Regulação da Formação Óssea e Inibição de Osteoclastos via Alvo miR-410/Wnt-11 no Tratamento da Osteonecrose da Cabeça Femoral

Resumo

Contexto

Pouco se sabe sobre o papel funcional do microRNA-410 (miR-410) na osteonecrose da cabeça femoral (ONCF); portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar o miR-410 alvo Wnt-11 para modular os mecanismos osteogênicos e osteoclásticos na prevenção da ONCF.

Métodos

Foram reunidas 15 amostras de ONCF e 15 amostras normais. As alterações patológicas da cabeça femoral, osteoblastos e osteoclastos nas amostras clínicas foram observadas. O modelo de rato de ONCF foi injetado com agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA ou oe-Wnt-11. MiR-410; Wnt-11; fatores relacionados a osteoblastos fosfatase alcalina (ALP), proteína gama-carboxiglutamato óssea (BGLAP) e expressão de Collα1; e fatores relacionados a osteoclastos fosfatase ácida 5 (ACP5), catepsina K (CTSK) e MMP9, bem como expressão de Bcl-2 e Bax, foram testados por RT-qPCR e western blot. O índice de função osteogênica ALP e OCN junto com índice de função osteoclastogênica NTX-1 e CTX-1 no soro foi testado por ELISA.

Resultados

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 degradaram-se, bem como Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aumentaram nos tecidos de ONCF das amostras clínicas. MiR-410 upregulado e Wnt-11 downregulado aumentaram a densidade mineral óssea (DMO) e BV/TV de ratos, elevaram o nível de DMO do fêmur, cabeça femoral e coluna vertebral, e também aumentaram os níveis séricos de cálcio e fósforo dos ratos, enquanto restringiram a apoptose de osteócitos, elevaram expressão de OCN, ALP, BGLAP e Collα1 e reduziram expressão de ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1 e MMP9 nos ratos.

Conclusão

Este estudo sugeriu que upregulação do miR-410 ou downregulação do Wnt-11 aumenta osteoblastos e reduz osteoclastos para aliviar a ocorrência de ONCF. Assim, miR-410 pode servir como alvo potencial para o tratamento de ONCF.

Introdução

A osteonecrose da cabeça femoral (ONCF), como uma das doenças mais comuns afetando as articulações do quadril, leva a dor severa ou incapacidade articular e ocorre principalmente em indivíduos de meia-idade [1]. O tratamento da ONCF em adultos, que tem 8,12 milhões de pacientes na China, ainda é um desafio para cirurgiões [2]. Muitos fatores de risco estão associados à ocorrência de ONCF, como hiperlipidemia, doenças autoimunes, distúrbios de coagulação, alcoolismo e hipercortisonismo [3]. O tratamento cirúrgico contém descompressão central com ou sem adjuvante, por exemplo, medula óssea autólogo, enquanto a artroplastia total do quadril (ATQ) reserva-se para pacientes idosos ou osteonecrose avançada não tratada por preservação articular [4]. No entanto, a ONCF tem prognóstico insatisfatório naqueles pacientes frequentemente requerendo ATQ [5]. Portanto, há necessidade urgente de explorar um alvo terapêutico preciso para o tratamento de ONCF.

MicroRNAs (miRNAs) são principais reguladores da função celular e expressão gênica, que exercem enorme função na homeostase endotelial e podem ser novo tratamento [6]. Um estudo relatou que miR-410 tem sido encontrado anormalmente expresso em vários tipos de câncer humano perniciosos e pode ser usado como inibidor tumoral em câncer endometrial, pulmonar, mieloma e mama [7-10]. Outro estudo revelou que há efeito neuroprotetor do miR-410 no modelo celular de Parkinson induzido por 6-hidroxidopamina suprimindo via de sinalização PTEN/AKT/mTOR [11]. Além disso, miR-410 foi revelado modular comportamentos biológicos malignos de crianças com leucemia linfoblástica aguda via alvo FKBP5 e vias de sinalização AKT [12]. Um artigo também demonstrou efeito inibitório do miR-410 alvo receptor de angiotensina II tipo 1 em câncer pancreático [13]. Proteína Wnt é um tipo de glicolipoproteínas secretadas ricas em cisteína, que exerce enorme função no desenvolvimento e doença [14]. Wnt-11 pertence à via de sinalização Wnt e é um regulador positivo que desempenha papéis fundamentais na carcinogênese [15]. Há estudo relatado a significância clínica da expressão de antígeno de carcinoma de células escamosas e Wnt11 em carcinoma cervical [16]. Além disso, foi apresentado que sinais sinérgicos TGF-β1 e Wnt11 impulsionam a expressão de sm-α-actina no músculo liso pela sinalização Rho quinase-actina-MRTF-A [17]. Baseado na literatura acima, o objetivo do presente estudo foi investigar o papel do miR-410 regulando Wnt-11 na prevenção de ONCF, e uma hipótese é proposta que miR-410 alvo Wnt-11 poderia modular os mecanismos osteogênicos e osteoclásticos na prevenção de ONCF.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O estudo foi conduzido sob aprovação do Comitê de Revisão Institucional do Hospital Beijing Shijitan, Universidade Médica Capital, e seguiu os preceitos da Declaração de Helsinki. Participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar deste estudo. Todos os experimentos com animais foram consistentes com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi permitido pelo Comitê de Ética de Experimentos com Animais do Hospital Beijing Shijitan, Universidade Médica Capital.

Sujeitos do Estudo

Um total de 30 pacientes tratados no departamento de ortopedia do Hospital Beijing Shijitan, Universidade Médica Capital, de janeiro de 2017 a setembro de 2018 foram selecionados. Entre estes pacientes, 15 com ONCF foram tratados com cirurgia ATQ, a idade mediana foi 50,6 ± 4,3 anos, e massa corporal 57,0 ± 5,6 kg com 7 homens e 8 mulheres (grupo ONCF). Outros 15 pacientes com fratura do colo femoral foram tratados com cirurgia ATQ, idade mediana 59,6 ± 3,3 anos, massa corporal 50,0 ± 5,6 kg com 9 homens e 6 mulheres (grupo controle). Não houve diferença marcante em gênero, idade e peso entre os dois grupos (P > 0,05) sendo comparáveis. Os tecidos na área necrótica subcondral foram obtidos por cinzelamento ao longo da linha longitudinal da cabeça femoral e armazenados a −80 °C. Cada grupo foi examinado por patologia e biologia molecular, respectivamente.

Coloração Hematoxilina-Eosina (HE)

As amostras foram fixadas com 4% paraformaldeído e descalcificadas por 10% ácido etilenodiaminotetraacético, e a solução de descalcificação foi substituída semanalmente. A cor da amostra óssea foi observada e o grau de descalcificação medido. Após descalcificação completa, a amostra foi incluída em parafina e fatiada com espessura de 4 μm. As seções assadas foram imersas em xilol I e xilol II por 10 min cada, e as seções desparafinizadas foram imersas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, 95% álcool, 80% álcool e 70% álcool por 2 min, respectivamente. Então as seções foram coradas com hematoxilina por 3 min e diferenciadas por 1% álcool clorídrico por 2 min. Em seguida, as seções foram imersas em 50%, 70% e 80% álcool por 2 min cada e imersas em eosina por 5 s. Depois, as seções foram imersas em 95% álcool, álcool absoluto I e álcool absoluto II por 3 min e então imersas em xilol I e xilol II por 5 min cada. Finalmente, as seções foram seladas com goma neutra e examinadas por microscópio.

Coloração Fosfatase Alcalina (ALP)

Uma seção foi selecionada em cada amostra e assada a 60 °C por 60 min. As seções de parafina foram desparafinizadas por xilol I e xilol II por 15 min cada, e mergulhadas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, 95% etanol, 90% etanol, 80% etanol e 75% etanol por 5 min cada, e lavadas com água destilada tripla 2 min por três vezes. As seções foram gotejadas com algum líquido substrato preparado em kit de coloração ALP (Instituto de Bioengenharia NanJing JianCheng, Nanjing, China), fazendo o líquido substrato cobrir completamente a amostra, então incubadas a 37 °C evitando luz por 15 min. A solução de corante redundante foi descartada, e as seções foram imediatamente gotejadas com agente cromogênico A por 5 min e lavadas com água destilada tripla por 30 s. Então as seções foram coradas com agente cromogênico B por 30 s e contra-coradas com reagente por 30 s. A fotografia foi obtida sob microscópio óptico 200×, e o número de osteoblastos foi contado via sistema de análise de imagem para microscópio (Image-Proplus 6.0).

Coloração Fosfatase Ácida Resistente ao Tartrato (TRAP)

Uma seção foi selecionada para cada amostra e assada a 60 °C por 60 min. As seções de parafina foram desparafinizadas por xilol I e xilol II por 15 min, e mergulhadas em álcool absoluto I, álcool absoluto II, 95% etanol, 90% etanol, 80% etanol e 75% etanol por 5 min cada. As seções foram fixadas com alguma solução fixadora preparada por 30 s. As seções foram inseridas no suporte de coloração e colocadas em caixa escura contendo solução de coloração TRAP recém-preparada (Sigma, St. Louis, MO, EUA), a solução de coloração deve cobrir completamente as seções, e então as seções foram incubadas em banho-maria a 37 °C por 1 h. Em seguida, as seções foram contra-coradas com hematoxilina por 2 min e secas. Como a coloração TRAP decairia com o tempo, as seções seriam examinadas diretamente pelo microscópio sem selagem. A imagem foi obtida sob microscópio óptico 200×, e o número de osteoclastos foi contado por sistema de análise de imagem para microscópio (Image-Proplus 6.0).

Coloração Imuno-histoquímica

Após descalcificação, as seções foram incluídas em cera de parafina e fatiadas com espessura de 4 μm. As seções foram desparafinizadas por xilol convencional, desidratadas com álcool gradiente, incubadas com 3% H₂O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EUA) a 7 °C por 30 min, e então fervidas com tampão citrato 0,01 M a 95 °C por 20 min. As seções foram bloqueadas com soro de ovelha normal fluido de trabalho por 10 min, misturadas com anticorpo primário Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) a 4 °C durante a noite, anticorpo secundário (kit anticorpo secundário ready-to-use (PV-6000), ZSGB-Bio, Pequim, China) por 20 min, e fluido de trabalho estreptavidina peroxidase marcada (S-A/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Pequim, China) por 2 min. As seções foram desenvolvidas por diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO, EUA), contra-coradas com hematoxilina (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China), e então seladas. Salina fosfatada tamponada (PBS) substituiu o anticorpo primário como controle negativo (NC). Sob microscópio de luz, as células positivas foram localizadas com reagentes marrons no citoplasma, a forte expressão positiva foi marrom escuro, a fraca expressão positiva foi marrom claro, e a expressão negativa não tem coloração. A coloração das células foi observada sob microscópio de luz, cinco campos de alta potência (400×) foram observados para cada seção, e 100 células foram contadas por campo. O valor médio foi o resultado de observação de cada seção. De acordo com a proporção e distribuição de células positivas, foi determinado como segue: negativo (−), coloração de célula única, células positivas menos de 5%; fracamente positivo (+), coloração dispersa ou pequena massa celular, número de células positivas 5-24%; positivo (++), coloração em lâmina ou aglomerado celular, número de células positivas 25-50%; e fortemente positivo (+++), coloração difusa celular, número de células positivas mais de 50%. Os resultados de imuno-histoquímica foram avaliados com pontuação cega dupla por duas pessoas independentemente.

Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído de amostras de tecido por kit de extração Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). A concentração e pureza do RNA foram determinadas. Primers foram desenhados e compostos por Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japão) (Arquivo adicional 1: Tabela S1). Então RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). A solução de reação foi utilizada para PCR quantitativo de fluorescência, com referência às instruções do kit SYBR® Premix Ex Taq^TM II (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). O PCR quantitativo de fluorescência foi implementado em sistema ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Massachusetts, EUA). U6 foi o controle de carga do miR-410, e gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foi o parâmetro interno de Wnt-11, ALP, proteína gama-carboxiglutamato óssea (BGLAP), Collα1, fosfatase ácida resistente ao tartrato 5 (ACP5), catepsina K (CTSK), metaloproteinase de matriz (MMP)9, Bcl-2 e Bax. Os níveis transcripcionais relativos dos genes alvo foram calculados pelo método 2^−△△Ct [18].

Análise por Western Blot

A proteína total foi extraída dos tecidos da cabeça femoral. A concentração de proteína de cada amostra foi medida e a carga da amostra ajustada pela água desionizada para garantir tamanho consistente. Gel de separação de dodecil sulfato de sódio e gel espaçador (10%) foram preparados. Após banho de gelo e centrifugação, a amostra foi separada por eletroforese com mesma quantidade de microamostrador, e então a proteína no gel foi transferida para membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose foi selada com 5% leite em pó desnatado a 4 °C durante a noite e misturada com anticorpos primários Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), ALP (1:100, Sigma, St. Louis, MO, EUA), BGLAP, Collα1 e MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, EUA), e Bcl-2 e Bax (1:500, Proteintech, Chicago, EUA) e incubadas durante a noite. E a amostra foi gotejada com anticorpo secundário IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) marcado por HRP e incubado por 1 h. A membrana foi imersa em solução de reação de quimioluminescência reforçada (Pierce, Rockford, IL, EUA) por 1 min. Após remover o líquido, a amostra foi coberta por filme de preservação de alimentos. Após revelação e fixação, o resultado foi observado. GAPDH foi o parâmetro interno, e a imagem de impressão de proteína foi analisada pelo software ImageJ2x.

Estabelecimento de Modelos de Rato de ONCF

Noventa ratos Sprague-Dawley (SD) machos (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China), pesando entre 300 g e 350 g, foram selecionados. O ambiente foi definido a 18-25 °C e umidade 45-70%. Ratos foram criados em gaiolas separadas evitando ruído. Após 1 semana de alimentação adaptativa, experimentos de acompanhamento foram realizados.

O modelo foi estabelecido por ONCF traumática. Os métodos de modelagem foram os seguintes: ratos SD foram anestesiados por cavidade abdominal, seguidos por remoção de pelos e preparação da pele. A pele do rato foi cortada, os tecidos separados, e o ligamento redondo cortado após exposição da cabeça femoral. Periosteo do colo femoral de ratos foi raspado, e o suprimento sanguíneo ao redor da cabeça femoral foi destruído. A cápsula articular, músculo e pele foram suturados camada por camada e esterilizados novamente.

Agrupamento dos Animais

Setenta ratos SD modelados com sucesso foram distribuídos em sete grupos, com 10 ratos em cada grupo: grupo ONCF; grupo agomir-NC (0,5 mL de agonista NC de miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF), grupo agomir-miR-410 (0,5 mL de agonista miR-410 (200 nM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF), grupo siRNA-NC (NC de 0,4 mL vetor Wnt-11 silenciado (contendo 1 × 10⁹ unidade formadora de placa (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF), grupo Wnt-11-siRNA (0,4 mL vetor Wnt-11 silenciado (contendo 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF), grupo agomir-miR-410 + superexpressão (OE)-NC (0,5 mL de agonista miR-410 e NC de 0,4 mL vetor Wnt-11 upregulado (contendo 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF), e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 mL de agonista miR-410 e 0,4 mL vetor Wnt-11 upregulado (contendo 1 × 10⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) injetado ao redor da articulação do quadril 1 semana após estabelecimento bem-sucedido de ONCF). Simultaneamente, grupo normal (apenas salina injetada na cavidade abdominal, 10 ratos) foi definido como controle. Após 4 semanas de ONCF, micro-CT, análise osteométrica, observação por raio-X, densitometria óssea e determinação de níveis séricos de cálcio e fósforo foram realizadas.

Teste Micro-CT e Análise Osteométrica

A cabeça femoral direita dos ratos foi colocada na máquina micro-CT (General Electric (GE) Company, Massachusetts, EUA), e o fantasma padrão aleatoriamente equipado também foi escaneado. Os parâmetros de escaneamento são: resolução 27 μm × 27 μm × 27 μm, corrente de escaneamento 450 mA, tensão de escaneamento 80 kV, e tempo de escaneamento único 88 min. A microestrutura da cabeça femoral do rato foi observada em detalhes. Após calibração conforme especificação, três regiões de interesse (ROI) paralelepípedas foram selecionadas aleatoriamente de diferentes grupos de ratos para reconstrução (0,5 × 0,5 × 0,5 cm³). O processamento de imagem foi realizado com software GE Microview da máquina, e o ROI foi reconstruído e analisado por osteometria. Os parâmetros de densidade mineral óssea (DMO) e fração de volume ósseo (BV/TV) foram selecionados.

Observação por Raio-X, Determinação de DMO e Determinação de Níveis Séricos de Cálcio e Fósforo

Quatro semanas após a operação, os ratos em cada grupo foram injetados via abdômen com 10% hidrato de cloral. Após anestesia, os ratos foram colocados em posição supina, e os membros fixados e então examinados por fotografia de raio-X. A mudança de forma e densidade da cabeça femoral foi observada. A densidade óssea do fêmur, cabeça femoral e coluna foi testada por instrumento de densitometria óssea de dupla energia. A 4 semanas após a operação, os ratos em cada grupo jejuaram por 12 h antes da coleta de sangue. As amostras de sangue (5 mL) foram coletadas através do coração pela manhã e colocadas em tubo de coagulação a vácuo limpo. O soro foi separado por centrifugação a 3000 r/min por 15 min. Os níveis séricos de cálcio e fósforo foram medidos por analisador bioquímico automático.

Observação por Microscopia Eletrônica

A massa de tecido ósseo do rato foi fixada com 3,5% glutaraldeído, descalcificada com solução de ácido clorídrico 5% e ácido osmico 1%, então desidratada com acetona gradiente, dupla-corada com acetato de urânio e ácido cítrico, e por fim, incluída com Epon-61. Após preparação da seção semi-fina, a seção ultra-fina foi observada por microscópio eletrônico de transmissão.

Ensaio TdT-Mediado dUTP-Biotina Marcação de Extremidade Nick (TUNEL)

As seções incluídas em parafina foram pré-tratadas com desparafinização e desidratação convencionais. As seções foram incubadas com pepsina (solução de ácido clorídrico 0,25~0,5%) por 25 min, então gotejadas com 50 μL solução mista de reação TUNEL e incubadas em caixa úmida por 60 min, e gotejadas com 50 μL agente-peroxidase e incubadas em caixa úmida por 30 min. As seções foram desenvolvidas com reagente DAB, se as seções foram coloridas e observadas sob microscópio. As seções foram adicionadas com água para parar desenvolvimento e coradas com hematoxilina por 2 min. Então as seções foram mergulhadas em 95% etanol I-II, etanol absoluto I-II por 3-5 min cada, xilol I-II por 3-5 min e seladas com goma neutra. Os resultados foram analisados sob microscópio de luz.

Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

Após os ratos serem anestesiados, o sangue da artéria da coxa foi coletado e as amostras de soro reunidas por centrifugação após 1 h de repouso. Com base na especificação do kit ELISA (Shanghai enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), sete poços padrão foram adicionados com vários padrões de concentração (100 μL) em turno, os poços em branco foram adicionados com 100 μL solução de diluição padrão, e os poços restantes adicionados com 100 μL amostra a ser testada. A placa enzimática foi coberta com filme e colocada por 1 h, e então o líquido foi descartado. Uma solução (100 μL) foi adicionada a todos os poços, e a placa enzimática foi coberta com filme por 1 h. Após lavagem, 100 μL solução B foi adicionada a todos os poços, e a placa enzimática foi coberta com filme por 30 min. Então solução substrato tetrametilbenzidina (90 μL) foi adicionada, a placa enzimática foi coberta com filme por 10-20 min e 50 μL solução terminadora foi adicionada a todos os poços. O valor de densidade óptica (DO) de cada poço foi medido por leitor de microplacas, e a concentração real da amostra foi enumerada.

Ensaio de Reporter Luciferase Duplo

Os sítios de ligação e relação alvo de miR-410 e região 3' não traduzida (UTR) de Wnt-11 foram previstos usando software de bioinformática online https://www.targetscan.org. A sequência da região promotora 3'UTR de Wnt-11 contendo o sítio de ligação do miR-410 foi composta e inserida no vetor plasmídeo pMIR-REPORT^TM Luciferase (Ambion, Company, Austin, TX, EUA) para formular o plasmídeo wild-type Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-WT). E o plasmídeo mutante Wnt-11 3'UTR (Wnt-11-MUT) foi construído com base no plasmídeo e sítio de ligação mutado. Seguindo os passos do kit de extração de plasmídeo comprado (Promega, Madison, Wisconsin, EUA), e as células logarítmicas foram semeadas em placas de 96 poços. Quando a confluência celular foi cerca de 70%, Lipofectamine 2000 foi adotado para transfeção. Wnt-11-WT e Wnt-11-MUT foram misturados com mimics NC e miR-410 mimics (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China), respectivamente, e então co-transfectados a células 293 T. As células foram coletadas e lisadas após transfeção 48 h, e atividade luciferase foi testada por kit de detecção luciferase (BioVision, San Francisco, CA, EUA) e luminômetro Glomax 20/20 (Promega, Madison, Wisconsin, EUA).

Análise Estatística

Todos os dados foram processados por software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EUA). Os dados de medição foram expressos por média ± desvio padrão. Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi conduzida para comparações multi-grupo e teste t para comparações de dois grupos e teste t de diferença menos significativa de Fisher (LSD-t) foi utilizado após ANOVA. Valor P < 0,05 indicou diferença estatisticamente significativa.

Resultados

Alterações Patológicas em Tecidos de ONCF de Amostras Clínicas

Coloração HE foi adotada para observar as alterações patológicas da cabeça femoral no grupo fratura do colo femoral (grupo controle) e grupo ONCF; os resultados relataram que no grupo controle, a densidade de trabéculas ósseas era bem distribuída, e estrutura íntegra. Enquanto no grupo ONCF, havia muitas lacunas ósseas vazias no cerebelo ósseo, com células ósseas diminuídas, e trabéculas ósseas continuamente alteradas. Além disso, havia muitas outras hiperplasias teciduais ao redor do cerebelo ósseo (Fig. 1a).

Alterações patológicas em tecidos de ONCF de amostras clínicas. a Resultados de coloração HE em cada grupo (200×). b Resultados de coloração TRAP e contagem de células TRAP-positivas em cada grupo (200×). c Resultados de coloração ALP e contagem de células ALP-positivas em cada grupo (400×). *P < 0,05 vs. grupo controle.

Coloração TRAP revelou que TRAP foi encontrado principalmente em osteoclastos e frequentemente usado para identificar osteoclastos maduros em amaranto. Comparado ao grupo controle, o número de osteoclastos TRAP-positivos no grupo ONCF aumentou, a morfologia dos osteoclastos era diversa, e as células eram grandes com aparência multinuclear. Defeitos ósseos óbvios foram observados no cerebelo ósseo adjacente aos osteoclastos, o que mostrou reabsorção óssea (Fig. 1b).

O resultado de coloração ALP apresentou que ALP era enzima marcadora para diferenciação e maturação de osteoblastos, que participava na regulação da maturação calcificação da matriz óssea. Portanto, expressão de ALP era comumente usada para identificar osteoblastos. Partículas marrons ou cor de café podiam ser vistas no citoplasma de osteoblastos maduros. Em relação ao grupo controle, o número de osteoblastos ALP-positivos reduziu no grupo ONCF (Fig. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 Degradaram-se e Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 Aumentaram em Tecidos de ONCF das Amostras Clínicas

Análise por western blot e RT-qPCR demonstraram que expressão de miR-410 no grupo ONCF abateu-se relativa à do grupo controle, enquanto expressão de Wnt-11 aumentou; a expressão de fatores relacionados a osteoblastos ALP, BGLAP e Collα1 degradou-se; e os fatores relacionados a osteoclastos ACP5, CTSK e MMP9 expressão aumentou (todos P < 0,05) (Fig. 2a-c).

MiR-410, ALP, BGLAP e Collα1 diminuíram e Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aumentaram em tecidos de ONCF de amostras clínicas. a Detecção de miR-410, Wnt-11 e genes relacionados a osteoblastos e osteoclastos por RT-qPCR. b Wnt-11 e proteínas relacionadas a osteoblastos e osteoclastos detectadas por western blot. c Bandas de proteínas de Wnt-11 e proteínas relacionadas a osteoblastos e osteoclastos. d Expressão de Wnt11 (400×) e comparação da taxa de positividade de proteína Wnt11 detectada por coloração imuno-histoquímica. *P < 0,05 vs. grupo controle.

Expressão de Wnt-11 foi testada por imuno-histoquímica e os resultados exibiram que proteína Wnt-11 era expressa principalmente no citoplasma, e a expressão positiva era basicamente marrom-amarelada ou marrom. Em contraste com grupo controle, a taxa de positividade de expressão de proteína Wnt-11 no grupo ONCF foi aumentada (P < 0,05) (Fig. 2d).

MiR-410 Upregulado e Wnt-11 Downregulado Elevam DMO e BV/TV de Ratos

Micro-CT sugeriu que no grupo normal, a aparência da cabeça femoral era redonda, a espessura do colo era uniforme, e a estrutura das trabéculas ósseas era contínua e uniformemente distribuída. A cabeça femoral dos ratos no grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 colapsou gradualmente, área de reabsorção óssea apareceu gradualmente, o colo dos fêmures tornou-se mais fino, e as trabéculas ósseas foram quebradas e continuidade destruída. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a aparência dos ratos permaneceu íntegra, nenhum colapso ocorreu, nenhuma área óbvia de reabsorção óssea apareceu, as trabéculas ósseas foram arranjadas normalmente, e a estrutura foi completa (Fig. 3a).

MiR-410 altamente expresso e Wnt-11 pouco expresso aumentam DMO e BV/TV de ratos. a Resultados de micro-CT de ratos em cada grupo. b Resultados de análise de DMO. c Resultados de análise de BV/TV. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Os resultados de osteometria relataram que em contraste com grupo normal, a DMO e BV/TV no grupo ONCF foram deprimidas (ambos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, a DMO e BV/TV elevaram-se no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a DMO e BV/TV no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 caíram (ambos P < 0,05) (Fig. 3b, c).

Superexpressão de miR-410 e Pobre Expressão de Wnt-11 Aumentam Níveis de DMO do Colo Femoral, Cabeça Femoral e Coluna Vertebral, e Também Elevam Níveis Séricos de Cálcio e Fósforo de Ratos

Raio-X observou que a aparência da cabeça femoral no grupo normal era redonda, a densidade da cabeça femoral era uniforme, e a estrutura completa. No grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt11, a aparência da cabeça femoral dos ratos tornou-se mais fina e área de reabsorção óssea apareceu. A aparência era uniforme e a espessura da cabeça femoral dos ratos foi completa no grupo agomir-miR-410, grupo Wnt11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC (Fig. 4a).

MiR-410 upregulado e Wnt-11 downregulado aumentam nível de densidade mineral óssea do colo femoral, cabeça femoral e coluna vertebral, e também elevam níveis séricos de cálcio e fósforo de ratos. a Resultados de observação de raio-X animal. b Comparação da densidade mineral óssea do colo femoral, cabeça femoral e coluna em cada grupo. c Comparação dos níveis séricos de cálcio e fósforo em cada grupo. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Determinação de DMO e níveis séricos de cálcio e fósforo relataram que comparado ao grupo normal, a DMO do colo femoral, cabeça femoral e coluna, bem como níveis séricos de cálcio e fósforo, caíram no grupo ONCF (todos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, a DMO do colo femoral, cabeça femoral e coluna, bem como níveis séricos de cálcio e fósforo, aumentaram no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a DMO do colo femoral, cabeça femoral e coluna, bem como níveis séricos de cálcio e fósforo no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, diminuíram (todos P < 0,05) (Fig. 4b, c).

Silenciamento de Wnt-11 e Upregulação de miR-410 Aliviam Alterações Patológicas de Tecidos de Ratos e Restringem Apoptose de Osteócitos

Os resultados de coloração HE mostraram que as trabéculas ósseas eram nítidas e claras e arranjadas regular e firmemente. Células ósseas preenchiam as lacunas ósseas, e a zona calcificada era bem conectada às trabéculas ósseas subcondrais no grupo normal. No grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, a trabécula óssea era esparsa; afinada, e até quebrada; a estrutura era desordenada; e alguns fragmentos apareceram. Alguns osteócitos na lacuna óssea eram necróticos e grande número de lacunas ósseas estava em vazio que nenhuma célula óssea preenchia, e proliferação óbvia de tecido de granulação foi observada no espaço trabecular necrótico, que envolvia as trabéculas necróticas. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a aparência dos ratos permaneceu íntegra, nenhuma área óbvia de reabsorção óssea apareceu e as trabéculas ósseas foram arranjadas normalmente e a estrutura completa (Fig. 5a).

Pobre expressão de Wnt-11 e superexpressão de miR-410 aliviam alterações patológicas de tecidos de ratos e restringem apoptose de osteócitos. a Observação morfológica da cabeça femoral de ratos em cada grupo (200×). b Observação ultraestrutural de células ósseas de ratos em cada grupo (8000×). c Resultados de coloração TUNEL (200×). d Detecção de taxa de apoptose por ensaio TUNEL. e Detecção de expressão de mRNA Bax e Bcl-2 por RT-qPCR. f, g Detecção de expressão de proteína Bax e Bcl-2 por western blot. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Observação por microscopia eletrônica observou que a forma das células ósseas no grupo normal era consistente com as lacunas, e havia pequeno espaço entre a célula e a parede da lacuna. Organelas eram abundantes, as células nas lacunas eram normais, o núcleo era ovóide, a membrana nuclear íntegra, a cromatina não aglutinava, e o pseudopé citoplasmático estendia-se ao pequeno tubo ósseo periférico e conectava-se com células ósseas adjacentes. Osteoblastos localizados na superfície da trabécula óssea, a amostra era longa, e havia muitas organelas. No grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, grande número de depósitos lipídicos foram encontrados no citoplasma de osteoblastos, o espaço entre cápsula e poço de lacuna foi mais alargado, bandas brilhantes de edema apareceram entre membrana nuclear e citoplasma, marginação nuclear mostrou-se com compressão, membrana nuclear íntegra, mitocôndrias no citoplasma inchadas, e retículo endoplasmático e aparelho de Golgi desapareceram. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a morfologia de osteoblastos de ratos era normal, agregação de cromatina encontrada no núcleo de pequeno número de células, nenhum gotícula lipídica óbvia encontrada no citoplasma, e membrana nuclear íntegra (Fig. 5b).

Os resultados de coloração TUNEL demonstraram que comparado ao grupo normal, a taxa de apoptose de osteócitos no grupo ONCF foi aumentada (P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, a taxa de apoptose de osteócitos abateu-se no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (ambos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a taxa de apoptose de osteócitos aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Fig. 5c, d).

Análise por western blot e RT-qPCR relataram que expressão de Bcl-2 reduziu e expressão de Bax aumentou no grupo ONCF comparado ao grupo normal (ambos P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, expressão de Bcl-2 aumentou e expressão de Bax diminuiu no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-miR-410 + OE-NC, expressão de Bcl-2 declinou e expressão de Bax aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (ambos P < 0,05) (Fig. 5e-g).

Superexpressão de miR-410 e Baixa Expressão de Wnt-11 Aumentam Número de Osteoblastos e Diminuem Número de Osteoclastos

Coloração TRAP revelou que no grupo normal, a morfologia de osteoclastos com coloração TRAP positiva era diferente, a maioria deles era fusiforme ou em forma de fuso, poucos osteoclastos grandes eram polígonos, e a maioria distribuída ao redor do cerebelo ósseo. No grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, células TRAP-positivas aumentaram, a morfologia das células era diversa em polígonos grandes e policariotos, reabsorção óssea encontrada nas trabéculas adjacentes aos osteoclastos, e lacunas de reabsorção típicas formadas. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, o número de células positivas para coloração TRAP foi reduzido, as células em forma de tira longa e a morfologia mais regular, osteoclastos polinucleares poligonais raros, e a estrutura óssea de trabéculas adjacentes relativamente completa (Fig. 6a).

Superexpressão de miR-410 e baixa expressão de Wnt-11 aumentam número de osteoblastos e diminuem número de osteoclastos. a Resultados de coloração TRAP em osteoclastos de ratos (200×). b Contagem de células positivas em coloração TRAP. c Resultados de coloração ALP em osteoblastos de ratos em cada grupo (200×). d Contagem de células positivas determinada por coloração ALP. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Coloração ALP apresentou que no grupo normal, em osteoblastos positivos para coloração ALP, a morfologia era pequena e redonda. As células eram distribuídas em agregação, a maioria localizada no espaço trabecular da cavidade medular e na superfície de algumas trabéculas ósseas. No grupo ONCF, grupo agomir-NC, grupo siRNA-NC e grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11, o número de osteoblastos positivos para coloração ALP era distribuído dispersamente no espaço trabecular da cavidade medular. No grupo agomir-miR-410, grupo Wnt-11-siRNA e grupo agomir-miR-410 + OE-NC, o número de células osteoblasto-positivas aumentou, e foram distribuídas no espaço trabecular da cavidade medular e superfície da parte da trabécula óssea (Fig. 6c).

Por comparação com grupo normal, o número de osteoblastos por área unitária foi suprimido e o número de osteoclastos aumentado no grupo ONCF (ambos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, o número de osteoblastos por área unitária aumentou e o número de osteoclastos diminuiu no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-miR-410 + OE-NC, o número de osteoblastos por área unitária diminuiu e o número de osteoclastos aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (ambos P < 0,05) (Fig. 6b, d).

MiR-410 Altamente Expresso e Wnt-11 Baixamente Expresso Elevam Expressão de Osteocalcina (OCN), ALP, BGLAP e Collα1, bem como Reduzem Telopeptídeos C- e N-terminais do Colágeno Tipo I (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK e Expressão de MMP9 em Ratos ONCF

Os resultados de ELISA revelaram que em relação ao grupo normal, o nível de índice de função osteogênica ALP e OCN degradou-se enquanto os níveis de índice de função osteoclastogênica NTX-1 e CTX-1 aumentaram no grupo ONCF (todos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, ALP e OCN aumentaram e NTX-1 e CTX-1 diminuíram no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-miR-410 + OE-NC, ALP e OCN caíram e NTX-1 e CTX-1 aumentaram no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (todos P < 0,05) (Fig. 7a).

MiR-410 altamente expresso e Wnt-11 baixamente expresso elevam expressão de OCN, ALP, BGLAP e Collα1 bem como reduzem NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK e expressão de MMP9 em ratos ONCF. a Detecção de índices de função osteogênese e osteoclastogênese no soro de ratos em cada grupo por ELISA. b Detecção de genes relacionados a osteoblastos e osteoclastos por RT-qPCR. c, d Detecção de expressão de proteínas de genes relacionados a osteoblastos e osteoclastos por western blot. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Os resultados de western blot e RT-qPCR revelaram que em relação ao grupo normal, a expressão de fatores relacionados a osteoblastos ALP, BGLAP e Collα1 degradou-se, e fatores relacionados a osteoclastos ACP5, CTSK e MMP9 expressão aumentou (todos P < 0,05). Em contraste com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, a expressão de ALP, BGLAP e Collα1 elevou-se, e ACP5, CTSK e MMP9 expressão abateu-se no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (todos P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a expressão de ALP, BGLAP e Collα1 deprimiu-se, e ACP5, CTSK e MMP9 expressão aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (todos P < 0,05) (Fig. 7b-d).

Wnt-11 Elevado e miR-410 Diminuído Encontrados em Tecidos de ONCF de Ratos bem como Wnt-11 é Gene Alvo de miR-410

A relação alvo entre miR-410 e gene Wnt-11 foi analisada por software de análise online. Foi exibido que uma região de ligação específica existia entre sequência do gene Wnt-11 e sequência do miR-410, implicando que Wnt-11 era o gene alvo de miR-410 (Fig. 8a). Ensaio de atividade luciferase foi utilizado para verificar esta relação (Fig. 8b). Os resultados apresentaram que comparado ao grupo NC, a atividade luciferase deprimiu-se no grupo miR-410 mimics (P < 0,05), mas não houve diferença significativa na atividade luciferase de MUT 3'UTR (P > 0,05), indicando que miR-410 poderia ligar-se especificamente a Wnt-11.

Wnt-11 aumentado e miR-410 diminuído encontrados em tecidos de ONCF bem como Wnt-11 é gene alvo de miR-410. a Previsão de sítios de ligação de miR-410 em Wnt-11 3'UTR. b Detecção de atividade luciferase para verificar relação entre miR-410 e Wnt-11. c Detecção de expressão de miR-410 e Wnt-11 por RT-qPCR. d, e Expressão de proteína Wnt-11 determinada por western blot. f Expressão de Wnt-11 na cabeça femoral de ratos em cada grupo detectada por imuno-histoquímica (200×). g Comparação da taxa de positividade de expressão de proteína Wnt-11 em cada grupo. *P < 0,05 vs. grupo normal. ⁺P < 0,05 vs. grupo agomir-NC. ^#P < 0,05 vs. grupo siRNA-NC. ^&P < 0,05 vs. grupo agomir-miR-410 + OE-NC.

Os resultados de western blot e RT-qPCR revelaram que em relação ao grupo normal, expressão de miR-410 declinou e expressão de Wnt-11 aumentou no grupo ONCF (ambos P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-NC, miR-410 aumentou e Wnt-11 reduziu no grupo agomir-miR-410 (ambos P < 0,05). Em contraste com grupo siRNA-NC, Wnt-11 declinou no grupo Wnt-11-siRNA (P < 0,05). Wnt-11 aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 relativo ao grupo agomir-miR-410 + OE-NC (P < 0,05) (Fig. 8c-e).

Expressão de Wnt-11 foi verificada por imuno-histoquímica. Proteína Wnt-11 era expressa principalmente no citoplasma, e a expressão positiva era principalmente marrom-amarelada ou marrom. Comparado ao grupo normal, a taxa de positividade de expressão de proteína Wnt-11 no grupo ONCF foi aumentada (P < 0,05). Por comparação com grupo agomir-NC e grupo siRNA-NC, a taxa de positividade de expressão de proteína Wnt-11 desceu no grupo agomir-miR-410 e grupo Wnt-11-siRNA (ambos P < 0,05). Em relação ao grupo agomir-miR-410 + OE-NC, a taxa de positividade de expressão de proteína Wnt-11 aumentou no grupo agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (P < 0,05) (Fig. 8f, g).

Discussão

ONCF, um tipo de doença de destruição óssea, é causada por falha no suprimento sanguíneo e coagulação e distúrbio do sistema fibrinolítico e finalmente causa colapso da cabeça femoral [19]. Um estudo prévio discutiu expressão de miRNA em células-tronco mesenquimais da medula óssea induzidas por hormônio em camundongos com ONCF [20]. Também, um estudo recente forneceu prova que o perfil de expressão de miRNA de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea em osteogênese relacionada à ONCF induzida por esteroides [21]. Além disso, foi revelado que stents Li-nHA/GM/rhEPO podem elevar tanto vias Wnt e HIF-1/VEGF e promover osteogênese e angiogênese, o que é benéfico para reparo de ONCF induzida por glucocorticoides [22]. Baseado nestes fatos, o estudo visou explorar os efeitos de miR-410 na prevenção de ONCF alvo Wnt-11.

Nosso estudo forneceu evidência substancial em relação à noção de que miR-410, ALP, BGLAP e Collα1 degradaram-se e Wnt-11, ACP5, CTSK e MMP9 aumentaram em tecidos de ONCF. Um estudo recente promoveu que a expressão de miR-410 em osteossarcoma é declinada, e efeito anti-tumoral mostrado [23]. Outro estudo apresentou expressão de miR-410 reduzida em tecidos de câncer de mama receptor de estrogênio positivo humano [24]. Relata-se que fator secretado Wnt-11 expressão aumentada em vários tipos de câncer, contendo câncer colorretal, onde avança migração e invasão de células cancerígenas [25]. Similarmente, estudo prévio provou que expressão de Wnt-11 aumentada em câncer de próstata independente de hormônio [26]. ALP é índice útil para diagnóstico de estado e prognóstico clínico da doença [27]. OCN (proteína gama-carboxiglutamato óssea; BGLAP) é molécula amplamente conservada relacionada à mineralização da matriz óssea [28]. ACP5 é necessária para diferenciação de osteoclastos e reabsorção óssea, e promove movimento celular regulando fosforilação de quinase de adesão [29]. CTSK é protease crítica responsável por osteopontina, degradando colágeno tipo I e outras proteínas da matriz óssea [30]. MMPs podem degradar e modificar a maioria dos componentes da matriz extracelular e membrana basal e impulsionar imensa influência em invasão e metástase de câncer [31]. Também, nosso estudo revelou que Wnt-11 é gene alvo de miR-410. Similarmente, Zhang et al. encontraram que miR-410 alvo sítio de ligação inferido no Wnt3a 3'-UTR para modular via de sinalização Wnt [32].

Além disso, foi revelado que miR-410 upregulado e Wnt-11 downregulado aumentaram DMO e BV/TV de ratos ONCF. Foi sugerido anteriormente que diminuição de DMO espinhal e aumento de razão DPD/Cr urinária em pacientes ONCF não traumáticos [33]. Outro estudo verificou que DMO da cabeça femoral e vértebras lombares no grupo ONCF foram degradadas relativa à do grupo controle [34]. Adicionalmente, análise de imagem revelou muscone pode restaurar DMO e razão BV/TV da cabeça femoral necrótica, enquanto exame histológico confirmou efeito protetor de muscone em ONCF induzida por álcool [35]. Resultado emergiu de nossos dados que miR-410 altamente expresso e Wnt-11 baixamente expresso restringiram apoptose de osteócitos. Um estudo demonstrou que silenciamento de miR-410 pode induzir proliferação celular e reduzir apoptose de células endoteliais da veia umbilical humana induzida por lipoproteína de baixa densidade oxidada [36]. Relata-se que expressão de miR-410 descendida e expressão de SOCS3 ascendida poderiam reduzir expressão de fator anti-apoptose Bcl-2 e promover apoptose celular [37]. Além disso, em células LNCaP deficientes em andrógeno, downregulação de Wnt-11 pode prevenir diferenciação neuroendócrina-like e levar a apoptose de células de câncer de próstata [26]. O estudo também mostrou que downregulação de Wnt-11 e upregulação de miR-410 aumentaram expressão de ALP, BGLAP e Collα1 e reduziram expressão de ACP5, CTSK e MMP9. Um estudo indicou que expressão de Wnt-11 aumentada em células de câncer cervical pode resultar em ativação e fosforilação de JNK-1 ativando via Wnt/Jnk e impulsiona proliferação e migração/invasão de células tumorais [15]. Foi sugerido que silenciamento de gene Wnt-11 em linhagens de células de câncer colorretal reduziu capacidade invasiva das células [25]. Além disso, superexpressão de miR-410 pode restringir invasão, migração, proliferação e transformação mesenquimal epitelial de células de osteossarcoma via alvo direto TRIM44 [23]. Além disso, estudo prévio afirmou que miR-410 upregulado inibiu crescimento de colangiocarcinoma em modelo murino xenogênico induzindo apoptose [38].

Conclusão

Em resumo, nossa investigação revelou que miR-410 era baixamente expresso e Wnt-11 altamente expresso em ONCF, e upregulação de miR-410 ou downregulação de Wnt-11 aumentou osteoblastos e reduziu osteoclastos para aliviar ONCF. No entanto, pesquisas clínicas podem ser realizadas para detectar eficácia de miR-410 e Wnt-11 para tratamento de ONCF.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Não aplicável

Histórico de Alterações

Abreviações

ALP:

Fosfatase alcalina

ANOVA:

Análise de variância

BMD:

Densidade mineral óssea

EDTA:

Ácido etilenodiaminotetraacético

ELISA:

Ensaio imunoenzimático

GAPDH:

Gliceraldeído fosfato desidrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxilina-eosina

LSD-t:

Teste t de diferença menos significativa

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Controle negativo

OD:

Densidade óptica

ONFH:

Osteonecrose da cabeça femoral

PBS:

Salina fosfatada tamponada

ROI:

Regiões de interesse

RT-qPCR:

Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Dodecil sulfato de sódio

THR:

Artroplastia total do quadril

TRAP:

Fosfatase ácida resistente ao tartrato

TUNEL:

Marcação de extremidade nick mediada por TdT-dUTP-biotina