Efeito antitumoral de nanopartículas de sílica mesoporosa direcionadas a anti-VEGFR2 marcadas com 131I em câncer anaplásico de tireoide

Resumo

O câncer anaplásico de tireoide (ATC) compreende aproximadamente 2% de todos os cânceres de tireoide e sua taxa de sobrevida média permanece baixa devido à sua resistência à terapia convencional. As nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com terapêutica do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) representam um grande avanço para a angiogênese e inibição em cânceres letais. No presente estudo, nosso objetivo foi avaliar se ¹³¹ Nanopartículas de sílica mesoporosa direcionadas a anti-VEGFR2 marcadas com I teriam eficácia antitumoral em um modelo de camundongo nu portador de tumor ATC. Usando estudos in vitro e in vivo, investigamos o aumento da capacidade de direcionamento e do tempo de retenção no grupo-alvo anti-VEGFR2 usando microscopia confocal e um contador γ. A radioatividade do tecido tumoral do grupo anti-VEGFR2 direcionado 24 e 72 h após a injeção intratumoral foi significativamente maior do que a dos grupos não direcionados (todos P <0,05). Além disso, descobrimos que o acúmulo radioativo era óbvio mesmo em 3 semanas após a injeção no grupo alvo de anti-VEGFR2 por meio de tomografia computadorizada / tomografia computadorizada de emissão de fóton único, que não foi observada 3 dias após a injeção no Na ¹³¹ Eu grupo. Enquanto isso, em comparação com o grupo não-alvo, o crescimento do tumor no grupo-alvo foi significativamente inibido, sem causar efeitos tóxicos sistêmicos aparentes. Além disso, o tempo médio de sobrevivência no grupo-alvo (41 dias) foi significativamente prolongado em comparação com o não-direcionado (34 dias) ou Na ¹³¹ I (25 dias) grupos (ambos P < 0,01). Nossos dados apóiam a visão de que o desenvolvimento ¹³¹ Nanopartículas de sílica mesoporosa direcionadas a anti-VEGFR2 marcadas com I mostraram resultados promissores em modelo de camundongo com tumor ATC e tal abordagem pode representar uma nova opção terapêutica para ATC.

Histórico

O câncer anaplásico da tireoide (ATC) representa apenas 2% de todos os cânceres da tireoide; no entanto, é um tipo de tumor localmente agressivo que apresenta uma alta taxa de metástases à distância. Geralmente, a sobrevida média de pacientes com ATC é de cerca de 6 meses, com apenas 20% dos pacientes sobrevivendo 1 ano após o diagnóstico por causa de catástrofe vascular e colapso das vias aéreas causado por doença regional agressiva invadindo tecidos cervicais e linfonodos e / ou metástases pulmonares [1 , 2]. Radioiodine-131 (¹³¹ I) desempenha um papel importante no diagnóstico e tratamento das metástases do câncer diferenciado da tireoide (CDT) [3,4,5]. No entanto, o convencional ¹³¹ A modalidade de tratamento I não é apropriada para ATC devido à sua característica de não concentração de iodo [6].

A angiogênese é um fator importante que contribui para a sobrevivência, crescimento, migração e metástase das células cancerosas. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma citocina reguladora crucial na angiogênese e desempenha um papel importante no desenvolvimento de ATC. O papel bem estabelecido do VEGF na angiogênese significa que ligantes radiomarcados, como o bevacizumabe, que tem como alvo o receptor do VEGF (VEGFR), foram desenvolvidos com sucesso para a detecção precoce e sensível de lesões usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) e tomografia computadorizada por emissão de fóton único ( SPECT) técnicas de imagem. O VEGFR-2 exerce a maioria das funções do VEGF nas células endoteliais dos vasos sanguíneos e é responsável pela proliferação através da ativação da via da proteína quinase ativada por mitogênio, migração dos vasos endoteliais e promoção da angiogênese e crescimento vascular [7, 8 ] A expressão de VEGF é regulada positivamente em células ATC de origem epitelial em comparação com a do tecido tireoidiano normal [9,10,11]. Estratégias anti-VEGF foram desenvolvidas para inibir o crescimento de novos vasos sanguíneos e privar os tumores do oxigênio e nutrientes necessários. Vários estudos pré-clínicos desenvolveram drogas que têm como alvo o VEGFR2 no ATC com diferentes graus de sucesso [12,13,14,15]. No entanto, um dos principais desafios relacionados a essas drogas anticâncer é sua baixa biodisponibilidade e entrega ineficiente ao local alvo. Muitos medicamentos anticâncer são hidrofóbicos e precisam de sistemas de entrega de medicamentos biocompatíveis para melhorar sua biodisponibilidade e facilitar a administração intravenosa.

Nanopartículas, incluindo nanopartículas à base de metal, polímero e lipídios, podem ser usadas para combinar um agente terapêutico com um agente de imagem. Ligantes / frações de direcionamento, tais como peptídeos, anticorpos, radionuclídeos ou fragmentos de anticorpos, podem ser ligados a nanopartículas para melhorar sua eficácia terapêutica. Para o tratamento do câncer, as nanopartículas podem se acumular na área do tumor por meio de uma permeabilidade aprimorada e efeito de retenção, com uma capacidade de entregar agentes terapêuticos de uma forma mais localizada. Por muitos anos, nas ciências dos materiais e na engenharia, a sílica tem sido considerada um material versátil e relativamente seguro devido à variedade de modificações físicas e químicas disponíveis que oferece, bem como sua boa biocompatibilidade [16]. A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA reconhece a sílica como "Geralmente Segura" [17, 18]. Entre os vários materiais à base de sílica, as nanopartículas de sílica mesoporosa (MSNs) se destacam como uma classe de nanomateriais com muitas vantagens distintas, como sua natureza atóxica, boa permeabilidade de superfície, alta área de superfície, estruturas de poros ajustáveis, excelente estabilidade físico-química, e superfícies quimicamente modificáveis, todas as quais as tornam hospedeiras potenciais para vários agentes químicos e / ou drogas terapêuticas [19]. Da mesma forma, nanomateriais de carbono mesoporoso demonstraram ser excelentes nanocarreadores na entrega de drogas [20,21,22]. Nos últimos anos, os esforços na área de MSNs têm se concentrado na combinação de recursos terapêuticos e de imagem. A marcação de nanopartículas com sondas de imagem é uma ferramenta valiosa para permitir seu rastreamento in vitro e in vivo. Atualmente, as modalidades de tratamento direcionadas representam uma estratégia encorajadora para o tratamento com ATC [23, 24].

Inspirado pelo papel central da terapia direcionada e imagem molecular contra VEGFR na pesquisa do câncer e as vantagens oferecidas pelos MSNs, neste estudo, desenvolvemos uma nanoplataforma anti-VEGFR2 direcionada potencialmente teranóstica com base na engenharia de superfície de MSNs para imagens SPECT não invasivas simultâneas e um aprimorado in vivo ¹³¹ I efeito terapêutico. Nosso objetivo foi determinar se ¹³¹ Os MSNs direcionados a anti-VEGFR2 marcados com I teriam eficácia antitumoral em um modelo de camundongo nu portador de tumor ATC, seguido por extensos estudos in vivo, in vitro e ex vivo.

Materiais e métodos

Materiais

Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 0,25% de Tripsina-EDTA e soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Gibco (CA, EUA). Os antibióticos (penicilina G, estreptomicina e nistatina) foram adquiridos na Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Pequim, China). Brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB), tetraetilortosilicato (TEOS), 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES), dimetilsulfóxido (DMSO), 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida cloridrato (EDC), N -hidroxissuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram adquiridos na Sigma-Aldrich (Alemanha). Na ¹³¹ Fui comprado da Atomic Hitech (Pequim, China). Os anticorpos anti-VEGFR2 foram adquiridos da Abcam Co. Ltd. (UK).

Caracterizações

As nanopartículas foram dispersas em etanol, formando uma suspensão, depositadas em uma grade de cobre revestida com carbono e secas por pelo menos 24 horas. A morfologia das nanopartículas foi determinada usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (JEOL-100CXII, Japão) em uma tensão de aceleração de 200 kV. Os potenciais zeta e diâmetros hidrodinâmicos das amostras foram medidos usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando um Zetasizer (Nano ZS90, UK). As distribuições de tamanho de poro e áreas de superfície de MSNs foram caracterizadas por análises de Brunauer – Emmett – Teller (BET) e Barrett – Joyner – Halenda (BJH) (ASAP2020M, EUA).

Cultura de células

A linha celular humana ATC FRO [25] (adquirida no Cell Resource Center, Instituto de Ciências Médicas Básicas, Peking Union Beijing Medical College em Pequim, República Popular da China) foi cultivada a 37 ° C em uma incubadora umidificada com uma mistura de 5% CO ₂ e 95% de ar e suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. O meio foi substituído a cada dois dias, e as células foram passadas por tripsina após a confluência ter sido atingida. As células foram pré-cultivadas até que aproximadamente 80% de confluência fosse alcançada antes de cada experimento.

Preparação e modificação da superfície de nanopartículas de sílica

Síntese de MSNs e aminação

Os MSNs foram sintetizados conforme relatado anteriormente [26]. Resumidamente, 50 mg de CTAB foram adicionados a uma mistura de 25 mL de água, 5 mL de etanol e 100 μL de solução de NaOH 2 M em um frasco de fundo redondo sob agitação contínua a 70 ° C. Em seguida, 200 μL de TEOS foram adicionados à mistura e reagiram por 1 h. A solução de reação foi então centrifugada e lavada com etanol cinco vezes a 10.000 rpm. Em seguida, os produtos foram ressuspensos em 10 mL de etanol. Após a remoção do modelo CTAB, o produto foi então ressuspenso em 5 mL de DMSO e 100 μL de APTES, que foi adicionado gota a gota à mistura resultante para modificar a superfície de sílica por aminação. Após agitação durante a noite, os precipitados foram separados por centrifugação, lavados com etanol cinco vezes e, em seguida, o MSNs-NH ₂ foram obtidos.

Síntese de BSA-MSNs-Anti-VEGFR2

Cinco miligramas de albumina sérica bovina (BSA) e 50 μL de anticorpos anti-VEGFR2 foram adicionados ao produto acima (MSNs-NH ₂ , 50 mg) e reagiu sob agitação durante 2 h. A mistura foi lavada com água cinco vezes, após o que 1,1 mg de NHS e 1,6 mg de EDC foram adicionados à mistura e agitados durante a noite à temperatura ambiente em 5 mL de água. Os precipitados foram separados por centrifugação, lavados cinco vezes com água, obtendo-se com sucesso o BSA-MSNs-anti-VEGFR2.

¹³¹ I Marcação radioativa de nanopartículas

As nanopartículas produzidas foram radiomarcadas com ¹³¹ I usando o método Chloramine-T (denotado como ¹³¹ I-BSA-MSNs e ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, respectivamente) [27]. Resumidamente, aproximadamente 100 μg de BSA-MSNs ou BSA-MSNs-anti-VEGFR2 foram diluídos com 100 μL de tampão de fosfato (PB) e 74 MBq ¹³¹ Eu fui adicionado. Em seguida, Cloramina-T (100 μL; 5 mg / mL em PB) foi adicionada à mistura. Após 60 s de agitação e incubação, a reação foi interrompida pela adição de 100 μL de metabissulfito de sódio (5 mg / mL em PB). O tubo de centrifugação foi usado para separar BSA-MSNs e BSA-MSNs-anti-VEGFR2 marcados de compostos de baixo peso molecular. A taxa de marcação e a pureza radioquímica de ¹³¹ Nanopartículas marcadas foram determinadas usando cromatografia em camada fina.

Captação celular in vitro:estudo de microscopia confocal

Primeiramente, os MSNs-anti-VEGFR2 e MSNs foram rotulados com FITC [28]. Resumidamente, MSNs-NH ₂ (100 mg) foram adicionados a 1 mL de solução de álcool FITC (1 mg / mL), com repouso por 4 h sob agitação. MSNs marcados com FITC (FITC-MSNs) foram obtidos por centrifugação e secos em vácuo. O FITC-MSNs-anti-VEGFR2 também pode ser obtido usando o mesmo método.

As células FRO foram semeadas em placas de 6 poços durante a noite e, em seguida, 5 × 10 ⁵ células por poço foram incubadas com FITC-MSNs e FITC-MSNs-anti-VEGFR2 por 1 e 6 h a 37 ° C, respectivamente. As células foram lavadas três vezes com solução salina tampão de fosfato (PBS) e depois fixadas com etanol a 70% durante 20 min. Além disso, as células foram lavadas três vezes com PBS e os núcleos foram corados por 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 45 min e então fixados com paraformaldeído (4% em PBS). Imagens de microscopia confocal foram adquiridas usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) (Zeiss LSM 510, EUA).

Captação celular dependente do tempo

Para medir a captação celular dependente do tempo de iodo-131 das nanopartículas, 1 × 10 ⁵ células por poço foram cultivadas com 3,7 MBq / mL de Na ¹³¹ livre I, ¹³¹ I-BSA-MSNs ou ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, respectivamente. As células foram então lavadas o mais rápido possível com 1 mL de solução tampão de solução salina balanceada (HBSS) de Hanks, destacadas com tripsina e ressuspensas em 1 mL de HBSS por 1, 2, 3, 5, 7 e 9 h. A radioatividade foi medida usando um contador γ (LKB gama 1261, Austrália). Todos os experimentos foram realizados três vezes para obter dados exatos.

Modelo Animal

Camundongos nus Balb / c (fêmeas, com aproximadamente 4 semanas, pesando 15–20 g) foram adquiridos no Beijing Experimental Animal Research Center na Peking Union Medical College e mantidos sob condições específicas livres de patógenos, com umidade relativa (30–70 %) e ambiente com temperatura controlada (20–24 ° C) no Laboratory Animal Center, Tianjin Medical University, China. Todos os procedimentos de manuseio dos animais estavam de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Geral da Tianjin Medical University. Os xenoenxertos de tumor FRO foram induzidos por injeção subcutânea de 5 × 10 ⁶ Células FRO em 50 μL de PBS no ombro direito dos camundongos.

Imagens In Vivo

Quando os camundongos nus portadores de tumor foram alimentados por 1-2 semanas e o volume do tumor atingiu cerca de 10 mm de diâmetro, os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos (Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs e ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2). Cada grupo recebeu 7,4 MBq ¹³¹ I via injeção intratumoral para avaliar a localização do órgão de ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I. A imagem cintilográfica foi realizada 1, 2, 3, 7, 14 e 21 dias após a respectiva injeção do fármaco. Camundongos nus foram anestesiados com hidrato de cloral 4% (150 μL) antes de cada varredura, colocados em uma posição prona e, em seguida, fotografados usando um scanner SPECT / CT (Discovery NM / CT 670, EUA). Para evitar a exposição do tecido tireoidiano à radiação e imagem indesejadas, perclorato de sódio (0,05 mg / mL) foi adicionado à água de beber para todos os camundongos 1 dia antes do experimento e mantido por 1 semana.

Distribuição de tecidos

Às 24 e 72 h após a injeção intratumoral de 7,4 MBq ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I, os camundongos em cada grupo ( n =3 / grupo) foram sacrificados por deslocamento cervical, e o coração, baço, rim, fígado, intestino, pulmão e tecidos tumorais foram removidos e pesados. A radioatividade em vários órgãos foi medida usando um contador γ (LKB gama 1261, Austrália), e a radioatividade foi expressa como porcentagem da dose injetada por grama de tecido (% ID / g).

In Vivo ¹³¹ I Terapia

Semelhante à imagem in vivo, os camundongos dos três grupos foram injetados intratumoralmente com uma dose de 74 MBq (50 μL) de ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSNs e Na ¹³¹ I, respectivamente, quando o volume do tumor atingiu cerca de 10 mm de diâmetro. O mesmo volume de solução salina normal foi administrado como grupo controle. O volume do tumor foi estimado usando a seguinte fórmula:volume =4π / 3 (1/2 comprimento x 1/2 largura x 1/2 altura) [15, 29]. O volume do tumor e o peso corporal do animal foram medidos a cada 3 dias. Os camundongos eram sacrificados se perdessem mais de 20% do peso corporal ou se tornassem moribundos.

Exame histológico

Quando o experimento terminou, os camundongos foram sacrificados e o tumor e os tecidos normais dos quatro grupos, incluindo o coração, fígado, baço, rim e pulmão, foram isolados para estudar sua histopatologia. Resumidamente, seções de parafina de 5 mm de espessura foram desparafinadas usando duas incubações de xileno (por 30 min cada a 56 ° C) e então reidratadas em etanol. As secções foram então embebidas durante a noite em sacarose a 10% em água destilada. Em seguida, as seções foram lavadas em PBS 0,1 M, pH 7,4, incubadas em peróxido de hidrogênio a 1,2% em metanol por 30 min, e enxaguadas em PBS 0,1 M, pH 7,4, por 15 min. As lâminas dos tumores foram então incubadas em câmara úmida durante a noite, em temperatura ambiente, com anticorpos anti-VEGFR2 na diluição 1:100. Depois de lavar três vezes com PBS, as lâminas foram incubadas com sistema de detecção DAKO-REALTM En-Vision ™ por 60 min, depois visualizadas usando diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina de Mayer. Todas as imagens foram adquiridas em microscópio Olympus.

Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP), e a análise estatística foi realizada usando SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 12.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, EUA). A análise dos dados foi realizada usando curvas de Kaplan-Meier e o teste de log-rank. Todos os testes estatísticos foram bicaudais e um P valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

As características das nanopartículas

As características das nanopartículas foram analisadas e determinadas por TEM e DLS (Fig. 1a-c). A imagem TEM demonstrou que os MSNs tinham morfologia esférica uniforme, e a imagem DLS mostrou que os MSNs eram uniformes com tamanho de 108 ± 5,9 nm. A modificação de BSA e / ou direcionamento anti-VEGFR2 não alterou a morfologia das nanopartículas e apenas resultou em uma ligeira tendência de agregação em solução em comparação com MSNs não modificados, o que pode ter sido causado pelo aumento da área de superfície dos nanocomplexos. O diâmetro do BSA-MSNs-anti-VEGFR2 aumentou ligeiramente para 163 ± 4,6 nm, e o potencial zeta médio dos MSNs foi - 23,91 mV, que mudou para 28,45 mV para BSA-MSNs-anti-VEGFR2. A mudança no potencial zeta e o aumento no tamanho após a modificação da superfície sugeriram a adição bem-sucedida de BSA e anti-VEGFR2 na superfície dos MSNs em cada etapa (Tabela 1). A caracterização textural dos MSNs foi posteriormente confirmada pela isoterma de adsorção-dessorção de nitrogênio. Os MSNs possuem estrutura mesoporosa bem definida com área de superfície de 630,2 m ² / ge um diâmetro médio de poro de 2,8 nm (Fig. 1d). A estabilidade das nanopartículas de BSA-MSNs-anti-VEGFR2 foi monitorada ao longo de várias semanas, e nenhuma agregação óbvia observada. A proporção de ¹³¹ A rotulagem I foi de aproximadamente 50–75%.

As características das nanopartículas. Caracterizações de MSNs ( a ), BSA-MSNs ( b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 ( c ), e isoterma de adsorção-dessorção de nitrogênio e curvas de distribuição de tamanho de poro de Barrett – Joyner – Halenda (BJH) de MSNs ( d ) As imagens de microscopia eletrônica de transmissão mostram que todos tinham morfologia regular (esférica uniforme). As imagens de espalhamento dinâmico de luz mostram que todos eram uniformes, com tamanhos médios de 108 nm, 139 nm e 163 nm, respectivamente. As análises de BET e BJH demonstraram isotermas típicas do tipo IV, consistentes com uma estrutura mesoporosa

Captação de nanopartículas construídas

A ligação de BSA-MSNs e BSA-MSNs-anti-VEGFR2 às células FRO da linha de células ATC humana alvo foi testada usando microscopia confocal (Fig. 2). A imunofluorescência mostrou que ambos os MSNs direcionados e não direcionados poderiam se ligar com eficiência às células FRO. Após 1 h de incubação com BSA-MSNs ou BSA-MSNs-anti-VEGFR2, a fluorescência visível estava presente nas células, a qual foi mantida e fortalecida após 6 h de incubação. Comparado com BSA-MSNs-anti-VEGFR2, BSA-MSNs também pode se ligar às células, mas descobrimos que a retenção de células tumorais era mínima e o sinal de fluorescência verde era fraco. Este resultado sugeriu que a capacidade de direcionamento das nanopartículas foi aumentada por meio da modificação com o anticorpo anti-VEGFR2.

Captação de nanopartículas construídas. Imagens de microscópio de varredura a laser confocal mostraram internalização celular de diferentes formulações em 1 e 6 h para BSA-MSNs e BSA-MSNs-anti-VEGFR2. O sinal fluorescente em 1 h foi aumentado em 6 h para ambos os grupos. Além disso, a fluorescência verde de ligação no grupo anti-VEGFR2-alvo foi mais forte do que no grupo não-alvo em ambos os pontos de tempo

Captação celular dependente do tempo

A fim de determinar a captação de radioiodo de Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSN e ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 com o passar do tempo, ¹³¹ As medições da atividade cronometrada em I foram obtidas em células FRO. Conforme mostrado na Fig. 3a, o ¹³¹ A absorção de I nesta linha celular atingiu seu nível máximo após 3 h de incubação com ¹³¹ I-BSA-MSNs e após 5 h com ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Além disso, a captação de radioiodo de ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 era maior do que ¹³¹ I-BSA-MSNs.

Captação celular dependente do tempo e distribuição nos tecidos. a Os dados sobre a captação celular dependente do tempo são apresentados como a média ± DP de três grupos. b Comparação dos dados sobre a biodistribuição de ¹³¹ I no tumor e órgãos principais de camundongos com tumor ATC 24 e 72 h após a injeção intratumoral de Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs e ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. A radioatividade do tecido tumoral do grupo alvo anti-VEGFR2 24 e 72 h após a injeção intratumoral (32,2 ± 2,8% ID / ge 23,0 ± 1,8% ID / g, respectivamente) foi significativamente maior do que a do grupo não-alvo (26,1 ± 2,5% ID / ge 12,3 ± 1,2% ID / g, respectivamente) (todos P <0,05). Os dados também são apresentados como a média ± DP para os três grupos

Distribuição de tecidos

A distribuição de tecido de ¹³¹ I em ratos nus foi medido usando um γ contador 24 e 72 h após a injeção intratumoral com os respectivos fármacos (Fig. 3b). Os resultados revelaram que os três grupos tiveram acúmulo semelhante de radiação nos tecidos normais em 24 e 72 h. A radioatividade para todos os grupos diminuiu gradualmente com o tempo e foi principalmente acumulada no tumor. Além disso, o acúmulo no tecido tumoral em 24 e 72 h após a injeção nos dois grupos com ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I eram muito maiores do que no Na ¹³¹ Grupo I, que era de 11,6 ± 0,9% ID / g em 24 h e diminuiu drasticamente para 2,1 ± 0,08% ID / g em 72 h. No entanto, a concentração no tumor do grupo alvo de anti-VEGFR2 em 24 e 72 h após a injeção foi de 32,2 ± 2,8% ID / ge 23,0 ± 1,8% ID / g, respectivamente, que foi significativamente maior do que a de não grupo-alvo (26,1 ± 2,5% ID / ge 12,3 ± 1,2% ID / g, respectivamente, todos P <0,05).

Imagens In Vivo

Para determinar o ¹³¹ Eu capto e distribuo nanopartículas e observo o tempo de residência de ¹³¹ I no tecido tumoral in vivo, imagens representativas de SPECT / CT de camundongos com tumor FRO foram adquiridas em diferentes pontos de tempo após injeção intratumoral com os respectivos fármacos (Fig. 4a). Os resultados mostraram que o acúmulo radioativo no Na ¹³¹ O grupo I foi rapidamente excretado do tumor 2 dias após a injeção e não foi observado 3 dias após a injeção. Em contraste, os dois grupos com ¹³¹ As nanopartículas marcadas com I apresentaram depuração sanguínea mais lenta e maior acúmulo no tecido tumoral, mesmo 2 semanas após a injeção, especialmente no grupo alvo anti-VEGFR2. Notavelmente, em 3 semanas após a injeção, a radioatividade no grupo-alvo era obviamente mais forte do que no grupo não-alvo.

Imagem in vivo, in vivo ¹³¹ I terapia e análise de sobrevivência. a Imagens fundidas e tridimensionais de SPECT / CT de camundongos com tumor ATC obtidas em diferentes pontos de tempo após injeção intratumoral com as respectivas drogas. O acúmulo radioativo no Na ¹³¹ O grupo I não foi visto 3 dias após a injeção, mas era óbvio mesmo 3 semanas após a injeção no grupo anti-VEGFR2 direcionado. Volume do tumor ( b ), peso corporal ( c ) mudanças e curvas de sobrevivência Kaplan-Meier ( d ) nos modelos de xenoenxerto FRO ATC ( n =6 / grupo). O crescimento do tumor e a perda de peso corporal no grupo-alvo foram significativamente inibidos em comparação com os do Na ¹³¹ não direcionado I, ou grupo salino, respectivamente. Os dados são apresentados como a média ± DP de três grupos e todos foram P < 0,05. Além disso, o tempo médio de sobrevivência no grupo-alvo (41 dias) foi significativamente prolongado em comparação com o não-direcionado (34 dias) ou Na ¹³¹ Grupo I (25 dias) (todos P < 0,01)

In Vivo ¹³¹ I Terapia

A Figura 4b mostra o volume médio do tumor ao longo do tempo nos quatro grupos. O volume do tumor antes da injeção foi usado como referência inicial. Exceto no ¹³¹ Grupo I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, os tumores cresceram gradualmente em todos os grupos, especialmente no Na ¹³¹ I e grupos de solução salina. No dia 24, o volume médio do tumor no Na ¹³¹ Os grupos I e solução salina foram 296,6 ± 24,2% e 278,3 ± 19,3%, respectivamente, em comparação com 198,7 ± 13,2% no ¹³¹ Grupo I-BSA-MSNs no dia 30. Curiosamente, observamos que o volume no grupo-alvo anti-VEGFR2 reduziu lentamente após o dia 9 pós-injeção e quase diminuiu para a referência inicial no final da observação.

A Figura 4c mostra as mudanças no peso corporal dos quatro grupos. O peso corporal diminuiu gradualmente no Na ¹³¹ I e grupos de solução salina durante o período de observação. No entanto, os outros dois grupos perderam peso apenas na primeira semana, que foi recuperado em momentos posteriores, especialmente para o grupo-alvo anti-VEGFR2.

Análise de sobrevivência

Neste estudo, usamos a probabilidade de sobrevivência como outra métrica para avaliar os efeitos terapêuticos de ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I. A Figura 4d mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier após tratamentos com solução salina, Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs ou ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 no modelo de camundongo nu portador de tumor ATC. Os tumores progrediram rapidamente na solução salina e Na ¹³¹ I grupos, e o tempo médio de sobrevivência foi de 27 e 25 dias, respectivamente. A análise com um teste de log-rank revelou que o tempo médio de sobrevivência no ¹³¹ O grupo I-BSA-MSNs (34 dias) foi significativamente prolongado em comparação com o Na ¹³¹ Eu grupo ( P < 0,001). Além disso, descobrimos que o tratamento no grupo alvo anti-VEGFR2 (tempo médio de sobrevivência, 41 dias) resultou em resultados de sobrevivência significativamente melhores do que aqueles no grupo não alvo ( P <0,01).

Análise Histopatológica

Para avaliar o efeito antitumoral de ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I e testar a toxicidade potencial de MSNs em camundongos, os principais órgãos e tumores foram coletados para coloração com hematoxilina e eosina após a radioterapia. Nenhuma alteração patológica significativa nos órgãos vitais foi observada nos camundongos com tumor após o tratamento com ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I (Fig. 5a). Isso indicou que nenhuma toxicidade sistêmica aparente ocorreu durante o período de observação. Além disso, os tumores tratados com ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 mostrou degeneração e necrose maciça de células tumorais, o que era mais óbvio do que no ¹³¹ Grupo I-BSA-MSNs. No entanto, o tumor tratado com Na ¹³¹ O grupo I ou solução salina estava repleto de células tumorais viáveis. A análise imunohistoquímica do tumor revelou expressão visível de VEGFR (Fig. 5b).

Análise histopatológica. a Análise histopatológica dos principais órgãos de camundongos com tumor FRO ATC após tratamento com ¹³¹ Nanopartículas marcadas com I. Não foram observadas alterações patológicas significativas no coração, fígado, pulmão e rim. b Exames patológicos (coloração H&E) e análise imunohistoquímica de tumores em camundongos. Grandes fragmentos da degeneração e necrose de células tumorais no grupo anti-VEGFR2-alvo e pequenos pedaços de necrose de baixa densidade no ¹³¹ O grupo I-BSA-MSNs é exibido. Em contraste, apenas células tumorais viáveis foram observadas no Na ¹³¹ I e grupos de solução salina. A fotomicrografia da análise imuno-histoquímica mostrou expressão visível de VEGFR. Bar =200 μm

Discussão

O prognóstico da ATC permanece ruim e não há opções de tratamento eficazes até o momento [1, 2, 6]. A terapia molecular direcionada, como uma nova terapia, melhorou a morbidade e mortalidade de muitos cânceres [23, 24]. O VEGFR é crucial para a formação microvascular, o que facilita o crescimento da maioria das doenças malignas e permite a expansão contínua do tumor [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF₁₂₁ conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ balcão.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ EU.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.