Nanoclusters fluorescentes de neoglicoproteína de ouro:Síntese e aplicações em detecção de lectina vegetal e imagem celular

Resumo

As interações carboidrato-proteína medeiam processos biológicos fundamentais, como fertilização, sinalização celular ou comunicação hospedeiro-patógeno. No entanto, devido à enorme complexidade dos eventos de reconhecimento de glicano, novas ferramentas que permitem sua análise ou aplicações surgiram nos últimos anos. Aqui, nós descrevemos a primeira preparação de nanoclusters de ouro fluorescentes funcionalizados com neoglicoproteína, contendo um N-glicano biantenário G0 como molécula de direcionamento, ovalbumina como antígeno carreador / modelo e um núcleo de ouro fluorescente como sonda de imagem (G0-OVA-AuNCs). Posteriormente, demonstramos a utilidade de G0-OVA-AuNCs gerados para detecção específica de lectinas de plantas e imagens in vitro de células dendríticas.

Introdução

Nanoclusters de ouro (AuNCs) formados por dez a cem átomos de ouro têm ganhado a atenção da comunidade científica devido às suas atrativas propriedades químicas e físicas [1]. Menores que 3 nm, os nanoclusters de ouro se aproximam do comprimento de onda de Fermi dos elétrons, dando origem à emissão de fluorescência dependente do tamanho e oferecendo oportunidades como sondas de detecção e imagem para aplicações in vitro e in vivo [2,3,4]. Os ensaios fluorescentes atuais envolvem principalmente corantes orgânicos, como rodamina ou fluoresceína, ou menos comumente pontos quânticos [5,6,7]. No entanto, devido à baixa estabilidade fotoquímica, fluorescência sensível ao pH ou baixa solubilidade em água de alguns corantes orgânicos e toxicidade dos pontos quânticos, seu uso pode ser comprometido [8]. Neste contexto, os nanoclusters de ouro podem ser considerados fluoróforos ultrapequenos alternativos, carecendo das limitações acima mencionadas. Além disso, AuNCs são caracterizados por um grande deslocamento de Stokes e comprimento de onda de emissão de fluorescência do vermelho visível para a região do infravermelho próximo (IR) que é altamente favorável em bioimagem porque se sobrepõe à janela de transparência do tecido [8,9,10].

A síntese assistida por proteína de nanoclusters de ouro foi relatada pela primeira vez em 2009 usando albumina de soro bovino (BSA) [11] e, desde então, nanoclusters protegidos por proteínas solúveis em água tornaram-se uma tendência emergente em nanociência [9, 12, 13]. Muito menos atenção tem sido dada às glicoproteínas [14] para a preparação de AuNCs e não temos conhecimento de nenhum relatório que descreva a formação de AuNCs a partir de neoglicoproteínas sintéticas como andaimes. Em geral, a glicosilação modula as propriedades físico-químicas das glicoproteínas, por exemplo, dobramento, tempo de vida circulatório ou estabilidade. Também afeta funções biológicas importantes da proteína, como o reconhecimento de receptor-ligante. Assim, a geração de neoglicoproteínas sintéticas a partir de proteínas, pela fixação química de carboidratos cuidadosamente projetados e caracterizados [15], pode dotá-las de novas propriedades funcionais para aplicações biológicas. Como os carboidratos participam de um grande número de diferentes processos biológicos por meio da interação com proteínas de ligação a carboidratos [16, 17], prevemos nanoclusters de ouro de neoglicoproteína como novas sondas para estudar e explorar eventos de reconhecimento de carboidratos in vitro e in vivo [18]. A este respeito, a presença de múltiplas cópias de glicano na superfície da proteína fornece uma apresentação multivalente de carboidratos com o subsequente aumento da afinidade de ligação.

Aqui, exploramos o uso de AuNCs autofluorescentes funcionalizados com neoglicoproteínas como sondas de detecção para lectinas de plantas e como reagentes de direcionamento de receptores de lectina para imagens in vitro de células dendríticas (DCs). Lectinas são proteínas de ligação a carboidratos que auxiliam em diferentes fenômenos de reconhecimento biológico. Em plantas superiores, por exemplo, as lectinas previnem organismos comedores de plantas pelo reconhecimento e aglutinação de glicoproteínas estranhas, inibindo seu crescimento e multiplicação [19]. Em mamíferos DCs, por outro lado, receptores de lectina do tipo C (CLRs) expressos na superfície celular, desempenham um papel importante no reconhecimento de patógenos [20]. Antígenos decorados com glicano são reconhecidos por CLRs específicos, para serem posteriormente endocitados, processados e, eventualmente, apresentados às células T induzindo respostas imunes específicas. Em nosso estudo anterior, mostramos [21] que a funcionalização de um antígeno modelo, ovalbumina (OVA), com um GlcNAc biantenário sintético terminando em N-glicano G0 aumenta o direcionamento para DCs e subsequente captação e apresentação do antígeno. Postulamos que o fenômeno acima mencionado é iniciado pela interação de G0 glicano e receptores endocíticos de lectina tipo C expressos na superfície das DCs. Consequentemente, acreditamos que os nanoclusters de ouro G0-OVA fluorescentes e multivalentes podem se tornar uma alternativa ao G0-OVA marcado com fluorescência aplicado em nosso estudo anterior e podem ser usados como uma nova ferramenta para visualização de DC. Além disso, o direcionamento de DCs mediado por glicano que permite a iniciação de fortes respostas imunes de células T pode ser usado para aumentar a eficácia de vacinas candidatas [22,23,24]. Neste estudo inicial, apresentaremos a síntese de nanoclusters de ouro a partir de neoglicoproteínas e a avaliação da funcionalidade e acessibilidade dos glicanos G0 por meio de experimentos de aglutinação de lectina. Finalmente, iremos demonstrar o potencial de nanoclusters fluorescentes de ouro para imagens de células dendríticas.

Resultados e discussão

Nós otimizamos a síntese de nanoclusters de ouro de ovalbumina decorados com o glicano G0 (G0-OVA-AuNCs) com base em relatórios anteriores que empregam a proteína OVA não conjugada [25, 26]. AuNCs protegidos por proteína foram preparados pela adição de ácido ouro tetracloroáurico (III) (HAuCl ₄ ^. 3H ₂ O) a uma solução de proteína, seguida por solução aquosa 1 M de hidróxido de sódio. Um aumento do pH da reação aumenta o potencial de redução dos resíduos de triptofano e tirosina presentes na OVA (Fig. 1a) [14]. O esqueleto da proteína atua como reagente redutor e estabilizador, aprisionando o pequeno aglomerado de ouro dentro da estrutura da proteína e isolando-o do ambiente. Um protocolo anterior para a síntese de OVA-AuNCs fluorescentes exigia uma solução OVA altamente concentrada (até 65 mg mL ⁻¹ ) [25]. Para limitar o uso de neoglicoconjugados OVA valiosos para a preparação de AuNCs, determinamos a quantidade mínima de OVA não conjugado que poderia produzir OVA-AuNCs com eficiência. Descobrimos que uma concentração de OVA de 15 mg mL ⁻¹ foi suficiente para produzir clusters com forte emissão de fluorescência (Arquivo adicional 1:Figura S1). A formação de OVA-AuNCs foi significativamente acelerada por irradiação de microondas reduzindo o tempo de reação de 18 h para 6 min [25]. Além disso, a irradiação por microondas proporcionou aquecimento homogêneo à solução, favorecendo a formação de aglomerados uniformes e monodispersos [1]. OVA-AuNCs preparados desta maneira exibem uma cor marrom pálida e emitem uma forte fluorescência vermelha sob iluminação de luz ultravioleta (Fig. 1b). O espectro UV-Vis de OVA-AuNCs carece da absorbância correspondente a uma banda de ressonância plasmônica de superfície localizada, sugerindo a ausência de nanopartículas de ouro maiores que 5 nm [27], o que foi posteriormente confirmado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Medimos um diâmetro médio do núcleo de ouro do OVA-AuNCs em um intervalo de 1,9 ± 0,7 nm (arquivo adicional 1:Figura S2). Finalmente, o tamanho hidrodinâmico médio do OVA-AuNC de 8,7 nm ± 2,5 nm foi atribuído por espalhamento de luz dinâmico (arquivo adicional 1:Figura S2). Sua faixa de tamanho semelhante ao OVA (diâmetro de 6,5-7 nm [28]) sugere a presença de uma única molécula de proteína por núcleo de ouro. Uma análise adicional de OVA-AuNCs por eletroforese em gel de agarose mostrou uma mobilidade semelhante para OVA e OVA-AuNCs em direção a um eletrodo positivo que confirma ainda mais o tamanho semelhante para ambas as espécies e sua carga negativa em pH neutro (Fig. 1c). O espectro de emissão de fluorescência de OVA-AuNCs mostra um pico de emissão máximo em λ 670 nm após excitação em 350 nm (Fig. 1d). O espectro de excitação de AuNCs é amplo e o deslocamento de Stokes é grande (acima de 200 nm), o que é ideal para aplicações de detecção multicolorida espectral na presença de outra sonda fluorescente (multiplexação) caracterizada por comprimento de onda de excitação semelhante, como o corante azul emissor Alexa Fluor® 405 [26]. O rendimento quântico (QY) de OVA-AuNCs foi calculado em ≈ 4% quando a fluoresceína em NaOH 0,1 M (QY =≈ 92%) foi usada como padrão de referência [29]. O estado de oxidação do núcleo de ouro foi atribuído a uma mistura de espécies Au (I) e Au (0) com base em medições de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) (Arquivo adicional 1:Figura S3) [11, 30]. O estudo do dicroísmo circular da estrutura secundária da proteína (CD) revelou uma organização de bobina aleatória sugerindo uma perda da dobra nativa para OVA em AuNCs provavelmente devido a condições alcalinas adversas durante a síntese (arquivo adicional 1:Figura S4) [31]. Finalmente, também observamos uma estabilidade extraordinária de OVA-AuNCs dentro de uma ampla faixa de pH (3-11), bem como em uma solução contendo soro fetal bovino (FBS), o suplemento de soro mais comumente usado para cultura de células in vitro (Arquivo adicional 1:Figura S5). Esta característica dos nanoclusters de ouro OVA destaca sua utilidade para bioensaios in vitro e in vivo e abre novas aplicações interessantes. Por exemplo, a emissão de fluorescência insensível ao pH de OVA-AuNCs poderia permitir o rastreamento de partículas eficiente dentro da célula sem perda de sinal, mesmo dentro dos compartimentos endossômicos, caracterizado por pH levemente ácido [32, 33]. Ao contrário, nessas condições, o uso de certos conjugados de fluoresceína pode ser comprometido, pois a emissão máxima de fluorescência desses corantes é alcançada no pH básico. OVA-AuNCs também mostraram uma excelente solubilidade tanto em água quanto em meio de crescimento celular. A solubilização completa de OVA-AuNCs foi observada até a concentração de 40 mg / mL tanto em água quanto em meio de crescimento celular. (Arquivo adicional 1:Figura S6). Os espectros de emissão de fluorescência em diferentes diluições de OVA-AuNCs foram medidos e testados para serem estáveis sob incubação a 37 ° C até 24 h.

a Representação esquemática da síntese de OVA-AuNCs. b Espectros de UV-visível de OVA (linha azul) e OVA-AuNCs (linha laranja). Inserção:imagens de OVA-AuNCs ( a ) e OVA ( b ) sob iluminação de luz visível (esquerda) e sob iluminação de luz ultravioleta (365 nm) (direita). c Eletroforese em gel de agarose de OVA (corado com Coomassie Blue G-250) e OVA-AuNCs (sob iluminação de luz ultravioleta). d Espectros de excitação de fluorescência (linha verde) e emissão (linha rosa) de OVA-AuNCs

Para a síntese de AuNCs protegidas por neoglicoproteína G0-OVA, inicialmente preparamos neoglicoproteínas OVA funcionalizadas com G0. Biantennary N-glicano G0 equipado com um ligante C5 amino foi sintetizado como descrito anteriormente [34] e a conjugação com OVA foi alcançada empregando éster de suberato de disuccinimidila (DSS) como reagente de reticulação (Fig. 2a) [21, 35]. Em resumo, a conjugação é realizada em uma reação de duas etapas:N-glicano G0 é funcionalizado com um excesso de 13 vezes de ligante DSS e, em seguida, acoplado a grupos amino livres em OVA. Ao controlar a razão glicano / proteína, podemos ajustar efetivamente o grau de substituição de OVA (ver SI). A formação bem-sucedida de neoglicoproteínas foi verificada pelo aparecimento de uma banda de migração eletroforeticamente mais lenta difusa no gel SDS-PAGE (Fig. 2b), enquanto o número médio de glicanos introduzidos foi posteriormente determinado por espectrometria de massa MALDI-TOF [21] (Fig. . 2c). Seguindo essa estratégia, produzimos neoglicoconjugados OVA exibindo 2–3, 3–4 e 5–6 cópias de N-glicano G0 por proteína.

a Síntese de neoglicoconjugados G0-OVA ( n =valência). b Eletroforese em gel SDS-PAGE de neoglicoproteínas OVA e G0-OVA contendo diferentes valências de N-glicano G0. c Espectros de massa MALDI-TOF de neoglicoproteínas OVA e G0-OVA contendo diferentes valências de N-glicano G0

Em seguida, empregamos as neoglicoproteínas sintéticas na preparação de AuNCs (Fig. 3a) em condições previamente otimizadas e investigamos o efeito da funcionalização do glicano e sua valência nas propriedades físicas e ópticas dos clusters. Como mostrado na Fig. 3, a absorção de UV-Vis e emissão de fluorescência de G0-OVA-AuNCs foram idênticas a OVA-AuNCs com absorbância característica em 278 nm e emissão de fluorescência vermelha com máximo em torno de 670 nm (Fig. 3b, c).

a Representação esquemática da síntese de OVA-AuNCs derivadas de glicano G0. b Espectros de emissão de fluorescência de G0-OVA-AuNCs (linhas azul, laranja e verde) em comparação com OVA-AuNCs (linha rosa). c Espectros UV-visíveis de G0-OVA-AuNC (linhas azul, laranja e verde) e OVA-AuNC (linha rosa)

Além disso, por medidas de TEM, estabelecemos um diâmetro médio de 1,6 ± 0,5 nm (Fig. 4) para o núcleo G0-OVA-AuNCs, que é comparável ao tamanho dos OVA-AuNCs (1,9 ± 0,7 nm). Assim, com base em nossos resultados, pensamos que os glicanos conjugados com OVA por meio de resíduos de lisina ou do terminal N não afetam o potencial redutor geral das glicoproteínas e posterior formação de clusters nas valências testadas [36]. Além disso, os açúcares parecem não impedir a formação de polímeros de tiolato de Au (I) estabilizadores de cluster [37, 38] entre os grupos de cisteína da proteína e do núcleo de ouro, mesmo quando presentes em um número maior (5-6 cópias).

Imagem TEM de G0-OVA-AuNCs (3/4). Inserção:distribuição de tamanho do diâmetro do núcleo de ouro de G0-OVA-AuNCs (3/4)

Finalmente, da mesma forma que OVA-AuNCs, a estrutura secundária da proteína G0-OVA-AuNCs (3/4) foi atribuída por CD e revelou uma organização de bobina aleatória (Arquivo adicional 1:Figura S4). No entanto, pela ligação de glicanos ao esqueleto de proteína de AuNCs, introduzimos moléculas de direcionamento que permitem a interação com proteínas de ligação a carboidratos e, ao mesmo tempo, uma proteína OVA permanece apenas como um transportador cujas mudanças conformacionais não irão alterar o reconhecimento de lectina do todo sistema. A capacidade antigênica da OVA desnaturada na produção de anticorpos em camundongos [39] e na ativação de células T já foi descrita. A ativação das células T é independente da estrutura secundária do antígeno, pois é mediada pelo reconhecimento de certas sequências de aminoácidos que são apresentadas em OVA nativo e desnaturado [40]. Na verdade, o peptídeo antígeno OVA 323-339 é responsável pela principal resposta específica das células T ao OVA e esse peptídeo tem sido empregado em nanopartículas para induzir respostas imunes [41].

Para investigar a funcionalidade de cadeias de glicano recentemente introduzidas em nanoclusters de ouro protegidos por neoglicoproteínas, examinamos sua interação com diferentes lectinas de plantas em experimentos de aglutinação. Realizamos incubações de G0-OVA-AuNCs e OVA-AuNCs com duas lectinas de plantas diferentes, Bandeiraea simplicifolia lectina-II (BSL-II) específica para frações GlcNAc terminais e Solanum tuberosum lectina (STL), reconhecendo a quitobiose central presente nos N-glicanos [34, 42]. Além disso, e para descartar quaisquer interações não específicas entre G0-OVA-AuNCs e lectinas, Aleuria aurantia lectina (AAL) específica para L-fucose foi incluída como um controle. Adicionamos concentrações crescentes de lectinas BSL-II, STL e AAL a uma solução de G0-OVA-AuNCs (5/6). Após incubação no escuro, as soluções foram centrifugadas e a fluorescência do sobrenadante foi medida. Conforme demonstrado na Fig. 5, pudemos observar uma diminuição na intensidade de fluorescência de uma maneira dependente da concentração após a incubação com BSL-II e STL (Fig. 5a-d), enquanto a intensidade de fluorescência permaneceu inalterada na presença de AAL (Fig. . 5e). Após a incubação de G0-OVA-AuNCs (5/6) com STL, um precipitado visível sob irradiação de lâmpada UV foi observado, enquanto nenhuma precipitação apareceu após a incubação com AAL (Fig. 5f). A relação dos valores iniciais de fluorescência (F0) com os valores finais (F) após a incubação das lectinas foi representada contra o aumento das concentrações de lectinas (Fig. 5b, d). A interação STL com G0-OVA-AuNCs (5/6) mostrou linearidade de 0 a 7,5 μM e o limite de detecção foi calculado com base na equação SD * 3 / S (onde SD é o desvio padrão da curva de calibração e S é o valor da inclinação) [12, 13] como 2,35 μM ( y =1,95 x + 0,4266, R ² =0,97). Da mesma forma, a interação BSL-II com G0-OVA-AuNCs (5/6) mostrou linearidade de 0 a 10 μM e o limite de detecção (LOD) foi calculado em 2,83 μM ( y =0,5687 x + 0,5838, R ² =0,965). Curiosamente, os clusters contendo um número menor de açúcares conjugados como G0-OVA-AuNCs (2/3) (Arquivo adicional 1:Figura S7, AB) não mostraram qualquer mudança significativa na intensidade de fluorescência após a adição de BSL-II e STL, indicando falta de aglutinação. Este comportamento destaca um efeito importante da apresentação multivalente de glicanos na atividade de reticulação das lectinas, mesmo quando apenas pequenas diferenças na densidade de glicano são aplicadas. É importante ressaltar que nenhuma mudança na intensidade de emissão de fluorescência de OVA-AuNCs não conjugados incubados com lectinas foi observada (Arquivo adicional 1:Figura S7, C-D). Embora o OVA de frango nativo contenha um único local de glicosilação ligado a N (Asn-292), predominantemente substituído por alta manose ou híbrido menos abundante e N-glicanos do tipo complexo [43], esta modificação de açúcar não é reconhecida nem por STL nem por BSL-II , provavelmente devido à apresentação monovalente. Isso confirmou a presença de uma interação carboidrato-lectina específica entre G0 quimicamente introduzido em G0-OVA-AuNCs e STL / BSL-II e descartou a ligação não específica de OVA-AuNCs às lectinas. Prevemos uma possível aplicação deste sistema para a detecção de biomarcadores de proteínas de ligação a carboidratos. No entanto, a preparação de neoglicoproteínas exibindo um alto número de cópias de glicano aumentaria a avidez da construção em direção à lectina desejada, melhorando o limite de detecção [44].

Ensaios de aglutinação de lectina de G0-OVA-AuNCs (5/6). a Espectros de fluorescência representativos dos sobrenadantes de soluções OVA-G0 (5/6) -AuNCs após incubação com BSL-II. b Representação de F0 / F contra concentrações crescentes de BSL-II. c Espectros de fluorescência representativos dos sobrenadantes de soluções OVA-G0 (5/6) -AuNCs após incubação com STL. d Representação de F0 / F contra concentrações crescentes de STL. e Espectros de fluorescência representativos dos sobrenadantes de OVA-G0 (5/6) -AuNCs após incubação com AAL. f Imagem correspondente à incubação de G0-OVA-AuNCs (5/6) com AAL e STL, sob iluminação de luz ultravioleta (365 nm). Após incubação com STL, formou-se um precipitado visível. No lado direito:ilustração esquemática da ligação entre G0-OVA-AuNCs e lectina vegetal

Também estudamos a interação de G0-OVA-AuNCs (5/6) com STL na presença de meio de crescimento celular para discriminar o possível efeito dos componentes da mídia nas interações de proteínas de carboidratos. G0-OVA-AuNCs (5/6) foram dissolvidos em meio de Dulbecco modificado de Iscove completo (IMDM) suplementado com soro fetal de bezerro e incubado com quantidades crescentes de STL; as soluções resultantes foram analisadas por eletroforese em gel de agarose. (Arquivo adicional 1:Figura S8). A mobilidade eletroforética de G0-OVA-AuNCs (5/6) é mantida tanto em água quanto em meio complexo. No entanto, na presença de quantidades crescentes de STL, houve um deslocamento dependente da dose de G0-OVA-AuNCs (5/6) para o pólo negativo destacando a interação proteína carboidrato mesmo na presença de meios celulares complexos. Isso indica que as interações de proteína e carboidrato com G0-OVA-AuNCs (5/6) não são impedidas pela presença de componentes de mídia.

O potencial dos clusters para imagens de fluorescência e sucesso anterior com DCs direcionados por neoglicoproteínas G0-OVA [21] nos encorajou a estudar G0-OVA-AuNCs na captação por DCs murinos in vitro. Empregamos microscopia de fluorescência confocal para visualizar a internalização de auto-fluorescentes G0-OVA-AuNCs (3/4). As DCs esplênicas foram isoladas de camundongos C57BL / 6J e CD11c ⁺ a população foi purificada por classificação de células ativadas magneticamente (MACS) (arquivo adicional 1:Figura S9) e semeada em lamínulas de vidro revestidas com poli-d-lisina durante a noite. Como prova de conceito, as DCs purificadas foram incubadas com G0-OVA-AuNCs (3/4), lavadas para remover os materiais não ligados e fixadas. Após 40 min de incubação, imagens de microscopia de fluorescência confocal foram adquiridas (Fig. 6) e observamos forte fluorescência para células dendríticas incubadas com G0-OVA-AuNCs (3/4) demonstrando sua internalização efetiva (Fig. 6a) e falta de fluorescência no controle negativo (CD11 não estimulado ⁺ células; Arquivo adicional 1:Figura S9). A internalização de nanoclusters foi posteriormente confirmada pelo empilhamento de imagens DC únicas tiradas ao longo de seu Z -eixo (z-stack) e por reconstrução de uma imagem 3D de um único DC para visualizar a emissão de fluorescência proveniente de dentro da célula (Fig. 6b e arquivo adicional 1:Figura S10).

Captação de G0-OVA-AuNCs (3/4) por DCs murinas medida por microscopia confocal. a Imagens representativas de CD11c ⁺ células após incubação com G0-OVA-AuNCs (3/4). b Imagem Z-stack de uma única célula dendrítica representando a captação de G0-OVA-AuNCs dentro da célula

Em resumo, preparamos e caracterizamos nanoclusters de ouro protegidos por neoglicoproteínas que foram empregados em experimentos de aglutinação e em ensaio de captação de DCs. No exemplo de detecção de lectina de planta específica, demonstramos a utilidade de G0-OVA-AuNCs para a análise de interações carboidrato-proteína. Também mostramos imagens in vitro de células dendríticas por microscopia de fluorescência. No entanto, outros experimentos devem ser realizados para primeiro compreender melhor o papel do glicano na absorção de nanoclusters por DCs (por exemplo, seguindo a localização de nanoclusters nos compartimentos celulares) e, em segundo lugar, para estudar sua bio e citocompatibilidade. Com base em nossos resultados anteriores que descrevem propriedades de direcionamento de G0 glicano e aumento na captação de G0-OVA por DCs em comparação com OVA não conjugado, acreditamos que G0-OVA-AuNCs poderia se tornar uma alternativa atraente para neoglicoproteínas marcadas com fluorescência.

Conclusões

Em conclusão, neste estudo inicial, apresentamos a primeira síntese de nanoaglomerados de ouro protegidos por neoglicoproteínas e avaliação de suas propriedades físicas e ópticas em comparação com aglomerados de proteínas não conjugadas. Confirmamos a acessibilidade do açúcar G0 em AuNCs em ensaios de aglutinação por interações específicas com lectinas de plantas, o que destacou adicionalmente a importância de uma densidade mínima de glicano para a atividade de reticulação eficaz das lectinas. Como prova de conceito, também demonstramos a adequação de G0-OVA-AuNCs na geração de imagens de modelos de DCs murinos.

Acreditamos que AuNCs autofluorescentes funcionalizados com neoglicoproteínas podem se tornar ferramentas atraentes que permitem a análise e aplicações de interações carboidratos-proteínas. Com base em suas propriedades físicas e químicas únicas, como grandes deslocamentos de Stokes, solubilidade em água ou estabilidade de pH, G0-OVA-AuNCs poderia se tornar uma alternativa para marcadores de corante orgânico e ser usado para visualização de DCs, estudos de absorção mediada por carboidratos e planta detecção de lectina. Finalmente, ao empregar um transportador imunogênico como OVA para a fixação de glicanos, os nanoclusters de ouro funcionalizados com neoglicoproteínas não só podem permitir estudos aprofundados de captação, processamento e apresentação de antígenos, mas também no futuro, podem encontrar uma aplicação como terapêutica fluorescente ou moléculas adjuvantes.

Métodos / Experimental

Materiais

Todas as soluções foram preparadas em água nanopura (18 MΩ cm) de um sistema de purificação de água Diamond UV (Branstead International, IA, Madrid, Espanha). Todos os utensílios de vidro empregados na preparação de AuNCs foram previamente lavados com solução de água régia (HNO ₃ :HCl, 1:3, v / v ) e enxaguado extensivamente com água nanopura. Cloreto de ouro (III) tri-hidratado, hidróxido de sódio e trietilamina foram adquiridos à Sigma Aldrich. A ovalbumina sem LPS foi adquirida na Hyglos (Bernried, Alemanha). Suberato de disuccinimidila (DSS) e DMSO foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific. O N-glicano G0 foi sintetizado quimicamente conforme descrito anteriormente [21].

Síntese de AuNCs. Procedimento Geral

Para uma solução agitada de OVA ou neoglicoproteína (15 mg mL ⁻¹ ) em água nanopura, uma solução aquosa 0,1 M de HAuCl ₄ · 3H ₂ O (4,2 mM, concentração final) foi adicionado gota a gota. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 5 min e solução aquosa de NaOH 1 M (concentração final 150 mM) foi adicionada gota a gota para aumentar o pH da mistura. As soluções resultantes foram incubadas a 100 ° C por 6 min em reator de micro-ondas Biotage® Initiator. A diálise de AuNCs foi realizada em cassetes de diálise Slide-Z-lyser TM (10 K MWCO) da Thermo Fisher Scientific sobre água nanopura.

Os espectros de emissão de fluorescência de OVA sintetizado e AuNCs protegidos por neoglicoproteína foram medidos usando placas Nunc ™ 96-Well Polystyrene Black, no leitor de microplaca Flash Varioskan (Thermo Scientific) com comprimento de onda de excitação em λ 350 nm operando com um software ScanIt.

Eletroforese em gel de agarose de OVA-AuNCs e proteína OVA foi realizada em gel de agarose 0,75% a 80 V por 30 min. A visualização de AuNCs protegidas por OVA foi realizada sob irradiação de luz UV (365 nm) e a proteína OVA foi corada com Coomassie Blue G-250.

A geração de imagens TEM foi conduzida em um TEM de emissão de campo JOEL JEM-2100F com uma tensão de aceleração de 200 kV. As soluções de AuNCs foram fundidas por gota em grades TEM de cobre revestidas com suporte de carbono ultrafino (Ted Pella, Redding, EUA). O diâmetro médio do nanocluster de ouro foi quantificado usando ImageJ (Java).

Incubação de G0-OVA-AuNCs (5/6) com lectinas vegetais

Dez microlitros de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg mL ⁻¹ ] em tampão TSM (20 mM Tris · HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl ₂ , 2 mM MgCl ₂ , pH =7,4) foram colocados em placa preta de poliestireno de 384 poços Nunc ™. Posteriormente, 10 μL de Aleuria aurantia lectina (AAL), Solanum tuberosum lectina (STL) e Bandeiraea simplicifolia lectina-II (BSL-II) em tampão TSM foram adicionadas resultando em concentrações finais de proteína de 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μM. As soluções correspondentes foram incubadas durante a noite no escuro sob agitação suave. As soluções de proteína foram centrifugadas a 11.000 g por 1 h e os espectros de emissão de fluorescência dos sobrenadantes foram registrados com um leitor de microplacas Varioskan Flash (Thermo Scientific) com comprimento de onda de excitação em λ 350 nm. Para observar a precipitação após a formação de complexos AuNCs-lectina, um experimento de controle foi realizado. Então, 10 μL de G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg mL ⁻¹ ] foi incubado por 1 h com 10 μL de AAL e STL [40 μM], seguido por centrifugação a 11.000 g (1 h). As imagens foram tiradas sob irradiação de luz ultravioleta (365 nm).

Isolamento de células dendríticas do baço de camundongo

As células dendríticas murinas usadas em todos os experimentos foram isoladas de camundongos C57BL / 6J criados por Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastian, Espanha). Os protocolos de experimentação animal foram aprovados pelo comitê de ética animal do CIC biomaGUNE e foram conduzidos de acordo com as diretrizes e diretrizes ARRIVE da União Européia sobre ética e bem-estar animal. Os camundongos foram mantidos em condições de alojamento convencionais (22 ± 2 ° C, 55 ± 10% de umidade e ciclo dia / noite de 12 h) e alimentados com uma dieta padrão ad libitum . Os camundongos foram anestesiados com 2,5% de isoflurano em 100% O ₂ e sacrificados por luxação cervical.

Os baços foram obtidos de camundongos C57BL / 6J ( n =3, mulher, 27-28 semanas de idade). Para isolar os esplenócitos, os baços foram lavados com meio de Dulbecco modificado da Iscove (IMDM) suplementado com 2 mM de l-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 10% de soro fetal de bezerro (FCS; PAN Biotech). A suspensão de células foi mantida fria e filtrada por meio de um filtro de células de 40 μm para remover os agregados celulares. Após centrifugação (300 g, 5 min, 4 ° C), os pellets celulares foram ressuspensos em 5 mL de tampão de lise de eritrócitos preparado de fresco (10% Tris 100 mM pH 7,5 + 90% NH 160 mM ₄ Cl), misturado suavemente e incubado à temperatura ambiente por 2 min. As células foram lavadas duas vezes em meio IMDM completo e centrifugadas antes da ressuspensão em tampão MACS (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA). Células dendríticas (CD11c ⁺ células) foram isoladas a partir de uma suspensão de células de baço C57BL / 6 murinas por classificação de células ativadas magneticamente usando CD11c ⁺ MicroBeads (Miltenyi). As células incubadas com microesferas magnéticas foram carregadas em uma coluna MACS colocada em um campo magnético. As células não ligadas passaram pela coluna, enquanto permaneceram CD11c ⁺ as células foram lavadas com tampão MACS e eluídas da coluna. Para aumentar a pureza DC, o CD11c ⁺ a purificação das células foi repetida. A suspensão de células foi centrifugada, ressuspensa em meio completo IMDM e contada.

Absorção de G0-OVA-AuNCs (3/4) por DCs

CD11c ⁺ células de camundongos C57BL / 6J (2 × 10 ⁶ cells) were seeded on poly-d-lysine-coated glass cover-slips overnight. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL⁻¹ ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.

Abreviações

AAL:: Aleuria aurantia lectin
AuNCs:: Gold nanoclusters
BSA:: Bovine serum albumin
BSL-II:: Bandeiraea simplicifolia lectin-II
CD:: Circular dichroism
CLRs:: C-type lectin receptors
DCs:: Dendritic cells
DMSO:: Dimethyl sulfoxide
DSS:: Disuccinimidyl suberate ester
FBS:: Soro fetal bovino
G0:: Biantennary N-glycan
G0-OVA-AuNCs:: Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters
HAuCl₄ ^. ₃ H ₂ O:: Gold tetrachloroauric (III) acid
IMDM:: Iscove’s modified Dulbecco’s medium
IR:: Infravermelho
LOD:: Limit of detection
MACS:: Magnetic-activated cell separation
OVA:: Ovalbumin
QY:: Quantum yield
STL:: Solanum tuberosum lectin
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
XPS:: espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

Estruturas de micro / nano rugas altamente elásticas para aplicação invisível por infravermelho Óxido de grafeno covalentemente modificado e polímero de microporosidade intrínseca (PIM-1) em membranas compostas de película fina de matriz mista

Nanomateriais

Materiais Poliméricos

biológico

Corante

Especiarias