A regulação positiva do MicroRNA-410 ou a regulação negativa do Wnt-11 aumenta os osteoblastos e reduz os osteoclastos para aliviar a osteonecrose da cabeça femoral

Resumo

Histórico

Pouco se sabe sobre o papel funcional do microRNA-410 (miR-410) na osteonecrose da cabeça femoral (ONFH); portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar miR-410 direcionado a Wnt-11 para modular o mecanismo osteogênico e osteoclástico na prevenção de HNF.

Métodos

Quinze amostras de ONFH e 15 amostras normais foram coletadas. Foram observadas as alterações patológicas da cabeça femoral, osteoblastos e osteoclastos nas amostras clínicas. O modelo de rato de ONFH foi injetado com agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA ou oe-Wnt-11. MiR-410; Wnt-11; fatores relacionados a osteoblastos fosfatase alcalina (ALP), proteína gama-carboxiglutamato óssea (BGLAP) e expressão de Collα1; e fatores relacionados a osteoclastos fosfatase 5 ácida (ACP5), catepsina K (CTSK) e MMP9, bem como a expressão de Bcl-2 e Bax, foram testados por RT-qPCR e análise de western blot. O índice de função osteogênica ALP e OCN junto com o índice de função osteoclástica NTX-1 e CTX-1 no soro foi testado por ELISA.

Resultados

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 degradados, bem como Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aumentados em tecidos ONFH das amostras clínicas. O miR-410 regulado positivamente e o Wnt-11 regulado negativamente aumentaram a densidade mineral óssea (BMD) e BV / TV de ratos, aumentaram o nível de BMD da diáfise femoral, cabeça femoral e coluna vertebral, e também aumentaram os níveis séricos de cálcio e fósforo de ratos , enquanto a apoptose de osteócitos contida, aumentou a expressão de OCN, ALP, BGLAP e Collα1 e diminuiu a expressão de ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1 e MMP9 em ratos.

Conclusão

Este estudo sugeriu que a regulação positiva de miR-410 ou regulação negativa de Wnt-11 aumenta os osteoblastos e reduz os osteoclastos para aliviar a ocorrência de ONFH. Assim, miR-410 pode servir como um alvo potencial para o tratamento de ONFH.

Introdução

A osteonecrose da cabeça femoral (ONFH), como uma das doenças mais comuns que afetam as articulações do quadril, leva à dor intensa ou incapacidade articular e ocorre principalmente em indivíduos de meia-idade [1]. A terapia do ONFH adulto, que tem 8,12 milhões de pacientes na China, ainda é um desafio para os cirurgiões [2]. Muitos fatores de risco estão associados à ocorrência de ONFH, como hiperlipidemia, doenças autoimunes, distúrbios da coagulação, alcoolismo e hipercortisonismo [3]. O tratamento cirúrgico contém descompressão central com ou sem adjuvante, por exemplo, medula óssea autóloga, enquanto a artroplastia total do quadril (THR) mantém para paciente senil ou osteonecrose avançada que não é tratada por retenção articular [4]. No entanto, o ONFH tem um prognóstico insatisfatório em pacientes que freqüentemente requerem THR [5]. Portanto, há uma necessidade urgente de explorar um alvo terapêutico preciso para o tratamento de ONFH.

MicroRNAs (miRNAs) são os principais reguladores da função celular e da expressão gênica, que exercem uma enorme função na homeostase endotelial e podem ser um novo tratamento [6]. Um estudo relatou que o miR-410 foi encontrado para ser anormalmente expresso em vários tipos de câncer humano pernicioso e pode ser usado como um inibidor de tumor no endométrio, câncer de pulmão, mieloma e câncer de mama [7,8,9,10]. Outro estudo revelou que há um efeito neuroprotetor do miR-410 no modelo celular da doença de Parkinson induzido por 6-hidroxidopamina pela supressão da via de sinalização PTEN / AKT / mTOR [11]. Além disso, foi revelado que miR-410 modula comportamentos biológicos malignos de crianças com leucemia linfoblástica aguda por meio do direcionamento das vias de sinalização FKBP5 e AKT [12]. Um artigo também demonstrou o efeito inibitório do miR-410 direcionado à angiotensina II tipo 1 no câncer de pâncreas [13]. A proteína Wnt é um tipo de lipoglicoproteína secretada rica em cisteína, que exerce enorme função no desenvolvimento e na doença [14]. Wnt-11 pertence à via de sinalização Wnt e é um regulador positivo que desempenha papéis essenciais na carcinogênese [15]. Há um estudo relatando a significância clínica da expressão do antígeno do carcinoma espinocelular e Wnt11 no carcinoma cervical [16]. Além disso, foi apresentado que os sinais sinérgicos de TGF-β1 e Wnt11 conduzem a expressão de sm-α-actina no músculo liso por sinalização Rho quinase-actina-MRTF-A [17]. Com base na literatura acima, o objetivo do presente estudo foi investigar o papel do miR-410 regulando Wnt-11 na prevenção de ONFH, e uma hipótese é proposta de que miR-410 direcionado a Wnt-11 poderia modular os níveis osteogênico e osteoclástico mecanismo na prevenção de ONFH.

Materiais e métodos

Declaração de Ética

O estudo foi conduzido sob a aprovação do Comitê de Revisão Institucional do Hospital Beijing Shijitan, da Capital Medical University, e seguiu os princípios da Declaração de Helsinque. Os participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar deste estudo. Todos os experimentos com animais foram consistentes com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi autorizado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University.

Assuntos de estudo

Um total de 30 pacientes que são tratados no departamento de ortopedia do Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, de janeiro de 2017 a setembro de 2018 foram selecionados. Entre esses pacientes, 15 pacientes com ONFH foram tratados em cirurgia de THR, a idade mediana dos pacientes foi de 50,6 ± 4,3 anos e a massa corporal foi de 57,0 ± 5,6 kg com 7 homens e 8 mulheres (grupo ONFH). Outros 15 pacientes com fratura do colo do fêmur foram tratados com cirurgia de THR, a idade mediana foi 59,6 ± 3,3 anos, e a massa corporal foi de 50,0 ± 5,6 kg com 9 homens e 6 mulheres (grupo controle). Não houve diferença marcante em gênero, idade e peso entre os dois grupos ( P > 0,05), que era comparável. Os tecidos da área de necrose subcondral foram retirados por cinzelamento ao longo da linha longitudinal da cabeça femoral e armazenados a -80 ° C. Cada grupo foi examinado por patologia e biologia molecular, respectivamente.

Coloração com Hematoxilina-Eosina (HE)

As amostras foram fixadas com paraformaldeído 4% e descalcificadas com ácido etilenodiaminotetraacético 10%, sendo a solução de descalcificação substituída uma vez por semana. Foi observada a coloração da amostra de osso e medido o grau de descalcificação. Após a descalcificação completa, a amostra foi incluída em parafina e fatiada na espessura de 4 μm. As seções cozidas foram imersas em xileno I e xileno II por 10 min, por sua vez, e as seções desparafinadas foram imersas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, álcool 95%, álcool 80% e álcool 70% por 2 min, respectivamente. Em seguida, os cortes foram tingidos com hematoxilina por 3 min e diferenciados por álcool ácido clorídrico 1% por 2 min. A seguir, os cortes foram embebidos em álcool 50%, 70% e 80% por 2 min sucessivamente e imersos em eosina por 5 s. A seguir, os cortes foram imersos em álcool 95%, álcool absoluto I e álcool absoluto II por 3 min e, a seguir, imersos em xileno I e xileno II por 5 min, sucessivamente. Por fim, os cortes foram selados com goma neutra e examinados ao microscópio.

Coloração com Fosfatase Alcalina (ALP)

Uma seção foi selecionada em cada amostra e cozida a 60 ° C por 60 min. As seções de parafina foram desparafinadas por xileno I e xileno II por 15 min, respectivamente, e mergulhadas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80% e etanol 75% por 5 min, por sua vez, e limpo com água três destilada 2 min por três vezes. As seções foram descartadas com algum substrato líquido preparado no kit de tingimento ALP (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), fazendo com que o substrato líquido cubra completamente a amostra, em seguida, eclodido a 37 ° C evitando a luz por 15 min. A solução corante redundante foi descartada, e os cortes foram imediatamente gotejados com agente cromogênico A por 5 min e limpos com água tri-destilada por 30 s. Em seguida, os cortes foram tingidos com agente cromogênico B por 30 s e contrastados com reagente por 30 s. A fotografia foi obtida em microscópio óptico 200 ×, e o número de osteoblastos calculado por meio de sistema de análise de imagens por microscópio (Image-Proplus 6.0).

Coloração com fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP)

Uma seção foi selecionada para cada amostra e torrada a 60 ° C por 60 min. As seções de parafina foram desparafinadas por xileno I e xileno II por 15 min, e mergulhadas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80% e etanol 75% por 5 min por sua vez. Os cortes foram fixados com alguma solução fixadora preparada por 30 s. As seções foram inseridas na prateleira de tingimento e colocadas em uma caixa escura contendo solução de coloração TRAP recém-preparada (Sigma, St. Louis, MO, EUA), a solução de coloração deve ser completamente coberta com as seções e, em seguida, as seções foram chocadas em Vaso de banho-maria a 37 ° C por 1 h. Em seguida, as seções foram contrastadas com hematoxilina por 2 min e secas. Como a coloração TRAP deterioraria com o tempo, as seções seriam examinadas diretamente pelo microscópio sem lacrar. A imagem foi obtida em microscópio óptico 200 ×, e o número de osteoclastos contado por sistema de análise de imagens por microscópio (Image-Proplus 6.0).

Coloração imunohistoquímica

Após a descalcificação, os cortes foram incluídos em cera de parafina e fatiados com espessura de 4 μm. As seções foram desparafinadas por xileno convencional, desidratado com álcool gradiente, eclodido com 3% H ₂ O ₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EUA) a 7 ° C durante 30 min, e então fervida com tampão de ácido cítrico 0,01 M a 95 ° C durante 20 min. As seções foram bloqueadas com fluido de trabalho de soro de ovelha normal por 10 min, misturado com anticorpo primário Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) a 4 ° C durante a noite, anticorpo secundário (anticorpo secundário pronto para uso kit (PV-6000), ZSGB-Bio, Pequim, China) por 20 min, e fluido de trabalho de streptomyces ovalbumina marcado com peroxidase de rábano (SA / HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Pequim, China) por 2 min. As seções foram desenvolvidas por diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EUA), contrastadas com hematoxilina (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Xangai, China) e então seladas. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) substituiu o anticorpo primário como controle negativo (NC). No microscópio de luz, as células positivas foram localizadas com reagentes marrons no citoplasma, a expressão positiva forte foi amarelo acastanhado escuro, a expressão positiva fraca foi amarelo acastanhado claro e a expressão negativa não tem coloração. A coloração das células foi observada ao microscópio de luz, cinco campos de grande aumento (400 ×) foram observados para cada seção e 100 células foram contadas por campo. O valor médio foi o resultado da observação de cada seção. De acordo com a proporção e distribuição de células positivas, foi determinado da seguinte forma:negativo (-), coloração unicelular, células positivas menos de 5%; coloração fracamente positiva (+), espalhada ou de pequena massa celular, o número de células positivas foi de 5–24%; coloração de células positivas (++) em flocos ou cluster, o número de células positivas foi de 25–50%; e fortemente positiva (+++), coloração de células difusas, o número de células positivas foi superior a 50%. Os resultados da imunohistoquímica foram avaliados com pontuação duplo-cego por duas pessoas independentemente.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído de amostras de tecido pelo kit de extração Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). A concentração e a pureza do RNA foram determinadas. Os primers foram concebidos e compostos por Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japão) (arquivo adicional 1:Tabela S1). Em seguida, o RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando o kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). A solução de reação foi utilizada para PCR quantitativo de fluorescência, com referência às instruções de SYBR® Premix Ex Taq ^TM Kit II (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). A PCR quantitativa por fluorescência foi implementada no sistema ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, EUA). U6 foi o controle de carga de miR-410, e gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foram os parâmetros internos de Wnt-11, ALP, proteína óssea gama-carboxiglutamato (BGLAP), Collα1, fosfatase ácida resistente ao tartarato 5 (ACP5), catepsina K (CTSK), metalopeptidase de matriz (MMP) 9, Bcl-2 e Bax. Os níveis transcricionais relativos dos genes alvo foram calculados por 2 ^{- △△ Ct} método [18].

Análise de Western Blot

A proteína total foi abstraída dos tecidos da cabeça femoral. A concentração de proteína de cada amostra foi medida e o carregamento da amostra foi ajustado pela água desionizada para garantir que o tamanho era consistente. Foram preparados gel de separação de dodecilsulfato de sódio e gel espaçador (10%). Após banho de gelo e centrifugação, a amostra foi separada por eletroforese com a mesma quantidade de microamostrador, e a seguir a proteína do gel foi transferida para a membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose foi selada com leite em pó desnatado a 5% a 4 ° C durante a noite e misturada com o anticorpo primário Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), ALP (1:100, Sigma, St . Louis, MO, EUA), BGLAP, Collα1 e MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, EUA) e Bcl-2 e Bax (1:500, Proteintech, Chicago, EUA) e eclodiu durante a noite. E a amostra foi descartada com anticorpo secundário IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) rotulado por HRP e incubado por 1 h. A membrana foi imersa em uma solução de reação quimioluminescente aprimorada (Pierce, Rockford, IL, EUA) por 1 min. Após a retirada do líquido, a amostra foi coberta pelo filme de preservação de alimentos. Depois de desenvolvido e fixado, o resultado foi observado. GAPDH foi o parâmetro interno e a imagem da impressão da proteína foi analisada pelo software ImageJ2x.

Estabelecimento de modelos de ratos de ONFH

Foram selecionados 90 ratos machos Sprague-Dawley (SD) (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Xangai, China), pesando entre 300 ge 350 g. O ambiente foi fixado em 18–25 ° C e a umidade em 45–70%. Os ratos foram criados em gaiolas separadas, evitando barulho. Após 1 semana de alimentação adaptativa, experimentos de acompanhamento foram realizados.

O modelo foi estabelecido por ONFH traumático. Os métodos de modelagem foram os seguintes:ratos SD foram anestesiados com cavidade abdominal, seguido de remoção de pelos e preparação da pele. A pele do rato foi cortada, os tecidos foram separados e o ligamento redondo foi cortado após a exposição da cabeça femoral. O periósteo do pescoço femoral dos ratos foi raspado e o suprimento de sangue ao redor da cabeça do fêmur foi destruído. A cápsula articular, o músculo e a pele foram suturados camada por camada e esterilizados novamente.

Agrupamento de animais

Setenta ratos SD modelados com sucesso foram distribuídos em sete grupos, com 10 ratos em cada grupo:grupo ONFH; grupo agomir-NC (0,5 mL de agonista miR-410 NC (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) foi injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido de ONFH), grupo agomir-miR-410 (0,5 mL de agonista miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) foi injetado em torno da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido de ONFH), grupo siRNA-NC (NC de 0,4 mL Wnt silenciado Vetor -11 (contendo 1 × 10 ⁹ unidade formadora de placa (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) foi injetada em torno da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido de ONFH), grupo Wnt-11-siRNA (0,4 mL silenciado vetor Wnt-11 (contendo 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) foi injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido de ONFH), grupo agomir-miR-410 + superexpresso (OE) -NC (0,5 mL de agonista miR-410 e NC do vetor Wnt-11 regulado positivamente de 0,4 mL (contendo 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) foi injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido de ONFH), e o grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 mL de agonista miR-410 e 0,4 mL do vetor Wnt-11 regulado positivamente (contendo 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) foi injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após o estabelecimento bem-sucedido do ONFH). Enquanto isso, o grupo normal (apenas solução salina foi injetada na cavidade abdominal, 10 ratos) foi definido como controle. Após 4 semanas de ONFH, micro-CT, análise osteonométrica, observação de raios-X, densitometria óssea e determinação dos níveis séricos de cálcio e fósforo foram realizados.

Teste Micro-CT e Análise Osteonométrica

A cabeça femoral direita dos ratos foi colocada na máquina de micro-TC (General Electric (GE) Company, Massachusetts, EUA), e o fantoma padrão equipado aleatoriamente também foi escaneado. Os parâmetros de varredura são os seguintes:resolução 27 μm × 27 μm × 27 μm, corrente de varredura 450 mA, tensão de varredura 80 kV e tempo de varredura única 88 min. A microestrutura da cabeça femoral do rato foi observada em detalhes. Após a calibração à luz da especificação, três regiões cubóides de interesse (ROI) foram selecionadas aleatoriamente de diferentes grupos de ratos para reconstrução (0,5 × 0,5 × 0,5 cm ³ ) O processamento das imagens foi realizado no software da máquina GE Microview, e o ROI foi reconstruído e analisado por metrologia óssea. Os parâmetros de densidade mineral óssea (DMO) e fração de volume ósseo (VB / VT) foram selecionados.

Observação por raios-X, determinação da DMO e determinação do nível de cálcio e fósforo no soro

Quatro semanas após a operação, os ratos de cada grupo foram injetados via abdômen com hidrato de cloral a 10%. Após a anestesia, os ratos foram colocados em decúbito dorsal horizontal e os membros fixados e posteriormente examinados por meio de radiografia. Foi observada a alteração da forma e densidade da cabeça femoral. A densidade óssea da coluna vertebral femoral esquerda, cabeça femoral e coluna vertebral foi testada por um instrumento de medição de densidade óssea de raio-X de dupla energia. Quatro semanas após a operação, os ratos de cada grupo jejuaram por 12 horas antes da coleta de sangue. As amostras de sangue (5 mL) foram coletadas através do coração pela manhã e colocadas em um tubo de coagulação aspirado. O soro foi separado por centrifugação a 3000 r / min por 15 min. Os níveis séricos de cálcio e fósforo foram medidos por um analisador bioquímico automático.

Observação microscópica eletrônica

A massa de tecido ósseo do rato foi fixada com glutaraldeído 3,5%, descalcificada com solução de ácido clorídrico a 5% e ácido ósmico a 1%, a seguir desidratada com gradiente de acetona, duplamente tingida com acetato de urânio e ácido cítrico e, por último, incorporada com Epon-61. Após o preparo da seção semi-fina, a seção ultrafina foi observada ao microscópio eletrônico de transmissão.

Ensaio de marcação final de dUTP-biotina mediada por TdT (TUNEL)

As seções embebidas em parafina foram pré-tratadas com desparafinação convencional e desidratação. As seções foram incubadas com pepsina (solução de ácido clorídrico 0,25 ~ 0,5%) por 25 min, em seguida, gotejadas com 50 μL de solução mista de reação TUNEL e eclodidas em uma caixa úmida por 60 min, e descartadas com 50 μL de agente peroxidase e incubadas em um caixa úmida por 30 min. As secções foram desenvolvidas com reagente DAB, independentemente de as secções serem coloridas e observadas ao microscópio. As seções foram adicionadas com água para parar de desenvolver e coradas com hematoxilina por 2 min. Em seguida, as seções foram mergulhadas em etanol 95% I – II, etanol absoluto I – II por 3–5 min, respectivamente, xileno I – II por 3–5 min e seladas com goma neutra. Os resultados foram analisados ​​ao microscópio óptico.

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

Após os ratos serem anestesiados, o sangue da artéria da coxa foi retirado e as amostras de soro coletadas por centrifugação após 1 hora de repouso. Com base na especificação do kit ELISA (Shanghai enzima-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), sete poços padrão foram adicionados com vários padrões de concentração (100 μL), por sua vez, os poços em branco foram anexados com 100 μL solução de diluição padrão e os poços restantes foram anexados com 100 μL de amostra a ser testada. A placa de enzima foi revestida com filme e colocada por 1 hora, e então o líquido foi descartado. Uma solução (100 μL) foi anexada a todos os poços, e a placa de enzima foi coberta com o filme por 1 h. Após a lavagem, 100 μL de solução B foram adicionados a todos os poços e a placa de enzima foi coberta com o filme por 30 min. Em seguida, a solução de substrato de tetrametilbenzidina (90 μL) foi adicionada, a placa de enzima foi coberta com o filme por 10–20 min e 50 μL de solução de terminação foi anexada a todos os poços. O valor de densidade óptica (DO) de cada poço foi medido por um leitor de microplaca e a concentração real da amostra foi enumerada.

Ensaio do gene Dual Luciferase Reporter

Os sítios de ligação e a relação do alvo de miR-410 e Wnt-11 3 ′ região não traduzida (UTR) foram previstos usando o software de bioinformática http://www.targetscan.org. A sequência da região do promotor Wnt-11 3′UTR contendo o sítio de ligação miR-410 foi composta e inserida em pMIR-REPORT ^TM Plasmídeo do vetor luciferase (Ambion, Company, Austin, TX, EUA) para a formulação do plasmídeo de tipo selvagem Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-WT). E o plasmídeo mutante Wnt-11 3′UTR (Wnt-11-MUT) foi construído com base no plasmídeo e no local de ligação da mutação. Siga as etapas do kit de extração de plasmídeo adquirido (Promega, Madison, Wisconsin, EUA) e as células logarítmicas foram semeadas nas placas de 96 poços. Quando a confluência de células era de cerca de 70%, Lipofectamine 2000 foi adotado para transfecção. Wnt-11-WT e Wnt-11-MUT foram misturados com mímicos NC e mímicos miR-410 (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Xangai, China), respectivamente, e então co-transfectados para células T 293. As células foram acumuladas e lisadas após transfectadas 48 h, e a atividade da luciferase foi testada pelo kit de detecção de luciferase (BioVision, San Francisco, CA, EUA) e luminômetro Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, EUA).

Análise estatística

Todos os dados foram processados ​​pelo software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA). Os dados de medição foram transmitidos por média ± desvio padrão. A análise de variância unilateral (ANOVA) foi conduzida para comparações de múltiplos grupos e o t teste para comparações de dois grupos e diferença mínima significativa de Fisher t teste (LSD-t) foi utilizado após ANOVA. P valor <0,05 era indicativo de uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Alterações patológicas em tecidos ONFH de amostras clínicas

A coloração HE foi adotada para observar as alterações patológicas da cabeça do fêmur no grupo com fratura do colo do fêmur (grupo controle) e no grupo ONFH; os resultados relataram que, no grupo controle, a densidade trabecular óssea estava bem distribuída e a estrutura estava íntegra. Enquanto no grupo ONFH, havia muitas lacunas ósseas vazias no cerebelo ósseo, com células ósseas diminuídas e trabéculas ósseas alteradas continuamente. Além disso, havia muitas outras hiperplasia de tecido ao redor do cerebelo ósseo (Fig. 1a).

Alterações patológicas em tecidos ONFH de amostras clínicas. a Resultados da coloração HE em cada grupo (200 ×). b Resultados da coloração TRAP e a contagem de células positivas para TRAP em cada grupo (200 ×). c Os resultados da coloração de ALP e contagem de células ALP positivas em cada grupo (400 ×). * P <0,05 vs. o grupo de controle

A coloração TRAP revelou que TRAP foi encontrado principalmente em osteoclastos e frequentemente usado para identificar osteoclastos maduros em amaranto. Em comparação com o grupo de controle, o número de osteoclastos positivos para TRAP no grupo ONFH aumentou, a morfologia dos osteoclastos era diversa e as células eram grandes com aparência multinuclear. Defeitos ósseos óbvios foram observados no cerebelo ósseo adjacente aos osteoclastos, que mostraram reabsorção óssea (fig. 1b).

O resultado da coloração com ALP mostrou que a ALP foi uma enzima marcadora da diferenciação e maturação dos osteoblastos, que participou da regulação da calcificação da maturação da matriz óssea. Portanto, a expressão de ALP foi comumente usada para identificar osteoblastos. Partículas marrons ou de café podem ser vistas no citoplasma de osteoblastos maduros. Em relação ao grupo controle, o número de osteoblastos ALP positivos diminuiu no grupo ONFH (fig. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 degradados e Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aprimorados em tecidos ONFH das amostras clínicas

A análise de Western blot e RT-qPCR demonstraram que a expressão de miR-410 no grupo ONFH diminuiu em relação ao grupo de controle, enquanto a expressão de Wnt-11 aumentou; a expressão de fatores relacionados a osteoblastos ALP, BGLAP e Collα1 degradados; e a expressão de fatores relacionados a osteoclastos ACP5, CTSK e MMP9 ascendeu (todos P <0,05) (Fig. 2a – c).

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 diminuíram e Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aumentaram em tecidos ONFH de amostras clínicas. a Detecção de miR-410, Wnt-11 e genes relacionados a osteoblastos e osteoclastos por RT-qPCR. b Wnt-11 e proteínas relacionadas a osteoblastos e osteoclastos detectadas por análise de western blot. c Bandas de proteínas de Wnt-11 e proteínas relacionadas a osteoblastos e osteoclastos. d Expressão de Wnt11 (400 ×) e comparação da taxa de proteína Wnt11 positiva detectada por coloração imunohistoquímica. * P <0,05 vs. o grupo de controle

A expressão de Wnt-11 foi testada por imunohistoquímica e os resultados mostraram que a proteína Wnt-11 foi expressa principalmente no citoplasma, sendo a expressão positiva basicamente amarelo acastanhado ou marrom. Em contraste com o grupo de controle, a taxa positiva de expressão da proteína Wnt-11 no grupo ONFH foi aumentada ( P <0,05) (Fig. 2d).

miR-410 regulado positivamente e Wnt-11 regulado para baixo elevam a BMD e BV / TV de ratos

A micro-TC sugeriu que, no grupo normal, a aparência da cabeça femoral era redonda, a espessura do colo era uniforme e a estrutura das trabéculas ósseas era contínua e uniformemente distribuída. A cabeça femoral dos ratos do grupo ONFH, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 colapsou gradualmente, a área de reabsorção óssea apareceu gradualmente, o colo dos fêmures tornou-se mais fino , e as trabéculas ósseas foram quebradas e a continuidade destruída. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a aparência dos ratos permaneceu intacta, nenhum colapso ocorreu, nenhuma área óbvia de reabsorção óssea apareceu, as trabéculas ósseas estavam dispostos normalmente e a estrutura estava completa (Fig. 3a).

O miR-410 altamente expresso e o Wnt-11 mal expresso aumentam a DMO e a VB / TV de ratos. a Resultados de micro-CT de ratos em cada grupo. b Resultados da análise de BMD. c Resultados da análise de BV / TV. * P <0,05 vs. o grupo normal. ⁺ P <0,05 vs. o grupo agomir-NC. ^# P <0,05 vs. o grupo siRNA-NC. ^e P <0,05 vs. o grupo agomir-miR-410 + OE-NC

Os resultados da metrologia óssea relataram que, em contraste com o grupo normal, o BMD e BV / TV no grupo ONFH estavam deprimidos (ambos P <0,05). Em relação ao grupo agomir-NC e ao grupo siRNA-NC, a BMD e BV / TV aumentaram no grupo agomir-miR-410 e no grupo Wnt-11-siRNA (todos P <0,05). Em comparação com o grupo agomir-miR-410 + OE-NC, o BMD e BV / TV no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 foi descartado (ambos P <0,05) (Fig. 3b, c).

Superexpressão de miR-410 e má expressão de Wnt-11 aumentam os níveis de DMO do eixo femoral, cabeça femoral e coluna vertebral, e também do aumento do cálcio sérico e níveis de fósforo de ratos

A radiografia observou que o aspecto da cabeça femoral no grupo normal era redondo, a densidade da cabeça femoral uniforme e a estrutura completa. No grupo ONFH, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt11, a aparência da cabeça femoral dos ratos tornou-se mais fina e apareceu a área de reabsorção óssea. A aparência era uniforme e a espessura da cabeça femoral dos ratos estava completa no grupo agomir-miR-410, grupo Wnt11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + grupo OE-NC (Fig. 4a).

Upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increase the bone mineral density level of the femoral shaft, femoral head, and spinal column, and also raise the serum calcium and phosphorus levels of rats. a Animal X-ray observation results. b Comparison of the bone mineral density of the femoral shaft, femoral head, and spine in each group. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).

Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes

The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).

Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. a Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). b Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). d Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. e Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. f , g Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).

The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).

Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0.05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).

Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts

TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).

Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. a Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). b Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). d Count of positive cells determined by ALP staining. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).

By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0.05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).

Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats

The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).

Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. a Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. b Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0.05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0.05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).

Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410

The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.

Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. a Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. b Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. d , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. f Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). g Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0.05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0.05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0.05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).

>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0.05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0.05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).

Discussion

ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].

In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].

Conclusion

In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.

Disponibilidade de dados e materiais

Not applicable

Histórico de alterações

Abreviações

ALP:

Alkaline phosphatase

ANOVA:

Analysis of variance

BMD:

Bone mineral density

EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxylin-eosin

LSD-t:

Least significant difference t teste

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Controle negativo

OD:

Densidade ótica

ONFH:

Osteonecrosis of femoral head

PBS:

Salina tamponada com fosfato

ROI:

Regions of interest

RT-qPCR:

Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

THR:

Total hip replacement

TRAP:

Tartrate resistant acid phosphatase

TUNEL:

TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling

Transmissão ultrafina de banda larga Quarter Waveplate com matriz de orifício retangular baseada em ressonâncias plasmônicas Fabricação fácil de nanocompósitos mesoestruturados de borracha natural / sílica com estabilidade térmica e hidrofobicidade aprimoradas