Nanoclusters de Ouro Fluorescentes Funcionalizados com Neoglicoproteína para Detecção de Lectinas Vegetais e Imagem de Células Dendríticas

Resumo

Interações carboidrato-proteína sustentam processos biológicos essenciais como fertilização, transdução de sinal e comunicação hospedeiro-patógeno. A natureza intrincada do reconhecimento de glicanos demanda ferramentas analíticas avançadas. Aqui relatamos a primeira síntese de nanoclusters de ouro fluorescentes funcionalizados com neoglicoproteína (G0-OVA-AuNCs) que combinam um glicano N biantennário (G0) como ligante de direcionamento, ovalbumina como proteína carreadora e um núcleo de ouro auto-emissivo. Demonstramos que G0-OVA-AuNCs servem como sensores seletivos para lectinas vegetais e como sondas de imagem potentes para células dendríticas murinas.

Introdução

Nanoclusters de ouro (AuNCs), compreendendo 10–100 átomos de ouro, exibem fluorescência dependente do tamanho que os torna atraentes para bio-sensoriamento e imagem. Diferentemente de corantes orgânicos convencionais ou pontos quânticos, AuNCs possuem grande deslocamento de Stokes, emissão vermelho-próximo-IR e estabilidade fotoquímica superior, permitindo aplicações na janela de transparência tecidual. AuNCs templados por proteína foram relatados pela primeira vez com albumina sérica bovina em 2009 e desde então se tornaram uma plataforma versátil para projetar fluoróforos biocompatíveis e solúveis em água. Proteínas glicosiladas, no entanto, permanecem inexploradas como andaimes de nanoclusters, apesar do papel crítico dos glicanos na modulação do dobramento, estabilidade e ligação a receptores de proteínas. Neoglicoproteínas sintéticas — proteínas quimicamente conjugadas com carboidratos definidos — oferecem uma estratégia para conferir às proteínas novas propriedades funcionais enquanto preservam sua integridade estrutural.

Neste estudo, aproveitamos um glicano G0 biantennário sintético, conjugado à ovalbumina (OVA) via ligante amino C5 e disuccinimidil suberato, para gerar G0-OVA-AuNCs. Investigamos suas características físico-químicas, avaliamos a acessibilidade do glicano através de ensaios de aglutinação de lectinas, e avaliamos sua capacidade de marcar células dendríticas (DCs) in vitro. Os resultados estabelecem G0-OVA-AuNCs como sensores robustos e multivalentes de lectinas e agentes de imagem potentes para células imunes.

Resultados e Discussão

Otimizamos a síntese de G0-OVA-AuNCs adaptando um protocolo para OVA-AuNCs não conjugados. Uma solução de OVA a 15 mg mL⁻¹ foi misturada com HAuCl₄·3H₂O (4,2 mM) e NaOH (150 mM) sob irradiação de micro-ondas (100 °C, 6 min), produzindo clusters marrom-claros que emitem fluorescência vermelha brilhante a 670 nm sob excitação a 350 nm. Espectros UV-Vis não apresentam banda de ressonância plasmônica, confirmando tamanhos de partícula abaixo de 5 nm; MET revelou diâmetro médio do núcleo de 1,9 ± 0,7 nm, e espalhamento dinâmico de luz mostrou diâmetro hidrodinâmico de 8,7 ± 2,5 nm, consistente com uma única proteína encapsulando o núcleo. Os clusters exibiram rendimento quântico de ~4% e permaneceram fotoestáveis entre pH 3–11 e em soro fetal bovino, indicando adequação para ensaios biológicos.

Para clusters funcionalizados com G0, glicanos G0 foram conjugados à OVA usando DSS, produzindo neoglicoproteínas com 2–3, 3–4 ou 5–6 glicanos por proteína (verificado por SDS-PAGE e MALDI-TOF). Subsequente formação de AuNCs sob condições idênticas produziu G0-OVA-AuNCs cujas propriedades ópticas corresponderam às de OVA-AuNCs: absorbância a 278 nm e pico de emissão a 670 nm. MET confirmou diâmetro do núcleo de 1,6 ± 0,5 nm. Espectros CD indicaram estrutura secundária de bobina aleatória, provavelmente devido à síntese alcalina, ainda que os grupos glicanos permanecessem acessíveis para ligação a lectinas.

Ensaios de aglutinação de lectinas com lectina-II de Bandeiraea simplicifolia (BSL-II) e lectina de Solanum tuberosum (STL) revelaram quenching de fluorescência dependente de concentração para G0-OVA-AuNCs (5/6), enquanto uma lectina controle (Aleuria aurantia, AAL) não produziu efeito. O quenching seguiu curvas de calibração lineares, resultando em limites de detecção de 2,83 µM (BSL-II) e 2,35 µM (STL). G0-OVA-AuNCs com menos glicanos (2/3) não aglutinou, sublinhando a necessidade de apresentação multivalente de glicano. Eletroforese em gel de agarose em meios de cultura celular confirmou que a ligação a lectinas permaneceu eficiente em ambientes biológicos complexos.

Microscopia confocal de DCs esplênicos murinos (CD11c⁺) incubados com G0-OVA-AuNCs (3/4) demonstrou internalização rápida dentro de 40 min, com fluorescência localizada intracelularmente e ausente em controles não tratados. Reconstruções 3-D confirmaram distribuição intracelular dos clusters.

Em resumo, apresentamos os primeiros AuNCs protegidos por neoglicoproteína, demonstramos seu reconhecimento seletivo de lectinas via glicanos multivalentes, e estabelecemos sua capacidade de imaginar células dendríticas. Sua fluorescência robusta, solubilidade aquosa e estabilidade de pH os tornam alternativas promissoras a corantes convencionais para estudos de interações carboidrato-proteína e imagem imunológica.

Conclusões

Sintetizamos e caracterizamos com sucesso G0-OVA-AuNCs, confirmando acessibilidade do glicano e aglutinação específica de lectina. A exibição multivalente de glicano foi essencial para entrelaçamento eficiente, enquanto os clusters mantiveram alta fotoestabilidade e solubilidade aquosa. Imagem in vitro de células dendríticas murinas validou os clusters como sondas potentes, auto-fluorescentes. Estes achados suportam exploração adicional de AuNCs funcionalizados com neoglicoproteína como ferramentas versáteis para ensaios de interação carboidrato-proteína, imagem de células imunes e potenciais aplicações terapêuticas.

Métodos/Experimental

Materiais

Todas as soluções foram preparadas em água ultrapura (18 MΩ cm). Cloreto de ouro (III) tri-hidratado, NaOH e trietilamina foram da Sigma-Aldrich. Ovalbumina foi comprada da Hyglos. DSS e DMSO foram da Thermo Fisher. Glicano G0 foi sintetizado como descrito previamente.

Síntese de AuNCs. Procedimento Geral

Proteína a 15 mg mL⁻¹ em água ultrapura foi misturada com 4,2 mM HAuCl₄·3H₂O, agitada 5 min, então 150 mM NaOH foi adicionado. A mistura foi aquecida a 100 °C por 6 min em reator de micro-ondas. Clusters foram dialisados (MWCO 10 kDa) contra água ultrapura. Fluorescência foi registrada em leitor de placas Varioskan Flash (λₑₓ=350 nm). Gel de agarose (0,75%) e MET (200 kV) foram usados para caracterização de tamanho. CD avaliou estrutura secundária. XPS determinou estados de oxidação do ouro.

Ensaio de Aglutinação de Lectina

G0-OVA-AuNCs (0,2 mg mL⁻¹) foram misturados com lectinas (AAL, STL, BSL-II) a 0–10 µM em buffer TSM. Após incubação overnight, amostras foram centrifugadas e fluorescência do sobrenadante medida. Precipitação foi observada sob UV para STL.

Isolamento de DCs Esplênicos de Camundongo

Bazos de camundongos C57BL/6J foram processados para suspensões de célula única. Células CD11c⁺ foram isoladas por separação magnética ativada por célula (Miltenyi) e cultivadas em lamínulas revestidas com poli-D-lisina.

Captação de G0-OVA-AuNCs por DCs

DCs (2 × 10⁶ células) foram incubadas com 150 µg mL⁻¹ G0-OVA-AuNCs (3/4) por 40 min a 37 °C, lavadas, fixadas com 3% PFA, e imageadas em microscópio confocal Zeiss LSM 510 (laser 365 nm, objetiva 63× óleo).

Abreviações

AAL:

Lectina de Aleuria aurantia

AuNCs:

Nanoclusters de ouro

BSA:

Albumina sérica bovina

BSL-II:

Lectina-II de Bandeiraea simplicifolia

CD:

Dicroísmo circular

CLRs:

Receptores do tipo lectina C

DCs:

Células dendríticas

DMSO:

Dimetil sulfóxido

DSS:

Éster disuccinimidil suberato

FBS:

Soro fetal bovino

G0:

Glicano N biantennário

G0-OVA-AuNCs:

Nanoclusters de ouro funcionalizados com neoglicoproteína

HAuCl₄·3H₂O:

Ácido tetracloroáurico (III)

IMDM:

Meio modificado de Dulbecco por Iscove

IR:

Infravermelho

LOD:

Limite de detecção

MACS:

Separação magnética ativada por célula

OVA:

Ovalbumina

QY:

Rendimento quântico

STL:

Lectina de Solanum tuberosum

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons por raios-X