Otimização e avaliação do método de pré-tratamento para sp-ICP-MS para revelar a distribuição de nanopartículas de prata no corpo

Resumo

O uso predominante de nanopartículas projetadas (ENPs) aumentou nossa exposição a essas partículas. As técnicas analíticas disponíveis atualmente falham em quantificar e analisar simultaneamente as propriedades físicas dos ENPs nos tecidos biológicos. Portanto, novos métodos são necessários para avaliar as condições de exposição aos ENPs. A espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado de partícula única (sp-ICP-MS) é uma abordagem atraente que pode realizar análises quantitativas e qualitativas de ENPs. No entanto, a aplicação desta abordagem para amostras biológicas é limitada devido à falta de métodos de pré-tratamento para recuperar ENPs de tecidos biológicos de forma eficaz. Neste estudo, avaliamos vários métodos de pré-tratamento e identificamos as condições ideais de pré-tratamento para análises de sp-ICP-MS de ENPs em tecidos biológicos usando nanopartículas de prata (nAg) como modelo. Selecionamos cinco reagentes como solventes de pré-tratamento (hidróxido de sódio, hidróxido de tetrametilamônio, ácido nítrico, ácido clorídrico e proteinase K). Nossos resultados mostraram que o tratamento com hidróxido de sódio foi ideal para detectar nAg no fígado de camundongo. Além disso, esse método de pré-tratamento pode ser aplicado a outros órgãos, como coração, pulmão, baço e rim. Por fim, avaliamos a aplicabilidade desse método analisando a quantidade e as propriedades físicas da prata no sangue e no fígado de camundongos, após administração intravenosa de nAg ou íon de prata. Nosso método sp-ICP-MS revelou que o nAg administrado no sangue era parcialmente ionizado e tendia a ser distribuído na forma de partícula (aproximadamente 80%) no fígado e na forma iônica (aproximadamente 95%) no sangue. Em conclusão, otimizamos as estratégias de pré-tratamento para avaliação de sp-ICP-MS de ENPs em tecidos biológicos e demonstramos sua aplicabilidade avaliando as mudanças nas propriedades físicas de nAg no fígado e no sangue. Também mostramos que mudanças parciais da forma de partícula para a forma iônica de nAg influenciam sua cinética e distribuição quando administrado a camundongos.

Introdução

O progresso recente em nanotecnologia acelerou o desenvolvimento de nanopartículas projetadas (ENPs) que são menores do que 100 nm. Devido às suas propriedades benéficas, como maior permeabilidade do tecido e reação de superfície em comparação com outros materiais micro ou maiores, os ENPs são amplamente usados em vários produtos, incluindo cosméticos, alimentos e medicamentos [1, 2]. Por exemplo, nanopartículas de prata (nAg), um dos ENPs mais comuns, são usadas em antibióticos por causa de sua liberação constante de Ag ⁺ . Além disso, são utilizados como materiais condutores na tecnologia de eletrônica impressa [3]. Em contraste, as propriedades físico-químicas únicas associadas ao pequeno tamanho de partícula de nAg podem ser perigosas. Sabe-se que essas partículas podem romper a barreira hematoencefálica e induzir inflamação [4]. O aumento do uso de ENPs em produtos de uso diário expôs os humanos a vários tipos de ENPs. Seu uso contínuo deve ser avaliado para determinar sua segurança [2, 3].

Para garantir a segurança, é indispensável compreender o “risco” dos ENPs, que é o conceito integrativo de “perigo” (toxicidade potencial) e “condição de exposição”. Embora os perigos dos ENPs tenham sido analisados em todo o mundo, poucos estudos examinaram as situações de exposição aos ENPs [5]. Além disso, foi relatado recentemente que a distribuição intracelular de nAg incorporado em células de cultura difere daquela de Ag ⁺ [6] e aquele Ag ⁺ particulados em tecido de camundongo [7]. Portanto, é necessário avaliar suas propriedades físicas, como tamanho de partícula e distinguir entre partículas e íons no corpo [3, 6,7,8].

Usando a tecnologia analítica atualmente disponível, é desafiador analisar quantitativamente as propriedades físicas dos ENPs no corpo. A espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) é adequada para análises quantitativas, mas não para análises de propriedades físicas, uma vez que todos os alvos, como íons e partículas, não podem ser distinguidos durante a quantificação. Em contraste, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é adequada para analisar as propriedades físicas, mas não para quantificar ENPs, já que apenas uma parte do tecido é observada. Portanto, um novo método é necessário para análises simultâneas de propriedades físicas e análises quantitativas de ENPs para estudar sua biotransformação.

Partícula única-ICP-MS (sp-ICP-MS), que é baseado em ICP-MS, introduz uma ou nenhuma partícula no analisador por tempo de permanência e é um método atraente para determinar tamanhos de partícula analisando a intensidade de pico e as concentrações de partícula por análise taxas de pico. Partículas e íons podem ser distinguidos através da análise de sinais de pico e sinais de fundo [9]. Alguns estudos anteriores relataram o uso de sp-ICP-MS para a quantificação e análises de propriedades físicas de ENPs [10, 11].

No entanto, a maioria desses estudos usou sp-ICP-MS para analisar água ambiental ou produtos comerciais contendo ENPs [10, 11] e alguns estudos adotaram sp-ICP-MS para tecidos biológicos. Além disso, esses estudos pré-trataram os tecidos por digestão com proteinase K ou com hidróxido de tetrametilamônio (TMAH) para solubilizar as matrizes protéicas e lipídicas. Como diferentes reagentes têm diferentes propriedades de solubilização, variações nos métodos de pré-tratamento podem influenciar a taxa de recuperação dos ENPs distribuídos nos tecidos. Além disso, é importante que o método de pré-tratamento não afete o tamanho ou as propriedades iônicas dos ENPs e recupere com eficiência os ENPs distribuídos nos tecidos.

Neste estudo, avaliamos e otimizamos diferentes métodos de pré-tratamento para sp-ICP-MS em amostras biológicas para determinar a quantidade e as propriedades físicas de ENPs no corpo usando nAg como ENPs modelo.

Materiais e métodos

ENPs

Os 30, 70 e 100 nm “Biopure” nAg (nAg30, nAg70 e nAg100) foram obtidos da nanoComposix (San Diego, CA, EUA). RM8013 foi usado como um padrão para calcular a eficiência de transporte e foi obtido do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (Gaithersburg, MD, EUA). Cada tipo de ENPs foi sonicado por 10 min antes do uso.

Reagentes

Soluções de 0,1 mol / L de hidróxido de sódio (NaOH), 25% de TMAH, 30% de ácido clorídrico (HCl) e proteinase K foram obtidas de Wako (Osaka, Japão). Uma solução de ácido nítrico a 70% (HNO ₃ ) foi obtido de Kanto Kagaku (Tóquio, Japão).

Animais

Ratinhos BALB / c (fêmeas, 6 semanas) foram adquiridos a Japan SLC (Shizuoka, Japão). Os camundongos foram alojados em uma sala com um ciclo claro / escuro de 12 horas (luzes acesas às 8:00 e luzes apagadas às 20:00). Comida e água foram fornecidas ad libitum. Os protocolos experimentais seguiram as diretrizes éticas da Universidade de Osaka, Japão.

Medindo distribuições de tamanho de partícula por espalhamento dinâmico de luz

O nAg foi diluído em água milliQ para uma concentração final de prata (Ag) de 10 μg / mL. Em seguida, o tamanho e a célula capilar zeta (Malvern Instruments, Malvern, UK) foram preenchidos com 1 mL da solução para medir a distribuição de partículas e o diâmetro médio com um Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments).

Medindo a massa bruta de Ag

Para medir a concentração total de Ag nas amostras, foi usado um Agilent 7700x (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As condições de análise foram potência RF 1550 W, gás portador 1,05 L / min Ar e tempo de permanência 100 ms. As medições foram repetidas três vezes no modo MS. Um método de padrão interno foi usado, e o ródio foi usado como um padrão interno para Ag. Os elementos alvo das análises de ICP-MS foram ¹⁰³ Rh e ¹⁰⁷ Ag. As soluções padrão de ag e ródio foram obtidas na Wako (Osaka, Japão).

Análise de sp-ICP-MS e seu cálculo

Para análise de sp-ICP-MS, usamos um Agilent 7700x (Agilent Technologies; Santa Clara, CA, EUA) semelhante à análise de Ag total. As condições de análise foram as seguintes:potência RF 1550 W, gás portador 1,05 L / min Ar, tempo de permanência 10 ms e tempo de análise 30 s. Para calcular o tamanho de partícula, foram utilizadas ferramentas de cálculo de partícula única publicadas pela RIKILT [12].

Concentração de partículas críticas para sp-ICP-MS

A concentração da solução estoque nAg foi de 1,0 mg / mL, que foi usada para preparar soluções de 2.000, 800, 700 e 600 pg / mL. Cada uma dessas soluções foi então diluída em série 10 vezes para obter 40 soluções de nAg diferentes. Determinamos as concentrações de partículas dessas 40 amostras por sp-ICP-MS.

Otimização de métodos de pré-tratamento para fígado de camundongo

Os fígados coletados dos camundongos foram misturados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ( w / v proporção de 1:10) e depois homogeneizado. O homogenato foi misturado com solução de nAg 100 ng / mL. A mistura foi então tratada com um dos seguintes reagentes a um v / v proporção de 1:1—0,1 mol / L de solução de NaOH, 25% de TMAH, 30% de HCl ou solução de proteinase K (10 U / mL de proteinase K, 0,01 M de Tris-HCl, 0,01 M de EDTA e 0,5% de SDS). As amostras foram incubadas por 3 ha 37 ° C e os resíduos coletados e pesados. Os sobrenadantes foram diluídos 500 vezes e analisados por sp-ICP-MS.

Avaliação da Versatilidade do Pré-tratamento de NaOH em Vários Órgãos

Os corações, pulmões, baços e rins coletados dos camundongos foram misturados com PBS ( w / v proporção de 1:10), homogeneizado e misturado com 100 nm / mL nAg. Em seguida, solução de NaOH 1 mol / L a v / v proporção de 1:1 foi adicionado e incubado durante 3 h a 37 ° C. Após a incubação, os resíduos foram coletados e pesados. Os sobrenadantes foram diluídos 500 vezes e analisados por sp-ICP-MS.

Avaliação da quantidade e propriedades físicas de nAg100 e Ag ⁺ em camundongos após administração intravenosa única

Para administração intravenosa, nAg100 e AgNO ₃ foram diluídos para 0,25 mg / mL (como Ag ⁺ ) com solução de glicose a 5%. Camundongos BALB / c foram administrados por via intravenosa com nAg100 (1,5 ou 0,75 mg / kg), AgNO ₃ (1,5 ou 0,75 mg / kg como Ag ⁺ ), ou solução de glicose a 5% (controle). Após 24 h, o sangue e o fígado dos camundongos sacrificados foram coletados. Os fígados foram misturados com PBS ( w / v proporção de 1:10) e homogeneizado. Os homogenatos de sangue e fígado foram misturados com solução de TMAH ( v / v proporção de 1:1) e com solução de NaOH ( v / v proporção de 1:1), respectivamente. Essas amostras foram analisadas por ICP-MS para medir as concentrações de Ag e por sp-ICP-MS para avaliar as propriedades físicas, como tamanho de partícula e distinção entre partículas e íons.

Resultados e discussões

Otimização da detecção de partículas por sp-ICP-MS

Na análise sp-ICP-MS, é importante introduzir uma ou nenhuma partícula no detector por tempo de espera. Se múltiplas partículas são introduzidas no detector ao longo do tempo de permanência, a massa bruta de múltiplas partículas é considerada como a massa de uma única partícula [13]. Portanto, as amostras devem ser suficientemente diluídas para análise de sp-ICP-MS. Em contraste, a análise sp-ICP-MS de uma amostra com uma concentração muito baixa de ENPs leva a dados de distribuição e tamanho de partículas imprecisos.

Para determinar as relações entre a concentração de nAg100 e o número de partículas detectadas, diluímos em série as soluções estoque de nAg100 para avaliação por sp-ICP-MS. O resultado mostrou que o número de partículas detectadas aumentou teoricamente e linearmente na região de concentração de Ag relativamente mais baixa. Em contraste, em concentrações de Ag relativamente mais altas, o número de partículas detectadas foi menor do que o valor teórico (Fig. 1a). Esses dados indicaram que em concentrações mais altas de Ag, várias partículas tendem a ser introduzidas no detector durante cada tempo de espera, resultando na superestimação do tamanho da partícula. Assim, é necessário determinar o maior número de partículas detectadas que não diferem do valor teórico para avaliar com precisão os tamanhos das partículas. Em seguida, subtraímos o número de partículas detectadas do valor teórico e plotamos a diferença como o eixo vertical. Os resultados indicaram que ocorreram discrepâncias na estimativa do tamanho quando o número de partículas detectadas foi> 500. Isso sugere que é necessário detectar ≤ 500 partículas durante o tempo de análise (Fig. 1b). Embora esses dados tenham sido obtidos em um único ensaio, a repetição do experimento mostrou os mesmos resultados (dados não mostrados).

A fim de validar as condições de análise, diluímos nAg com vários diâmetros (nAg30, nAg70, nAg100) para detectar <500 partículas por tempo de análise e avaliamos seus diâmetros. A análise sp-ICP-MS indicou que os diâmetros primários de nAg30, nAg70 e nAg100 foram 30,0 ± 1,2, 65,1 ± 0,6 e 97,4 ± 0,6, respectivamente. Além disso, os diâmetros hidrodinâmicos determinados por espalhamento dinâmico de luz (DLS) foram 36,4 ± 1,6, 70,6 ± 1,7 e 101 ± 1,0, respectivamente, valores esses semelhantes aos estimados por sp-ICP-MS. Essas descobertas sugerem que as condições de sp-ICP-MS eram adequadas para medir os diâmetros de nanopartículas de vários tamanhos.

Otimização de métodos de pré-tratamento para detecção de nAg em tecido de fígado de camundongo

Para quantificar e determinar as propriedades físicas dos ENPs no corpo, é necessário lisar completamente os tecidos. Além disso, é essencial recuperar de forma eficiente as partículas e íons distribuídos no corpo sem induzir quaisquer alterações físicas ou químicas nas partículas. Testamos cinco reagentes de solubilização, NaOH, TMAH, HNO ₃ , HCl ou proteinase K, e analisou a quantidade e as propriedades físicas por sp-ICP-MS para otimizar as estratégias de pré-tratamento usando o fígado como modelo [14,15,16,17,18].

O homogenato de fígado foi misturado com nAg100 para obter uma concentração final de Ag de 100 ng / mL seguido por tratamento com cada reagente de solubilização a 37 ° C. Em primeiro lugar, avaliamos a quantidade de resíduo de tecido como um indicador de solubilidade do tecido. Mais de 90% do tecido foi dissolvido por tratamento com NaOH, TMAH e proteinase K, enquanto apenas 75% do tecido foi dissolvido por HNO ₃ e tratamentos com HCl (Fig. 2a). Considerando que quase 80% do tecido é composto de água [19], HNO ₃ , Os tratamentos com HCl e PBS foram ineficientes para dissolver a matriz de tecido insolúvel. Em contraste, o tratamento com NaOH, TMAH e proteinase K dissolveu de forma eficiente a matriz insolúvel dos tecidos, indicando sua adequação para quantificar com precisão nAg no tecido. Em seguida, analisamos a taxa de recuperação de cada partícula e íon para avaliar a mudança nas propriedades físicas com cada tratamento. A análise de Sp-ICP-MS mostrou que nAg100 foi quase completamente ionizado pelo tratamento com reagentes ácidos (HNO ₃ e HCl) e parcialmente ionizado quando tratado com proteinase K. Isso sugeriu que os reagentes ácidos e a proteinase K dissolveram as partículas e as converteram em íons. Em contraste, Ag 100 ng / mL, correspondente à quantidade inicialmente adicionada, foi detectado como partículas quando o tecido foi tratado com reagentes alcalinos (NaOH e TMAH). Quase nenhum íon foi detectado após tratamentos alcalinos (Fig. 2b), indicando que NaOH e TMAH mantiveram as propriedades físicas do nAg. Finalmente, avaliamos a distribuição do diâmetro das partículas em tecidos tratados com os diferentes reagentes, a fim de analisar as propriedades físicas em detalhes. O diâmetro médio das partículas mudou para 120 de 100 nm após o tratamento com TMAH (Fig. 2c). Além disso, as partículas eram mais largas após o tratamento com TMAH (Fig. 2d), indicando agregação de partículas. Em contrapartida, quando os tecidos foram tratados com NaOH, o diâmetro médio das partículas foi próximo a 100 nm, correspondendo ao tamanho inicial das partículas. Isso sugere que o pré-tratamento com NaOH é a condição ideal para detectar nAg100 em tecidos de fígado de camundongo.

O pré-tratamento com TMAH tem sido amplamente utilizado para análise de sp-ICP-MS em vários estudos. TMAH pode induzir agregação de nAg100 com base em várias propriedades físicas, como viscosidade e pH. Além disso, a constante dielétrica pode estar relacionada à agregação. O tratamento com TMAH por 3 h pode aumentar a constante dielétrica causada pela decomposição do TMAH em trimetilamina (TMA) e metanol [20]. Um aumento na constante dielétrica traz o potencial zeta de nAg100, que é inversamente proporcional à constante dielétrica, para quase zero, resultando na perda de repulsão eletrostática entre nAg e indução de agregação. O tratamento de nAg100 com TMAH por um curto período de tempo (1 min) resultou em um tamanho médio de partícula de aproximadamente 100 nm (dados não mostrados).

Avaliação da versatilidade do pré-tratamento de NaOH em vários órgãos

Para avaliar a versatilidade do pré-tratamento de NaOH para detecção de nAg, tratamos vários órgãos de camundongo (coração, pulmão, rim e baço) com NaOH e conduzimos sp-ICP-MS para detecção de partículas. Em primeiro lugar, avaliamos a quantidade de resíduo de tecido como um indicador de solubilidade do tecido. Mais de 95% da solubilização do tecido foi alcançada pelo tratamento com NaOH (Fig. 3a). Além disso, o Ag correspondente às quantidades de aditivo foi detectado como partículas (Fig. 3b). Embora algumas taxas de recuperação excedam 100%, os critérios da US Food and Drug Administration afirmam que uma taxa de recuperação de 80-120% é suficientemente confiável [21]. Portanto, nossa análise é confiável. Além disso, o diâmetro médio de partícula de nAg detectado em qualquer órgão foi próximo a 100 nm, correspondendo ao tamanho de partícula do nAg adicionado (Fig. 3c, d). Esses estudos sugerem que o pré-tratamento com NaOH é ideal para detectar nAg não apenas no fígado do camundongo, mas também no coração, pulmão, rim e baço do camundongo.

Tomados em conjunto, nossos resultados demonstram que o pré-tratamento com NaOH é a estratégia de pré-tratamento ideal para a quantificação e análises de propriedades físicas de nAg em tecidos animais por sp-ICP-MS.

Avaliação de sp-ICP-MS para análises quantitativas e de propriedade física de nAg e Ag ⁺ em tecidos biológicos

nAg ioniza no corpo ou que Ag ⁺ partículas em tecido de camundongo, embora os detalhes desse processo não sejam claros. Portanto, avaliamos a aplicação prática do sp-ICP-MS analisando a quantidade e as propriedades físicas do Ag no sangue e no fígado de camundongos após uma única administração intravenosa de nAg100 ou Ag ⁺ . A análise de ICP-MS mostrou que Ag foi detectado no sangue de ambos Ag ⁺ - e camundongos tratados com nAg100 (Fig. 4a). Além disso, o Ag foi detectado no fígado de ambos os grupos (Fig. 4b). Em seguida, analisamos as propriedades físicas do Ag em cada amostra. Porque pequenas quantidades de nAg foram detectadas no sangue de ambos Ag ⁺ - e camundongos tratados com nAg100, a maioria do Ag detectado estava na forma de íons (Fig. 4c). Nas amostras de fígado, aproximadamente 80% de Ag foi detectado como partículas em camundongos tratados com nAg100, enquanto uma pequena quantidade de nAg foi detectada em Ag ⁺ camundongos tratados (Fig. 4d). Finalmente, avaliamos o tamanho das partículas no fígado de camundongos tratados com nAg100 por sp-ICP-MS, que mostrou que os tamanhos das partículas eram de aproximadamente 80 nm (Fig. 4e). Esses dados sugerem que Ag ⁺ administrado no sangue dificilmente se transformou em partículas e as propriedades físicas do Ag ⁺ no sangue e no fígado não foram alterados. Em contraste, o nAg100 administrado no sangue estava parcialmente ionizado; 20% do Ag no fígado e a maior parte do Ag no sangue estavam na forma iônica. Como resultado da ionização parcial, o diâmetro médio do nAg nos tecidos do fígado foi menor do que o das partículas administradas inicialmente (80 vs 100 nm). Consequentemente, nossa estratégia de sp-ICP-MS aplicável de amostra biológica revelou que o nAg100 administrado no sangue foi distribuído como partículas (aproximadamente 80%) no fígado e como íons (aproximadamente 95%) no sangue, enquanto o método ICP-MS poderia avalie apenas as quantidades de Ag e não as alterações físicas ou químicas nas partículas.

Conclusões

Identificamos as condições ideais de pré-tratamento para a análise de sp-ICP-MS de nAg em tecidos biológicos, permitindo a quantificação simultânea e análises de propriedades físicas de ENPs em tecidos animais. Também desenvolvemos o método sp-ICP-MS adequado para avaliação de amostras biológicas e demonstramos sua aplicabilidade avaliando a mudança nas propriedades físicas do nAg100 no fígado e no sangue. Também mostramos que a mudança parcial da forma de partícula para a forma iônica do nAg100 administrado aos camundongos influenciou sua cinética e distribuição. Esta técnica pode ser aplicada na análise de risco de ENPs avaliando as condições de exposição a ENP, elucidando as respostas biológicas aos ENPs e identificando os mecanismos subjacentes às respostas.

Disponibilidade de dados e materiais

O compartilhamento de dados não se aplica a este artigo, pois nenhum conjunto de dados foi gerado ou analisado durante o estudo atual.

Abreviações

Ag:: Prata
Ag ⁺ :: Íon de prata
DLS:: Espalhamento de luz dinâmico
ENPs:: Nanopartículas projetadas
HCl:: Ácido clorídrico
HNO ₃ :: Ácido nítrico
ICP-MS:: Espectrometria de massa com Plasma indutivamente acoplado
nAg:: Nanopartículas de prata
nAg100:: 100 nm nAg
nAg30:: 30 nm nAg
nAg70:: 70 nm nAg
NaOH:: Hidróxido de sódio
PBS:: Salina tamponada com fosfato
sp-ICP-MS:: Partícula única ICP-MS
TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão
TMAH:: Hidróxido de tetrametilamônio

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