Longitudinal Zeólita-Óxido de Ferro Biossensor de Capacitância Depositada para Interleucina-3 na Detecção de Sepse

Resumo

Sepse é uma condição extrema que envolve uma resposta física a uma infecção microbiana grave e causa problemas fatais e com risco de vida. A sepse é gerada durante a liberação de produtos químicos com o sistema imunológico na corrente sanguínea para lutar contra uma infecção, que causa a inflamação e leva à emergência médica. Um zeólito longitudinal complexado e nanocompósito de óxido de ferro foi extraído de cinzas volantes de mina de carvão e utilizado para melhorar as características da superfície do biossensor de capacitância para identificar ataques de sepse. O anticorpo anti-interleucina-3 (anti-IL-3) foi anexado à superfície do eletrodo de capacitância complexada com zeólita e óxido de ferro através de um ligante de amina para interagir com o biomarcador de sepse IL-3. Os componentes morfológicos e químicos do nanocomplexo foram investigados por análises FESEM, FETEM e EDX. Em aproximadamente 30 nm, o zeólito longitudinal e o nanocompósito de óxido de ferro ajudaram a atingir o limite de detecção de IL-3 de 3 pg / mL na curva linear, com um coeficiente de regressão ( R ² ) de 0,9673 [ y =1,638 x - 1,1847]. Um limite de detecção mais baixo foi alcançado no intervalo dependente da dose (3–100 pg / mL) devido à maior quantidade de imobilização de anticorpos na superfície de detecção devido aos nanomateriais e à melhoria da corrente de superfície. Além disso, os experimentos de controle com biomoléculas relevantes não mostraram alterações de capacitância e aumentaram a capacitância de IL-3 no soro humano, indicando a detecção específica e seletiva de IL-3. Este estudo identifica e quantifica a IL-3 por meio de métodos potencialmente úteis e ajuda no diagnóstico de ataque de sepse.

Introdução

Sepse é uma condição fatal que ocorre quando o corpo responde severamente a uma infecção [1]. Devido ao ataque de sepse, o corpo produz um nível mais alto de biomoléculas de sinalização chamadas de "citocinas", que atraem as células do sistema imunológico. Um número crescente dessas células secretam mais citocinas, e a tempestade de citocinas recruta mais células imunológicas. Em vez de controlar a infecção inicial, os fatores imunológicos atacam os órgãos e tecidos do corpo. Além disso, essa infecção desencadeia uma reação em cadeia em todo o corpo e causa falência de órgãos e danos aos tecidos [2]. Em particular, a sepse começa nos pulmões, pele, trato urinário e gastrointestinal e se espalha amplamente.

para outros órgãos, o que leva à lesão de órgãos. Portanto, é necessário interromper o processo mais cedo para evitar ataques a outros órgãos. A identificação da sepse em seus estágios iniciais com um biomarcador adequado ajuda a fornecer tratamento imediato aos pacientes e salvar vidas. Os pesquisadores descobriram que o fator inflamatório da interleucina-3 (IL-3) é um preditor independente de ataque de sepse e morte produzida por células B do ativador de resposta inata (IRA) após a ativação do receptor Toll-like. Além disso, verificou-se que um nível mais alto de IL-3 estava associado a uma maior taxa de mortalidade em pacientes com sepse e confirmou que a IL-3 desempenha um papel importante na regulação imunológica e respostas mais elevadas aos corticosteróides durante a sepse. Esta pesquisa teve como objetivo quantificar o nível de IL-3 usando um sensor eletroquímico de capacitância modificado por nanocompósito de óxido de zeólita-ferro (zeólita-ferro).

A detecção de biomoléculas com biossensores é altamente dependente da imobilização do alvo ou molécula de detecção na superfície do eletrodo do transdutor [3]. Um número maior de sondas de captura imobilizadas com uma orientação adequada leva a limites de detecção de alvo mais baixos [4]. Na maioria dos casos, a imobilização da sonda de captura foi conduzida por meio de adsorção física, interação eletrostática, ligação covalente e aprisionamento de biomoléculas com polímeros [5, 6]. Pode ser difícil alcançar reprodutibilidade e biocompatibilidade de biomoléculas imobilizadas pelos métodos de imobilização acima. Em particular, a ligação de moléculas de captura menores, como RNA, DNA, aptâmeros e peptídeos às superfícies de detecção é complicada [7, 8]. Vários pesquisadores usaram diferentes técnicas para uma imobilização eficiente. Recentemente, nanomateriais têm sido altamente atrativos para uso no processo de imobilização biomolecular em superfícies de detecção [9,10,11]. Nanopartículas de ouro foram eficientemente imobilizadas em várias superfícies de detecção, como substratos de poliestireno ELISA e eletrodos de alumínio, e capturaram moléculas potenciais, incluindo anticorpos, proteínas, DNA e aptâmeros. Além da sílica, o alumínio e o grafeno são materiais comumente usados ​​para a imobilização de biomoléculas. Esses nanomateriais aumentam o número de moléculas de captura e proporcionam a biocompatibilidade e estabilidade das biomoléculas nas superfícies de detecção, o que ajuda a melhorar a estratégia de detecção. Recentemente, materiais inorgânicos como zeólita, argila e sol-gel têm atraído a atenção de pesquisadores para a solução desses problemas. Além disso, a síntese de nanomateriais por abordagens mais ecológicas tem sido altamente incentivada devido às grandes vantagens associadas, como não envolver materiais perigosos e ser mais baratos [12,13,14,15]. Além disso, abordagens personalizadas podem ser usadas para atingir os tamanhos e formas desejados de nanomateriais. O estudo atual estava de acordo com essa abordagem e produziu um nanomaterial zeólita combinado com ferro isolado para criar um nanocompósito.

Zeólita é um aluminossilicato microporoso cristalino composto de TO ₄ tetraedros e átomos de O [16]. É um material promissor para imobilização biomolecular devido a sua maior área superficial, capacidade de troca iônica, hidrofobicidade / hidrofilicidade controláveis ​​e alta condutividade mecânica e térmica. Portanto, vários estudos na área de biossensores foram estabelecidos usando material zeólito para o processo de imobilização biomolecular e alcançaram limites de detecção mais baixos para desenvolver biossensores como sensores de glicose e sensores de ureia [17,18,19]. Da mesma forma, os nanomateriais de ferro melhoram o efeito das propriedades de troca catiônica e fornecem respostas rápidas às mudanças atuais nas interações com biomoléculas. O nanocompósito de zeólita-óxido de ferro com composição única utilizada neste estudo aprimora o alto desempenho do sensor, proporcionando ainda mais sensibilidade devido à melhora na condutividade. Este estudo se concentrou em nanomateriais zeólita-ferro extraídos de cinzas volantes de mina de carvão e os utilizou como substratos para eletrodos de capacitância para imobilizar a sonda de captura, que era o anticorpo anti-IL-3. Em comparação com as detecções mediadas por nanomateriais anteriores de diferentes interleucinas [20,21,22], o sistema de detecção atual fornece melhorias de várias maneiras. Por exemplo, sua maior adequação para sensores eletroquímicos requer menos etapas experimentais e exibe adequação para funcionalização química de superfície e uma alta capacidade de não incrustação.

Um biossensor capacitivo é um sensor eletroquímico criado ao registrar a atração entre a sonda e o alvo interagindo na superfície do eletrodo. Um biossensor capacitivo ajuda a medir mudanças na camada dielétrica na interface do eletrodo quando uma biomolécula alvo está se ligando à sonda imobilizada na superfície de detecção [23]. A capacitância entre o eletrodo e o eletrólito é descrita por C =(2 nε ₀ εA ) / d , onde ε :constante dielétrica, A :área de superfície da placa, ε ₀ :permissividade do espaço livre, n :número de dedos repetitivos e d :espessura da camada isolante [24, 25]. Um biossensor capacitivo não farádico ajuda a evitar a desnaturação da proteína causada pela metalização e melhora a interação do alvo e da ligação da sonda [26, 27]. Vários estudos utilizaram biossensores capacitivos para identificar várias moléculas-alvo, incluindo nucleotídeos, metais pesados, proteínas e moléculas orgânicas [23, 28,29,30,31]. Nesta pesquisa, um experimento de biossensor de capacitância não-farádico foi conduzido em uma superfície de eletrodo modificado com zeólita-ferro. Zeólita-ferro foi ligado ao eletrodo de capacitância através de (3-aminopropil) -trimetoxissilano como um ligante de amina e, em seguida, anti-IL-3 foi ligado à superfície através da atração entre a superfície da amina e o grupo carboxílico (COOH) do anticorpo. Um eletrodo modificado com anticorpo anti-IL-3 foi usado para quantificar IL-3 e diagnosticar ataque de sepse.

Materiais e métodos

Aparelho e reagentes

As cinzas volantes foram recebidas de uma usina termelétrica na Índia. O hidróxido de sódio e o ácido sulfúrico foram adquiridos à Sigma Aldrich (Missouri, EUA). (3-Aminopropil) -trimetoxissilano (APTMS) foi recebido da Merck (NJ, EUA). O papel de filtro Whatman foi obtido na Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, EUA). Os anticorpos IL-3 e anti-IL-3 foram recebidos da Santa Cruz Biotechnology (Texas, EUA). Microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Japão) e microscopia eletrônica de transmissão de emissão de campo (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japão) foram usados ​​para analisar o nanomaterial de zeólita-ferro por métodos descritos anteriormente [ 32].

Síntese de nanomaterial de zeólita-ferro

Nanomateriais de zeólita-ferro foram sintetizados usando ferro, sílica e alumina extraídos de cinzas volantes. As seguintes três etapas principais foram envolvidas neste procedimento:(1) separação das partículas de ferro; (2) extração de aluminossilicato de sódio; e (3) preparação de nanopartículas de zeólita-ferro pelo método de síntese sol-gel.

Separação do ferro da cinza voadora

Uma alíquota de 25 g de cinzas volantes foi misturada com 500 µL de água destilada e agitada por 30 min usando um agitador magnético. As partículas de ferro presas ao agitador magnético foram separadas e, em seguida, 1 g das partículas separadas foi misturado com ácido sulfúrico a 25% e agitado durante 1 h a 50 ° C. Em seguida, a solução contendo ferro e as partículas de ferro foram separadas por papel de filtro Whatman e utilizadas como base para o óxido de ferro para sintetizar o nanomaterial zeólita-ferro.

Extração de aluminossilicato de sódio de cinzas volantes

O método de extração alcalina foi usado para extrair aluminossilicato de sódio de cinzas volantes pelo método de extração alcalina [33]. Primeiro, 25 g de cinzas volantes separadas por ferro foram misturadas com 500 µL de hidróxido de sódio 2 M e aquecidas a 100 ° C com agitação durante 6 h. Após arrefecimento da solução, o aluminossilicato de sódio (a solução na mistura) foi separado por papel de filtro Whatman. A solução filtrada foi usada como base para sintetizar um zeólito.

Nanomaterial de zeólita-ferro sintetizado pelo método Sol-Gel

O ferro extraído e o aluminossilicato de sódio foram usados ​​como base para sintetizar nanomateriais de zeólita-ferro pelo método sol-gel. Na primeira etapa, um copo contendo 200 mL de aluminossilicato de sódio a pH 12 foi colocado na placa de aquecimento sob agitação. Em seguida, a solução foi titulada com solução de ferro em pH 1 pela adição de quantidades gota a gota de solução de ferro até atingir pH 7. Em pH 7, um gel branco foi formado, e este gel foi continuamente agitado durante a noite para obter nanopartículas de zeólita-ferro uniformemente distribuídas . No dia seguinte, o gel foi separado por centrifugação (10.000 × g durante 10 min) e depois lavado com etanol a 25% e água destilada. O produto final foi seco a 100 ° C por 1 h para obter um pó consistindo de nanomateriais de zeólita-ferro. A superfície do nanomaterial zeólita-ferro foi caracterizada por FETEM e FESEM. A análise de energia dispersiva de raios-X (EDX) também foi conduzida para identificar os elementos no zeólito-ferro.

Modificação de amina de zeólita-ferro e funcionalização da superfície do eletrodo de capacitância

A amina foi revestida na superfície do zeólito-ferro pelo agente de acoplamento de silano APTMS. Para isso, 1 g de zeólita-ferro foi misturado com 1% de KOH por 10 min, e em seguida o excesso de KOH foi removido com água destilada. Posteriormente, o zeólito-ferro tratado com KOH foi misturado com APTMS a 1% e a mistura foi colocada em um agitador aquecido durante a noite. No dia seguinte, o nanomaterial foi lavado com etanol e separado por centrifugação (10.000 × g por 10 min). Este APTMS-zeólita-ferro foi anexado à superfície do eletrodo de capacitância para identificar IL-3. Para esta imobilização, APTMS-zeólita-ferro foi colocado no eletrodo hidroxilado e mantido em temperatura ambiente por 3 h. A ligação entre o nanocompósito de zeólita-óxido de ferro, APTMS e a superfície de detecção foi devido ao acoplamento do silano com os grupos óxidos gerados. Em geral, o acoplamento de silano ocorre com vários braços disponíveis para os grupos de óxido, produzindo ligações entre o nanocompósito de zeólita-óxido de ferro, APTMS e superfície de detecção. Devido a essas ligações múltiplas, um arranjo espacial na superfície de detecção é formado. Após lavagem da superfície com etanol seguido de água, foi realizado um processo de imobilização do anticorpo anti-IL-3 para interagir com IL-3.

Determinação de IL-3 na superfície do eletrodo de capacitância modificado com anti-IL-3

A superfície descrita acima foi formada por amarração de amina, que permite a reação com grupos COOH disponíveis quando o anticorpo se liga. IL-3 foi identificada em uma superfície de eletrodo de capacitância imobilizada anti-IL-3. Para isso, a IL-3 a 100 pg / mL foi diluída em tampão PBS e colocada em uma superfície de eletrodo modificada com anticorpo. Após a imobilização do anticorpo, a superfície não ligada remanescente foi bloqueada por PEG-COOH (1 mg / ml). Uma reação semelhante ao anticorpo-APTMS ocorre quando o PEG-COOH é anexado. O valor da capacitância foi registrado antes e depois da interação com IL-3. As diferenças de valor foram consideradas para a ligação de IL-3 com o seu anticorpo. Além disso, para calcular o limite de detecção, a IL-3 foi titulada de 3 a 50 pg / mL e caiu independentemente nas superfícies modificadas com anticorpos. O outro procedimento experimental foi realizado conforme descrito anteriormente. A diferença no valor de capacitância para cada concentração de IL-3 foi calculada e plotada para calcular a detecção de IL-3 pelo R ² valor. Quando a IL-3 está ligada à superfície imobilizada do anticorpo, haverá uma interação genuína.

Biofouling e determinação seletiva de IL-3 na superfície do eletrodo de capacitância modificada por zeólita-ferro

Um experimento de bioincrustação foi conduzido sob três diferentes condições de biomolécula, incluindo a presença de um anticorpo não imune ou uma proteína de controle e a ausência de anticorpo IL-3. No primeiro caso, em vez do anticorpo IL-3, foi usado um anticorpo não imune; no segundo experimento, em vez de IL-3, foi utilizada uma proteína controle; e a última experiência foi conduzida sem anticorpo IL-3. Os valores de capacitância foram comparados para a interação específica do anticorpo IL-3 com IL-3. Um experimento seletivo foi conduzido adicionando IL-3 em uma diluição de 1:100 de soro humano e adicionando-o gota a gota na superfície do eletrodo modificado com anti-IL-3. As mudanças na capacitância foram registradas para cada concentração de IL-3 para identificar a identificação seletiva de IL-3. A reprodutibilidade foi confirmada repetindo as experiências três vezes (em triplicado) com dispositivos semelhantes feitos a partir do mesmo lote de fabricação. O armazenamento vitalício e a estabilidade da superfície imobilizada pela sonda também foram determinados.

Resultados e discussão

Sepse é a condição com muitos produtos químicos liberados no sistema imunológico e desencadeia uma inflamação generalizada com danos finais aos órgãos. A Figura 1a mostra uma ilustração esquemática da identificação de IL-3 em uma superfície de eletrodo de capacitância modificada por anti-IL-3 para determinar a condição associada à sepse. O zeólito de ferro modificado com APTMS foi usado para anexar o anticorpo de captura à superfície do eletrodo de detecção. APTMS na superfície do zeólito-ferro foi imobilizado na superfície do eletrodo através da interação entre amina no nanomaterial e grupos OH na superfície do eletrodo. A Figura 1b confirma a integridade do eletrodo de superfície no sensor de capacitância, conforme capturado em um microscópio de alta potência. O anticorpo foi ligado à superfície através do COOH e da amina do zeólito-ferro. O ferro zeólito ajuda a anexar um número maior de APTMS no eletrodo de detecção, o que ajuda a capturar mais anticorpos na superfície do eletrodo de capacitância. Vários estudos indicaram que a imobilização da sonda de captura na superfície de detecção desempenha um papel crucial na redução do limite de detecção da molécula alvo. Nesta pesquisa, o nanomaterial de zeólita-ferro foi usado para anexar o anticorpo anti-IL-3 à superfície do eletrodo de detecção. Maior imobilização de anticorpo anti-IL-3 com orientação adequada ajuda a atingir os limites de detecção mais baixos de IL-3.

a Ilustração esquemática da identificação de IL-3 em uma superfície de detecção de capacitância modificada por anti-IL-3. O zeólito-ferro modificado com APTMS foi usado para anexar o anticorpo de captura e, em seguida, interagiu com IL-3. PEG-COOH foi usado como agente de bloqueio. b Análise morfológica da superfície sensora de capacitância por microscopia de alta potência. c Análise morfológica de zeólita-ferro por FESEM. Os nanomateriais foram formados com distribuição uniforme e na dimensão longitudinal. d Análise EDX. Foi encontrada a presença dos elementos principais Si, Al, Fe e O. A inserção da figura foi obtida por FESEM com baixa ampliação

Análise morfológica do nanomaterial de zeólita-ferro por FESEM e FETEM

A Figura 1c, d (detalhe) exibe a imagem morfológica do nanomaterial zeólita-ferro obtido do FESEM em diferentes ampliações e a análise elementar de EDX. O nanomaterial zeólita-ferro obtido era liso e uniformemente distribuído, com uma nanoestrutura longitudinal densamente empilhada. O tamanho desta nanoestrutura foi de ~ 30 nm, e a imagem obtida mostra que o nanocompósito foi organizado com formas uniformes e bem distribuído na distância adequada. A imagem FETEM também mostrou uma forma semelhante à obtida por FESEM para os nanocompósitos de zeólita-ferro formados (Fig. 2a, b). O resultado de EDX confirmou a presença de Fe, Al, Si e O no nanocompósito de zeólita-ferro sintetizado (Fig. 2c, d). As principais porcentagens atômicas elementares de Si, Al, Fe e O foram 3,46, 0,78, 2,13 e 24,39%, respectivamente. Este resultado de FESEM e EDX confirma a formação de nanomateriais zeólita-ferro.

Imagens FETEM de zeólita-ferro no a Escala de 50 nm e b Escala de 200 nm. O nanomaterial foi formado com uma distribuição uniforme. c Análise de EDX confirmando a presença dos elementos principais Si, Al, Fe, C e O

Preparação do eletrodo de detecção para determinação de IL-3

A imobilização do anticorpo anti-IL-3 no biossensor de capacitância foi confirmada pela alteração do nível de capacitância após cada imobilização biomolecular. A Figura 3a mostra as mudanças de capacitância durante o processo de fixação do anticorpo à superfície modificada com zeólita-ferro. Conforme mostrado na Fig. 3a, a superfície do eletrodo de capacitância amarrado com KOH mostra um valor de capacitância de 1,74 × 10 ⁰⁹ nF, e após a adição gota a gota do APTMS-zeólita-ferro, foi aumentado para 2,02 × 10 ⁰⁹ nF. Este aumento na capacitância confirmou a fixação dos nanomateriais ao eletrodo de detecção. Além disso, ao adicionar anticorpo anti-IL-3, o valor de capacitância aumentou drasticamente para 3,42 × 10 ⁰⁹ nF. Este aumento mais alto foi observado devido à maior quantidade de imobilização de anticorpos no zeólito-ferro modificado com APTMS. Além disso, os nanomateriais mostraram um arranjo adequado com um número maior de APTMS na superfície do eletrodo de detecção, atraindo mais anticorpos. Finalmente, PEG-COOH foi adicionado para fins de bloqueio, e a capacitância aumentou para 3,64 × 10 ⁰⁹ nF. O sensor funciona com base nas mudanças na carga superficial e, em última análise, nas mudanças na capacitância. As mudanças de carga superficial variam com ligações / interações moleculares. Cada molécula carrega cargas diferentes e influencia a capacitância do sensor. Portanto, a diferença na capacitância foi considerada para as medições. Mudanças mais altas na capacitância foram observadas devido à maior ocupação de anticorpos IL-3 na superfície do eletrodo de detecção (Fig. 3b). O PEG-COOH ajuda a reduzir a ligação inespecífica de IL-3 na superfície do eletrodo de detecção e elimina resultados falso-positivos. Vários estudos provaram que os polímeros à base de PEG em superfícies de detecção melhoram a biocompatibilidade, reduzem a relação sinal-ruído e fornecem uma orientação adequada de biomoléculas imobilizadas em superfícies de detecção, o que leva a um limite de detecção inferior do sensor [34,35, 36,37]. Como a superfície do APTMS atrai outras biomoléculas eletrostaticamente, o PEG-COOH foi usado para cobrir o excesso da superfície do APTMS no nanomaterial de zeólita-ferro, o que ajuda a reduzir a bioincrustação. Esta superfície modificada com anti-IL-3 foi utilizada para identificar IL-3.

a Processo de fixação do anticorpo à superfície modificada com zeólita-ferro. os valores de capacitância aumentaram após cada imobilização molecular. b Diferença na capacitância. A imobilização do anticorpo anti-IL-3 apresentou maior alteração no valor da capacitância. Os valores foram calculados em média usando três leituras em triplicado. [Zeólita-IO — óxido de ferro de zeólita]

Determinação e quantificação de IL-3 na superfície do anticorpo anti-IL-3

A IL-3 foi quantificada em uma superfície de detecção de eletrodo de capacitância modificada por anti-IL-3. Inicialmente, uma concentração mais alta de IL-3 (100 pg / mL) foi testada na superfície modificada com anticorpo, e o valor de capacitância aumentou de 3,74 × 10 ¹⁰ nF a 13 × 10 ¹⁰ nF. Este aumento confirma a interação de IL-3 com o anticorpo anti-IL-3 (Fig. 4a). Uma experiência semelhante foi conduzida com concentrações de IL-3 de 3 a 50 pg / mL. Conforme mostrado na Fig. 4b, os valores de capacitância aumentaram para 4,56 × 10 ¹⁰ nF, 5,84 × 10 ¹⁰ nF, 6,64 × 10 ¹⁰ nF, 8,39 × 10 ¹⁰ nF e 12 × 10 ¹⁰ nF. Foi notado que com o aumento das concentrações de Il-3, os valores de capacitância aumentaram gradualmente (Fig. 5a). A diferença nos valores de capacitância foi calculada e plotada em uma planilha Excel, e a detecção de IL-3 foi calculada como 3 pg / mL com um valor de R2 de 0,9673 (Fig. 5b). Uma resposta linear dependente da dose com diferentes concentrações de IL-3 (3–100 pg / mL) foi encontrada ao interagir com anti-IL-3. No entanto, quando tituladas em outras concentrações, as amostras ficaram saturadas.

Determinação de IL-3 na superfície modificada com anti-IL-3. a Identificação de 100 pg / mL de IL-3. Mudanças claras na capacitância foram observadas após a adição gota a gota de IL-3. A inserção da figura exibe o esquema. b Titulação de diferentes concentrações de IL-3 em anticorpo anti-IL-3. Com todas as concentrações de IL-3, alterações de capacitância foram observadas

a Valor de capacitância para cada concentração de IL-3. O aumento da concentração de IL-3 produziu um aumento gradual no valor da capacitância. b Diferença no valor de capacitância para cada concentração de IL-3. Os valores foram plotados em planilha Excel e o limite de detecção de IL-3 calculado em 3 pg / mL. Os valores foram calculados em média usando três leituras em triplicado

Biofouling / Nonfouling no eletrodo de capacitância APTES-Zeolite-Ferro-Modificado

A bioincrustação é o maior problema em qualquer tipo de biossensor, o que leva à identificação falso-positiva do alvo na superfície de detecção. Agentes de bloqueio, como BSA, etanolamina e polímeros à base de PEG, são moléculas comuns que reduzem a incrustação biológica nas superfícies de detecção. Aqui, PEG-COOH foi usado como agente de bloqueio, e o efeito de bioincrustação foi confirmado em três diferentes experimentos de controle, a saber, sem anticorpo IL-3, com um anticorpo não imune e com uma proteína de controle (IL-8). Como mostrado na Fig. 6a, todos os três experimentos de controle falharam em aumentar o valor de capacitância, indicando a identificação específica de IL-3 sem qualquer incrustação biológica.

a Detecção específica de IL-3. As moléculas de controle não apresentaram aumento no valor da capacitância, indicando a detecção específica de IL-3. b Aumento de IL-3 no soro humano. O aumento no soro humano aumentou a capacitância com o aumento das concentrações de IL-3. Este resultado confirma a detecção seletiva de IL-3. Os valores foram calculados em média usando três leituras em triplicado

Aumento de IL-3 no soro humano e estabilidade

Diferentes concentrações de IL-3 foram adicionadas no soro humano e submetidas ao mesmo procedimento experimental para identificar IL-3 em situações da vida real. Como mostrado na Fig. 6b, a IL-3 aumentada no soro humano produziu claramente valores de capacitância aumentados com concentrações aumentadas de IL-3. Este resultado confirma a identificação seletiva de IL-3 pelo eletrodo de capacitância modificado com anti-IL-3.

Considerando a reprodutibilidade, a superfície sensora se comporta bem, com valores mínimos de erro. A vida útil operacional do nanomaterial conectado à superfície de detecção pode ser prolongada por três meses com armazenamento adequado em um dessecador. No entanto, após a fixação da sonda, a superfície ficou estável por 2 semanas e tendeu a perder 19% da estabilidade, e a perda de estabilidade tornou-se acentuada a partir da 3ª semana. Para comprovar o alto desempenho do sensor de corrente, foi realizado um estudo comparativo com os sensores disponíveis atualmente, e os resultados indicam que ele é comparável e se comporta melhor em várias instâncias (Tabela 1).

Conclusão

A sepse é fatal, envolve uma reação imunológica avassaladora, é extremamente perigosa e afeta todo o corpo. Este estudo demonstrou a identificação de um biomarcador de sepse (IL-3) em um eletrodo de capacitância. O nanomaterial de zeólita-ferro foi extraído de um eletrodo de capacitância modificado por mosca de carvão para aumentar o fluxo de corrente após a ligação de biomoléculas ao eletrodo de detecção. A modificação da amina foi realizada para anexar o anticorpo anti-IL-3 ao zeólito-ferro. A detecção de IL-3 foi conduzida em um eletrodo modificado com anticorpo e atingiu o limite de detecção de IL-3 a 3 pg / mL. Outros experimentos de controle falharam em mostrar um aumento no valor de capacitância, confirmando a detecção específica de IL-3, e experimentos seletivos com IL-3 incrementado em soro humano exibiram um claro aumento na capacitância. Este método experimental quantifica os níveis de IL-3 e ajuda a diagnosticar ataques de sepse.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

IL-3:

Interleucina-3

pg:

Picograma

mL:

Mililitro

µL:

Microlitro

M:

Molar

FESEM:

Microscópio eletrônico de transmissão de emissão de campo

FETEM:

Microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo

EDX:

Raio-X de dispersão de energia

IRA:

Ativador de resposta inata

COOH:

Carboxílico

DNA:

Ácido nucléico desoxirribose

RNA:

Ácido nucleico ribose

ELISA:

Ensaio de imunoabsorção enzimática

APTMS:

(3-aminopropil) -trimetoxissilano

KOH:

Hidróxido de potássio

PEG:

Polietileno glicol

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