílicos que auto-montam em NPs núcleo-casca. Trabalhos prévios mostraram que pululana modificada com colesterol (CHP) pode encapsular fármacos anticancerígenos e que HSA liga a CHP via interações hidrofóbicas (28-31). Baseando-nos nisso, projetamos duas variantes adicionais: pululana animada modificada com CH (CHAP) contendo grupos amino e pululana carboxilada modificada com CH (CHSP) contendo grupos carboxila. Estas modificações permitem exploração sistemática de como a carga superficial influencia adsorção de proteína e liberação de fármaco.

Métodos

Materiais

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-imidazol, etilenodiamina, anidrido succínico e outros reagentes foram grau analítico.

Síntese de CHP, CHSP e CHAP

CHP foi preparado por esterificação de pululana com succinato de colesterol (CHS) em DMSO, seguido de purificação (Fig. 1). CHAP foi obtido reagindo CHP com N,N-dimidazol e etilenodiamina; CHSP foi sintetizado via acoplamento com anidrido succínico. Confirmação estrutural foi realizada por FTIR e ¹H-RMN, resultando graus de substituição de colesterol de 4,5% (CHP), 7,8% (CHSP) e 14,1% (CHAP) (Fig. 2-3).

Preparação e Caracterização de NPs

Nanopartículas foram formadas por diálise dos polímeros em DMSO contra água, seguida de filtração (0,45 µm). Tamanho e potencial zeta foram medidos por espalhamento dinâmico de luz (DLS). NPs CHP, CHAP e CHSP exibiram diâmetros médios de 73,1 nm, 116,9 nm e 156,9 nm, com potenciais zeta de −0,698 mV, +12,9 mV e −15,4 mV, respectivamente (Fig. 4).

ITC

Calorimetria de titulação isotérmica quantificou a termodinâmica de ligação da HSA a cada tipo de NP a 25 °C (Fig. 5). Ligação exotérmica foi observada para CHP e CHSP, enquanto CHAP exibiu fase exotérmica inicial seguida de ligação endotérmica, refletindo a interação de forças hidrofóbicas e eletrostáticas.

Espectroscopia de Fluorescência

Fluorescência de HSA (excitação 280 nm, emissão 290-450 nm) foi monitorada após mistura com cada tipo de NP. Análise de quenching usando equação de Stern-Volmer modificada resultou em constantes de ligação de 2,02, 2,99 e 4,72 × 10⁵ M⁻¹ para CHSP, CHP e CHAP, respectivamente, indicando a interação mais forte para o CHAP carregado positivamente.

Análise de Dicroísmo Circular

Espectros CD (200-250 nm) avaliaram mudanças na estrutura secundária da HSA upon ligação à NP. Conteúdo α-helical diminuiu de 55% (HSA livre) para 48-52% para os complexos, com redução mais pronunciada para CHP-HSA (Fig. 8).

Liberação de Fármaco In Vitro

Mitoxantrona (MTO) foi encapsulada em cada NP via diálise. Perfis de liberação foram medidos em PBS a 37 °C, com e sem HSA (0,1 mg/mL). O fármaco livre liberou 99,8% em 4 h. Para NPs sozinhas, taxas de liberação a 48 h foram 53,7% (CHP), 58,5% (CHAP) e 63,2% (CHSP). Presença de HSA reduziu estas taxas para 33,9% (CHP-HSA), 32,5% (CHAP-HSA) e 35,8% (CHSP-HSA) (Fig. 9).

Resultados

Caracterização dos Polímeros CHP, CHSP e CHAP

Espectros FTIR confirmaram funcionalização bem-sucedida: picos de carbonila de éster a 1731 cm⁻¹ para CHP, picos de amida a 1648 cm⁻¹ para CHAP e picos de carboxila a 1710 cm⁻¹ para CHSP (Fig. 2). Análise RMN quantificou graus de substituição (Tabela 1).

Propriedades das NPs CHP, CHSP e CHAP

Tamanho e carga superficial influenciaram diretamente a auto-montagem das NPs: CHSP carregado negativamente e CHAP carregado positivamente formaram partículas maiores (156,9 nm e 116,9 nm) comparado com CHP neutro (73,1 nm). Potenciais zeta refletiram os grupos funcionais incorporados (−15,4 mV, +12,9 mV, −0,698 mV). A presença de grupos carregados desfez o empacotamento do núcleo, resultando em estruturas mais frouxas e maiores (Fig. 4).

Análise Termodinâmica

Dados ITC (Tabela 2) revelaram ligação exotérmica para CHP (ΔH = 42,8 kJ mol⁻¹) e CHSP (ΔH = 80,4 kJ mol⁻¹), e perfil exo-endo misto para CHAP (ΔH = 22,4 kJ mol⁻¹). Mudanças de entropia sugeriram ligação de HSA mais fácil a CHP e CHAP (ΔS = 0,251 kJ mol⁻¹ K⁻¹ e 2,775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) que CHSP (ΔS = 0,201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Espectroscopia de Fluorescência

Quenching de fluorescência confirmou fase de adsorção rápida seguida de formação de complexo mais lenta. Constantes de ligação derivadas da análise de Stern-Volmer corresponderam aos resultados de ITC, ressaltando o papel dominante da eletrostática para CHAP e hidrofobicidade para CHP (Fig. 7).

Análise de Espectro CD

Medidas CD mostraram perda progressiva de α-hélice upon complexação: CHP-HSA caiu para 48,0%, CHAP-HSA para 48,6% e CHSP-HSA para 52,0% (Fig. 8). A redução mais rápida de helicidade ocorreu para CHP, consistente com seu núcleo menor e densamente empacotado.

Liberação de Fármaco

Adsorção de HSA consistentemente desacelerou liberação de fármaco em todos os tipos de NP. A hierarquia de taxas de liberação (48 h) correspondeu à sequência de tamanho de NP e carga superficial: CHSP > CHAP > CHP para NPs livres, e CHSP-HSA > CHP-HSA > CHAP-HSA para complexos ligados a proteína (Fig. 9). Estes achados destacam como a coroa proteica modula vias de difusão e degradação.

Discussão

Nossos dados confirmam que a carga superficial é fator decisivo na formação de coroa de HSA e subsequente liberação de fármaco. O CHAP carregado positivamente formou o complexo NP-HSA mais forte, atribuível à atração eletrostática combinada e ancoragem hidrofóbica. Em contraste, o CHSP carregado negativamente exibiu a ligação mais fraca, limitada por repulsão de carga e casca mais porosa que retardou migração da proteína ao núcleo. CHP neutro ocupou posição intermediária, exibindo a maior cobertura de HSA devido a seu núcleo compacto e hidrofóbico.

Estas interações influenciam o destino in vivo de NPs carregadas com fármaco. Uma coroa proteica densa pode impedir travessia endotelial, alterar distribuição orgânica e reduzir captação celular (15-18). Ao ajustar a carga superficial, podemos modular composição da coroa e assim ajustar farmacocinética e janelas terapêuticas.

Conclusões

Projetamos com sucesso três nanopartículas baseadas em pululana com cargas superficiais distintas. Tamanho, carga e hidrofobicidade governaram coletivamente adsorção de HSA, força de ligação e cinética de liberação de fármaco. CHAP carregado positivamente exibiu a ligação proteica mais forte e a liberação de fármaco mais lenta, enquanto CHP neutro mostrou a maior cobertura proteica mas a liberação mais rápida entre NPs livres. Estes insights fornecem um blueprint para projetar nanotransportadores com perfis de coroa proteica personalizados para otimizar administração direcionada e liberação controlada.