Otimização de Pré-Tratamento para sp-ICP-MS: Revelando Distribuição de Nanopartículas de Prata em Tecidos Biológicos

Resumo

A rápida proliferação de nanopartículas projetadas (ENPs) aumentou a exposição humana, mas as ferramentas analíticas atuais não conseguem quantificar e caracterizar simultaneamente ENPs dentro de matrizes biológicas. Espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente de partícula única (sp-ICP-MS) oferece quantificação simultânea e avaliação de propriedades físicas, mas sua aplicação a tecidos é limitada por protocolos de pré-tratamento inadequados que podem alterar a integridade das partículas ou reduzir a recuperação. Neste estudo, avaliamos sistematicamente cinco agentes solubilizantes — hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de tetrametilamônio (TMAH), ácido nítrico (HNO₃), ácido clorídrico (HCl) e proteinase K — usando nanopartículas de prata (nAg) como sistema modelo. O tratamento com NaOH alcançou >90% de dissolução do tecido, preservando o tamanho das partículas e minimizando a ionização, superando os outros reagentes. A extensão do protocolo de NaOH a homogeneizados de coração, pulmão, baço e rim confirmou sua ampla aplicabilidade. Finalmente, aplicamos o pré-tratamento otimizado para avaliar o destino de nAg administrado intravenosamente versus Ag⁺ em sangue e fígado de camundongos. O sp-ICP-MS revelou que nAg permaneceu amplamente particulado (~80%) no fígado, mas ionizado (~95%) na corrente sanguínea, enquanto Ag⁺ permaneceu iônico em ambos os compartimentos. Essas descobertas demonstram que o pré-tratamento com NaOH permite análise precisa de ENPs in vivo por sp-ICP-MS e destaca a importância da conversão partícula-íon na determinação da biodistribuição e cinética.

Introdução

Avanços em nanotecnologia aceleraram a produção de nanopartículas projetadas (ENPs) menores que 100 nm, oferecendo vantagens únicas como penetração tecidual aprimorada e superfícies reativas. Nanopartículas de prata (nAg) são amplamente empregadas em bens de consumo e farmacêuticos, valorizadas por sua liberação sustentada de Ag⁺ e propriedades condutivas. No entanto, os mesmos atributos na nanoescala que conferem funcionalidade também podem representar riscos à saúde, incluindo disrupção da barreira hematoencefálica e respostas inflamatórias. Dada a ubiquidade das ENPs, uma avaliação rigorosa de perigo e exposição — definindo coletivamente o risco de ENP — permanece essencial.

Embora extensa pesquisa tenha focado na toxicidade de ENPs, poucos estudos quantificaram cenários reais de exposição. Trabalhos recentes mostraram distribuições intracelulares distintas para nAg versus Ag⁺ em células cultivadas, ressaltando a necessidade de diferenciar partículas de íons dentro de tecidos. ICP-MS convencional quantifica o conteúdo total de metal, mas não consegue resolver espécies particuladas versus iônicas, enquanto MET fornece informação de tamanho, mas carece de capacidade quantitativa. Assim, um método que acople quantificação precisa com análise de propriedades físicas é crítico para elucidar a biotransformação de ENPs.

sp-ICP-MS pode detectar partículas individuais, fornecendo estimativas de tamanho a partir da intensidade do pico e concentração a partir da frequência do pico, enquanto distingue íons via análise de sinal de fundo. Estudos prévios aplicaram sp-ICP-MS a amostras ambientais e comerciais, mas seu uso em tecidos biológicos foi limitado, largamente devido a pré-tratamento inadequado que pode degradar ou alterar ENPs. Diferentes reagentes solubilizantes variam em sua capacidade de lisar tecidos, recuperar ENPs e preservar a integridade das partículas. Este estudo, portanto, avalia e otimiza estratégias de pré-tratamento para análise de nAg em tecidos de camundongo por sp-ICP-MS, visando estabelecer um fluxo de trabalho confiável para quantificação simultânea e avaliação de propriedades físicas de ENPs in vivo.

Materiais e Métodos

ENPs

nAg de 30, 70 e 100 nm Biopure (nAg30, nAg70, nAg100) foram obtidos da nanoComposix (San Diego, CA, EUA). RM8013, padrão para calibração de eficiência de transporte, foi obtido do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (Gaithersburg, MD, EUA). Todas as suspensões de ENP foram sonificadas por 10 min antes do uso.

Reagentes

Soluções de 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl e proteinase K foram adquiridas da Wako (Osaka, Japão). Solução de 70% HNO₃ foi obtida da Kanto Kagaku (Tóquio, Japão).

Animais

Camundongos fêmeas BALB/c (6 semanas) foram obtidos da Japan SLC (Shizuoka, Japão). Camundongos foram mantidos sob ciclo luz/escuro de 12 h com acesso livre a comida e água. Todos os procedimentos cumpriram as diretrizes éticas da Universidade de Osaka, Japão.

Medição de Distribuição de Tamanho de Partículas por Espalhamento Dinâmico de Luz

nAg foi diluído em água MilliQ a 10 µg mL⁻¹ Ag. Uma alíquota de 1 mL foi colocada em uma célula capilar zeta (Malvern Instruments) e analisada em um Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) para determinar diâmetro médio e potencial zeta.

Medição de Massa Total de Ag

Concentrações totais de Ag foram medidas em um ICP-MS Agilent 7700x (Agilent Technologies). Condições de operação: potência RF 1550 W, fluxo de Ar 1,05 L min⁻¹, tempo de permanência 100 ms. Ródio serviu como padrão interno. Medidas foram realizadas em triplicata.

Análise de sp-ICP-MS e Seu Cálculo

Análise sp-ICP-MS usou o mesmo instrumento com potência RF 1550 W, fluxo de Ar 1,05 L min⁻¹, tempo de permanência 10 ms e tempo total de execução de 30 s. Cálculos de tamanho de partícula empregaram a ferramenta de partícula única desenvolvida pelo RIKILT.

Concentração Crítica de Partículas para sp-ICP-MS

Soluções estoque de nAg (1,0 mg mL⁻¹) foram diluídas serialmente para produzir soluções de 2000, 800, 700 e 600 pg mL⁻¹, que foram diluídas dez vezes para gerar 40 concentrações distintas para avaliação por sp-ICP-MS.

Otimização de Métodos de Pré-Tratamento para Fígado de Camundongo

Homogeneizados de fígado foram preparados misturando tecido com salina fosfatada tamponada (PBS, p/v = 1:10) e homogeneizando. Cada homogeneizado foi espicado com 100 ng mL⁻¹ nAg e então tratado com um dos seguintes reagentes na proporção 1:1 v/v: 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, ou proteinase K (10 U mL⁻¹ em 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,5% SDS). Amostras foram incubadas por 3 h a 37 °C, resíduos coletados, pesados, e sobrenadantes diluídos 500 vezes para sp-ICP-MS.

Avaliação da Versatilidade do Pré-Tratamento com NaOH em Vários Órgãos

Tecidos de coração, pulmão, baço e rim foram homogeneizados em PBS (p/v = 1:10) e espicados com 100 ng mL⁻¹ nAg. Solução de 1 mol L⁻¹ NaOH foi adicionada na proporção 1:1 v/v, e amostras foram incubadas por 3 h a 37 °C. Resíduos foram pesados, e sobrenadantes diluídos 500 vezes para sp-ICP-MS.

Avaliação de Quantidade e Propriedades Físicas de nAg₁₀₀ e Ag⁺ em Camundongos Após Administração Intravenosa Única

nAg₁₀₀ e AgNO₃ foram diluídos a 0,25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) em 5% glicose. Camundongos receberam injeções intravenosas de nAg₁₀₀ (1,5 ou 0,75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1,5 ou 0,75 mg kg⁻¹ como Ag⁺), ou 5% glicose (controle). Vinte e quatro horas pós-injeção, amostras de sangue e fígado foram coletadas. Homogeneizados de fígado foram preparados em PBS (p/v = 1:10) e então tratados com TMAH ou NaOH (1:1 v/v) para análise por ICP-MS e sp-ICP-MS.

Resultados e Discussão

Otimização da Detecção de Partículas por sp-ICP-MS

sp-ICP-MS preciso requer que não mais de uma partícula entre no plasma durante cada tempo de permanência; caso contrário, múltiplas partículas são erroneamente somadas como um único evento, inflando estimativas de tamanho. Diluições seriais de nAg₁₀₀ foram feitas e contagens de partículas detectadas versus teóricas foram plotadas. Enquanto baixas concentrações produziram relação linear, concentrações mais altas renderam menos eventos detectados que o esperado, indicando interferência de múltiplas partículas (Fig. 1a). Subtraindo contagens detectadas das teóricas revelou que desvios tornaram-se significativos quando eventos detectados excederam 500, estabelecendo um limite prático para análise confiável (Fig. 1b).

Determinação do número ótimo de partículas por tempo de permanência para análise precisa por sp-ICP-MS. Uma série de soluções de nAg (600 fg mL⁻¹ a 2.500 pg mL⁻¹) foi analisada por sp-ICP-MS. a Para determinar a relação entre a concentração de nAg₁₀₀ e o número de partículas detectadas, uma curva para as partículas detectadas (linha sólida) e os valores teóricos (linha pontilhada) foram plotadas. b O número de partículas detectadas subtraído do valor teórico foi plotado no eixo vertical para determinar o número ótimo de partículas. Cada ponto é resultado de um único ensaio (n = 1)

Validação com nAg de diâmetros variados confirmou que as configurações de sp-ICP-MS produziram estimativas de tamanho precisas: diâmetros medidos de 30,0 ± 1,2 nm, 65,1 ± 0,6 nm e 97,4 ± 0,6 nm para nAg30, nAg70 e nAg100, respectivamente. Medições por espalhamento dinâmico de luz (DLS) (36,4 ± 1,6 nm, 70,6 ± 1,7 nm, 101 ± 1,0 nm) corresponderam de perto aos resultados de sp-ICP-MS, validando o protocolo analítico.

Otimização de Métodos de Pré-Tratamento para Detecção de nAg em Tecido Hepático de Camundongo

Pré-tratamento eficaz deve lisar tecido, recuperar ENPs sem alterar seu estado físico ou químico, e evitar ionização ou agregação. Comparamos cinco agentes solubilizantes — NaOH, TMAH, HNO₃, HCl e proteinase K — usando homogeneizados de fígado espicados com 100 ng mL⁻¹ nAg.

Análise de resíduos revelou que NaOH, TMAH e proteinase K dissolveram >90% da matriz hepática, enquanto HNO₃ e HCl dissolveram apenas ~75% (Fig. 2a). Dado que ~80% do tecido é água, a menor dissolução por reagentes ácidos indica remoção incompleta da matriz.

Dados de recuperação por sp-ICP-MS mostraram que tratamentos ácidos ionizaram completamente nAg, enquanto proteinase K ionizou parcialmente. Em contraste, NaOH e TMAH preservaram nAg como partículas intactas com detecção de íons desprezível (Fig. 2b). Análise de distribuição de tamanho indicou que tratamento com TMAH causou deslocamento de 100 nm para 120 nm e alargou a distribuição (Fig. 2c-d), sugerindo agregação. Tratamento com NaOH manteve o tamanho original de 100 nm (Fig. 2c-d), confirmando sua adequação.

Pré-tratamento com NaOH é o método ótimo para detectar nAg₁₀₀ em fígado de camundongo. Cinco reagentes solubilizantes foram testados como solventes de pré-tratamento para lisar tecidos (NaOH, TMAH, HNO₃, HCl e proteinase K). O homogeneizado hepático foi misturado com solução de nAg₁₀₀ para obter concentração final de Ag de 100 ng mL⁻¹ e tratado com cada reagente solubilizante a 37 °C. Após 3 h, a taxas de resíduo em cada grupo como indicador de solubilidade tecidual, b taxas de recuperação (barras pretas e brancas representam a taxa de prata detectada como partículas e como íons, respectivamente), c diâmetros médios de partículas mostrados em gráfico de barras, e d distribuição de tamanho de partículas mostrada em gráfico beeswarm foram analisados por sp-ICP-MS. Resultados expressos como média ± DP (n = 3)

A tendência do TMAH de aumentar a constante dielétrica através de decomposição em trimetilamina e metanol pode diminuir o potencial zeta de nAg, promovendo agregação. Exposição curta (1 min) a TMAH, no entanto, preservou o tamanho da partícula (~100 nm), confirmando que tratamento prolongado é responsável pela agregação.

Avaliação da Versatilidade do Pré-Tratamento com NaOH em Vários Órgãos

Para confirmar a ampla aplicabilidade do NaOH, aplicamos o protocolo a homogeneizados de coração, pulmão, baço e rim espicados com nAg. Análise de resíduos mostrou >95% de dissolução (Fig. 3a). sp-ICP-MS detectou o Ag adicionado como partículas em todos os tecidos, com taxas de recuperação dentro da faixa de 80–120% aceitável pelos padrões FDA (Fig. 3b). Diâmetros de partículas permaneceram próximos a 100 nm em todos os órgãos (Fig. 3c-d), ressaltando a consistência do método.

Pré-tratamento com NaOH é o método ótimo para detectar nAg₁₀₀ em vários órgãos. Como na Fig. 2, homogeneizados de coração, rim, pulmão e baço foram misturados com nAg₁₀₀ e incubados com solução de NaOH. Após 3 h, a taxas de resíduo (barras pretas e brancas representam taxas de resíduo em tratamento com NaOH ou PBS, respectivamente), b taxas de recuperação (barras pretas e brancas representam a taxa de Ag detectado como partículas e como íons, respectivamente), c diâmetros médios de partículas mostrados em gráfico beeswarm, e d distribuição de tamanho de partículas mostrada em gráfico beeswarm foram analisados por sp-ICP-MS em cada amostra tecidual. Resultados expressos como média ± DP (n = 3)

Esses dados coletivamente confirmam que o pré-tratamento com NaOH fornece uma plataforma robusta e reprodutível para quantificar e caracterizar nAg em diversos tecidos animais via sp-ICP-MS.

Avaliação de sp-ICP-MS para Análises Quantitativas e de Propriedades Físicas de nAg e Ag⁺ em Tecidos Biológicos

Para demonstrar relevância prática, comparamos o destino de nAg₁₀₀ versus Ag⁺ administrados intravenosamente em sangue e fígado de camundongos. ICP-MS confirmou presença de Ag em ambos os compartimentos para ambos os tratamentos (Fig. 4a,b). No entanto, sp-ICP-MS revelou especiação distinta: no sangue, Ag existiu predominantemente como íons (>95%) independentemente da forma administrada, enquanto no fígado, ~80% do Ag de nAg₁₀₀ permaneceu como partículas, com presença mínima de partículas após administração de Ag⁺ (Fig. 4c,d). Análise de tamanho de partícula de nAg₁₀₀ hepático mostrou diâmetro médio de ~80 nm, menor que os 100 nm administrados, refletindo ionização parcial e possível transformação no tecido hepático (Fig. 4e).

Quantificação simultânea e análises de propriedades físicas de nAg₁₀₀ e Ag⁺ administrados intravenosamente. nAg₁₀₀ e Ag⁺ foram administrados intravenosamente em camundongos (0,75 ou 1,5 mg kg⁻¹). Após 24 h, fígados e sangue foram coletados. Todas as amostras foram pré-tratadas com solução de NaOH. Concentração de Ag em a sangue e b fígado medidas por ICP-MS. nAg em c sangue e d fígado medidos por sp-ICP-MS. O diâmetro médio das partículas detectadas no fígado é mostrado em e. Resultados expressos como média ± EP (n = 3)

Conclusões

Estabelecemos um protocolo otimizado de pré-tratamento com NaOH que permite análise precisa de nanopartículas de prata em tecidos de camundongo por sp-ICP-MS, fornecendo quantificação simultânea e caracterização de tamanho de partícula. A aplicação deste fluxo de trabalho a nAg₁₀₀ e Ag⁺ administrados intravenosamente revelou que nAg ioniza parcialmente in vivo, com ~80% permanecendo particulado no fígado e ~95% ionizado na corrente sanguínea. Essas descobertas ressaltam a importância de contabilizar a conversão partícula-íon ao avaliar biodistribuição e cinética de ENPs. O método é amplamente aplicável a diversos tecidos e pode ser empregado em estudos de avaliação de risco para elucidar dinâmicas de exposição e respostas biológicas a ENPs.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Compartilhamento de dados não se aplica a este artigo, pois nenhum conjunto de dados foi gerado ou analisado durante o estudo atual.

Abreviações

Ag:

Prata

Ag⁺:

Íon prata

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

ENPs:

Nanopartículas projetadas

HCl:

Ácido clorídrico

HNO₃:

Ácido nítrico

ICP-MS:

Espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente

nAg:

Nanopartículas de prata

nAg₁₀₀:

nAg de 100 nm

nAg₃₀:

nAg de 30 nm

nAg₇₀:

nAg de 70 nm

NaOH:

Hidróxido de sódio

PBS:

Salina fosfatada tamponada

sp-ICP-MS:

ICP-MS de partícula única

TEM:

Microscópio eletrônico de transmissão

TMAH:

Hidróxido de tetrametilamônio