Imunoensaio de Fluorescência Rápido e Sensível para CYFRA 21-1 Usando Nanocompósito de Pontos Quânticos de Carbono/Óxido de Zinco

Resumo

A detecção rápida de câncer de pulmão em estágios iniciais usando o antígeno fragmento de citoqueratina-19 (CYFRA 21-1) como marcador tumoral no soro humano desempenha papel importante na sobrevivência dos pacientes e na reação cirúrgica rápida. Este estudo visou empregar nanocompósito de pontos quânticos de carbono conjugados a óxido de zinco sintetizado de forma verde como solução imunosensora de fluorescência altamente sensível para determinação rápida do antígeno CYFRA 21-1 no soro humano. O método sugerido foi conduzido aplicando método hidrotérmico para preparar pontos quânticos de carbono usando pericarpo de Citrus lemon. Os pontos quânticos de carbono formados foram usados na redução e estabilização de acetato de zinco para sintetizar nanocompósito de pontos quânticos de carbono-óxido de zinco. Para formar sistema imunosensor sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo, um antígeno CYFRA 21-1 foi aprisionado imobilizando anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21 na superfície do nanocompósito de pontos quânticos de carbono-óxido de zinco e outro anticorpo monoclonal KS 19.1, revestido na superfície do poço de microplaca. Este sistema possui característica de fluorescência ajustável registrada em excitação e emissão de λ_ex = 470 e λ_em = 520 nm, respectivamente. O sistema imunosensor de fluorescência baseado no nanocompósito sugerido exibiu relação linear de 0,01–100 ng mL⁻¹ com limite de detecção de 0,008 ng mL⁻¹. O sistema imunosensor baseado em nanocompósito de pontos quânticos de carbono-óxido de zinco fornece abordagem promissora para diagnósticos rápidos de câncer de pulmão detectando CYFRA 21-1 no soro humano.

Introdução

Câncer de pulmão é o tipo de câncer mais prevalente e agressivo com grandes desafios no tratamento médico. Recorrência tumoral e metástase são consideradas as principais causas de morte para pacientes com câncer de pulmão. O marcador tumoral fragmento de citoqueratina 19 (CYFRA 21-1) é um fragmento que existe em muitas células epiteliais normais e malignas. Pode ser estimado usando ensaio imunorradiométrico sanduíche. Estudos iniciais esclareceram que em estágios malignos de câncer de pulmão, CYFRA 21-1 é liberado na circulação sanguínea dos pacientes e elevado em seu soro. Portanto, é possível melhorar a sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão por detecção precoce e consequente reação cirúrgica rápida.

Poucas técnicas foram previamente relatadas para detecção de CYFRA 21-1, incluindo imunoensaio enzimático, imunoensaio eletroquimioluminescente e ensaio imunorradiométrico. Estratégia vantajosa para aumentar e melhorar sensibilidade de CYFRA 21-1 no soro humano ainda é uma preocupação.

Nos últimos anos, grande progresso e crescimento explosivo da nanotecnologia foram alcançados em quase todos os campos da vida. Entre esses campos estão sistemas de administração de fármacos, análise farmacêutica, reatividade catalítica, aplicações medicinais, marcadores tumorais de câncer e imagem de tecidos.

Atualmente, técnicas de sensoriamento baseadas em fluorescência (FL) atraíram muitos pesquisadores devido ao seu design simples e excelente sensibilidade. Vários materiais sensores de FL foram projetados e sintetizados para monitoramento biológico. Sistemas FL para determinação biológica são altamente luminescentes, dispersíveis em água, quimicamente estáveis e não tóxicos. Existem várias sondas imunosensoras baseadas em fluorescência para detecção de biomarcadores. O ensaio competitivo heterogêneo é conduzido imobilizando moléculas de captura na superfície e então incubado com biomarcadores conjugados a fluoróforo. A competição entre biomarcadores livres e conjugados para ligação às moléculas de captura diminui intensidade de fluorescência com concentração do biomarcador. O ensaio sanduíche heterogêneo baseia-se na incubação de moléculas de captura e solução de interesse formando complexo com biomarcadores. Consequentemente, intensidade de fluorescência aumenta com concentração do biomarcador.

No ensaio competitivo homogêneo, duas diferentes moléculas de captura conjugadas a fluoróforo A e biomarcadores conjugados a fluoróforo B e a solução aumentam fluorescência com concentrações do biomarcador. Contudo, essas técnicas mostraram certas desvantagens, incluindo longo tempo experimental, falta de detecção multiplexada, complexidade e às vezes resultados relativamente falsos. Avanço em nanotecnologia permitiu pesquisadores desenvolver novas sondas imunosensoras de fluorescência com características ópticas únicas. Desde o primeiro uso de pontos quânticos em detecção de biomoléculas, ganharam grande interesse pois suas características ópticas fornecem alta flexibilidade na seleção de comprimento de onda adequado, excelentes marcadores para detecção multiplexada, biocompatibilidade e capacidade de direcionamento.

Pontos quânticos de carbono (CQDs) demonstraram excelentes propriedades químicas, físicas, ópticas, magnéticas e elétricas. CQDs podem ser sintetizados usando diferentes técnicas, incluindo hidrotérmica, eletro-oxidação, ablação a laser e micro-ondas. Devido às suas características de baixa toxicidade, pesquisadores consideraram CQDs como candidatos poderosos em muitas sondas fluorescentes. Adicionalmente, têm forte capacidade de manipulação através de diferentes reações químicas controláveis em várias demandas como bioquímicas, fotoquímicas, biossensoriamento, bioimagem e sistemas de administração de fármacos, bem como em imunoensaio. Estudos anteriores sobre síntese de CQDs revelaram certas desvantagens usando fontes de carbono caras, químicos e reagentes tóxicos, ou processos não seletivos. Para restringir essas desvantagens, pesquisadores começaram a usar sucos de frutas como nova e barata fonte de carbono. Como uso de sucos de frutas não fornece objetivo ótimo de utilização de recursos, CQDs fluorescentes foram recentemente obtidos de cascas de frutas. O uso de cascas de frutas fornece rota promissora para síntese verde e ecológica de CQDs.

Óxido de zinco (ZnO) é um dos óxidos metálicos mais importantes, potencialmente ativo, estável e de baixa toxicidade amplamente usado em dispositivos a laser ultravioleta, campo biomédico, vários tipos de sensores e fotocatálise. Nanopartículas de ZnO (ZnONPs) exibiram propriedades fotoluminescentes próximas aos espectros UV e Vis. Isso pode ser atribuído à emissão excitônica baseada na recombinação direta de pares elétron-buraco ou devido à emissão verde-amarela a 520 nm como resultado da transição eletrônica da borda da banda de condução para nível de armadilha.

Geralmente, pontos de carbono são nanopartículas quase-esféricas amorfas ou nanocristalinas contendo carbono sp² e sp³, grupos baseados em O/N, e grupos químicos pós-modificados. Além disso, CQDs têm capacidade de excitar com comprimentos de onda maiores e podem mudar eficácia das superfícies combinadas dos pares elétron-buraco e trata o quenching nos sistemas analisados, o que pode facilitar determinação quantitativa de biomoléculas. Têm capacidade de ser decorados por óxidos metálicos como TiO₂ e ZnO para formar nanocompósito opticamente ativo que pode ser explorado na detecção de biomarcadores no soro humano. ZnO é material de larga banda proibida (3,37 eV), que pode ser luminescente em regiões UV e azul da luz visível devido à presença de grande densidade de níveis de defeito na banda proibida. Formação de nanocompósito CQDs/ZnO aumenta absorção de luz visível devido à hibridização de ZnO com CQDs, e o deslocamento azul na absorção de luminescência para 520 nm pode ser atribuído à recombinação radiativa de vacâncias de O ionizadas. Além do aumento de absorção de luz visível, melhor separação elétron-buraco e redução do tempo de transferência eletrônica interfacial podem ser considerados para maior desempenho óptico dos CQDs hibridizados com nanopartículas de ZnO. Além disso, aumento significativo de radicais –OH*, gerados do nanocompósito CQDs/ZnO na interface aquosa, pode causar elevação significativa nos sinais de fluorescência do sistema analisador. Assim, o nanocompósito combinado CQDs/ZnO aumenta modificação das propriedades optoeletrônicas e fotoluminescentes da superfície de ZnO e produz forte defeito superficial com fotoluminescência ajustável. Além disso, CQDs imobilizados com anticorpos de bio-reconhecimento formando sistema de sensoriamento FL anticorpo-antígeno-anticorpo fornecem sonda viável com alta especificidade e sensibilidade ao analito alvo.

O estudo sugerido propôs novo sistema simples e ultrassensível de imunoensaio de fluorescência baseado em CQDs decorados com nanocompósito ZnO para determinar marcador tumoral CYFRA 21-1 no soro humano. Pericarpo de Citrus lemon foi empregado como precursor de carbono para derivar CQDs usando condições hidrotérmicas. Além disso, foi usado como agente redutor e estabilizador para síntese de nanocompósito CQDs conjugados ZnO. O nanocompósito CQDs/ZnO preparado foi imobilizado por anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21 e os poços de microplaca foram revestidos com outro anticorpo monoclonal KS 19.1 para formar sistema imunosensor sanduíche.

Materiais e Métodos

Instrumentos

Espectros espectrofotométricos tanto de CQDs quanto de nanocompósito CQDs/ZnO foram registrados usando espectrofotômetro Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, Reino Unido). Morfologia superficial e distribuição de tamanho de partícula dos CQDs sintetizados verde e nanocompósito CQDs/Zn foram avaliados usando microscópio eletrônico de transmissão (MET) modelo JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Alemanha) e microscópio eletrônico de varredura (MEV) modelo JSM-7610F (JEOL, EUA). Espectros de fluorescência e transformada de Fourier infravermelha (FT-IR) do sistema imunosensor sugerido foram verificados usando leitor multimodo Biotek Synergy H1 (Biotek, Tóquio, Japão) e espectrofotômetro FT-IR Perkin Elmer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japão), respectivamente. Espectros Raman, espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) e padrão de difração de raios X em pó (XRD) foram medidos usando espectrômetro micro-Raman (CRAIC Technologies, CA, EUA), sistema de espectroscopia de raios X Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd., Manchester, Reino Unido) e difratômetro Siemens D-5000 (Siemens, Erfurt, Alemanha), respectivamente.

Químicos e Reagentes

Instrumento SG-2000-10090 (Barsbuttel, Alemanha) foi usado para adquirir água desionizada usada em todos os experimentos. Anticorpos monoclonais não conjugados CYFRA 21-1 (mAb) BM 19.21 e KS 19.1 para formar sistema imunosensor sanduíche foram obtidos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). Frutas Citrus lemon foram fornecidas por mercados locais. Tampão fosfato salino (PBS) de pH = 7,4 foi preparado usando cloreto de sódio, cloreto de potássio, hidróxido de sódio, fosfato monopotássico e fosfato dissódico (BHD Ltd. Co. Poole, Reino Unido). Randox Laboratories (Irlanda do Norte-Reino Unido) forneceu soros normais comerciais. Amostras de sangue aleatórias foram coletadas de voluntários saudáveis, e antes de iniciar este estudo, consentimento informado foi obtido. Além disso, Sigma-Aldrich (Hamburgo, Alemanha) forneceu grau puro de cloreto de carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). Comitê de ética em pesquisa da King Saud University, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) aprovou o estudo.

Preparação Hidrotérmica Verde de Pontos Quânticos de Carbono (CQDs)

Pericarpo de Citrus lemon foi empregado para sintetizar CQDs sob condições hidrotérmicas. Aproximadamente 20 g de pericarpo de Citrus lemon e 200 mL de água desionizada foram transferidos para balão de fundo redondo e refluxados a 100 °C sob agitação magnética contínua por 6 h. Após resfriamento à temperatura ambiente, o extrato resultante foi centrifugado a 3500 rpm e 20 mL da solução extratada superior foi autoclavada e aquecida sob condições hidrotérmicas na faixa de temperatura de 100 a 200 °C por diferentes intervalos de 6–120 h. Após resfriamento à temperatura ambiente, o licor superior representa os CQDs.

Preparação de Nanocompósito de Pontos Quânticos de Carbono-Óxido de Zinco

Para preparar nanocompósito CQDs/ZnO, reação simples de redução química foi realizada usando CQDs como agente redutor e estabilizador. Nanocompósito CQDs/ZnO foi obtido adicionando 20 mL dos CQDs a 50 mL de 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ de acetato de zinco a 60 °C sob agitação contínua por 10 min. Quando a cor da mistura mudou de amarelada para cremosa, a mistura foi deixada de lado por 30 min para completar o processo de redução e armazenada a 4 °C. Para garantir estabilidade e verificar aglomeração do nanocompósito CQDs/ZnO preparado, espectrometria UV-Vis foi empregada para registrar absorbância dentro de 20 dias a 390 nm. Os resultados revelaram alta estabilidade e nenhuma mudança significativa na absorbância do nanocompósito CQDs/ZnO.

Caracterização de Nanocompósito de Pontos Quânticos de Carbono-Óxido de Zinco

Para garantir formação de nanocompósito CQDs/ZnO, diferentes técnicas microscópicas e espectroscópicas foram usadas. Uniformidade e morfologia superficial de CQDs e nanocompósito CQDs/ZnO foram estudadas usando microscópio eletrônico de transmissão de alta resolução (METAR) e MEV. Espectros ópticos foram estudados usando UV-Vis, FT-IR, XPS e espectroscopia Raman. Estrutura cristalina dos CQDs preparados foi avaliada usando padrão XRD.

Processo de Imobilização

Anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21 foi imobilizado na superfície do nanocompósito CQDs/ZnO sintetizado por simples ligação peptídica amida entre grupos amina e carboxílicos ativos. Processo de imobilização foi conduzido adicionando 5,0 mL de cada NHS e EDC equimolares 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ a 5,0 mL de solução de nanocompósito CQDs/ZnO sob agitação contínua por 1 h. Aproximadamente 5 mg de anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21 foi dissolvido em 1,0 mL de tampão fosfato salino 0,01 mol L⁻¹ (pH = 7,4) e adicionado à solução sensora acima. Anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21 foi imobilizado na superfície de solução de nanocompósito CQDs/ZnO após incubação a 37 °C por 12 h. Espectrofotometria foi usada para confirmar sucesso do processo de imobilização.

Princípio Geral do Método Imunoensaio

Reação sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo foi obtida usando outro anticorpo monoclonal KS 19.1 revestindo superfície de poços de microplaca. Sob condições ótimas de imunoensaio, concentração de antígeno CYFRA 21-1 foi determinada como função de aumento na intensidade do sinal de fluorescência.

Procedimento Imunosensor

Coleta de amostras de soro humano foi fornecida por voluntários aleatórios. Coagulação completa foi assegurada antes de centrifugação à temperatura ambiente e armazenamento a 4 °C. Técnica de adição (spiking) foi usada para preparar amostras padrão contendo antígeno CYFRA 21-1 na faixa de concentração de 0,01–500 ng mL⁻¹. Aproximadamente 50 μL das amostras com adição foram dispensados em poços de microplaca e misturados com 50 μL de anticorpo monoclonal KS 19.1 recém-diluído usando tampão fosfato salino de pH = 7,4 por 30 min e então incubados sem cobrir a placa por 1 h a 37 °C. Conteúdo dos poços foi sacudido bruscamente, e os poços foram enxaguados três vezes usando água desionizada (300 μL) para cada poço. Aproximadamente 50 μL da solução de nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21 foi adicionada a cada poço, misturada suavemente e incubada por 30 min a 37 °C. Amostras preparadas foram submetidas a análise de fluorescência usando leitor de microplaca para registrar intensidades.

Resultados e Discussão

Avaliação Morfológica de Pontos Quânticos de Carbono e seu Nanocompósito

Microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi usado para caracterizar morfologia superficial e distribuição de CQDs nas amostras. Para realizar exame sob MET, aproximadamente 4 μL da suspensão de CQDs preparada foi depositada na superfície da grade de carbono do MET. Na imagem METAR (Fig. 1a), pontos pretos uniformes observados com espaçamento de rede (0,36 nm) indicaram formação de CQDs. Gráfico de distribuição de tamanho de partícula foi plotado e tamanho médio variou de 1,5 ± 0,5 a 5,0 ± 0,5 nm (Fig. 1b). Tamanho de partícula obtido provou que CQDs formados são de fato nanomateriais de tamanho quântico. Além disso, espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi realizado, e tamanho médio de partícula foi encontrado como ~ 20 ± 0,2 nm. Diferença entre as duas medições anteriores foi observada. Estudos anteriores revelaram que METAR não mostra estrutura de rede cristalina dos CQDs formados em ampliações maiores devido à sua natureza amorfa. Similarmente, neste estudo, o precursor natural de carbono é pericarpo de Citrus lemon e os CQDs derivados também exibiram natureza amorfa. Portanto, diferença nas medições de tamanho de partícula pode ser atribuída à aglomeração dos CQDs formados, natureza amorfa dos pontos de carbono formados, mecanismo envolvido em cada experimento e dinâmica de hidratação das partículas.

Nanocompósito CQDs/ZnO preparado foi investigado usando MET e MEV. Na imagem MET (Fig. 2a), presença de partículas hexagonais anexadas aos CQDs indicou formação de nanocompósito CQDs/ZnO. No MEV, amostra de nanocompósito foi revestida com ouro para prevenir absorção de elétrons pela amostra e acúmulo de carga. Tensão acelerada aplicada foi 15 kV em ampliação × 30.000 (Fig. 2b).

Espectros UV-Vis e fluorescência de CQDs foram estudados, e espectros registrados mostraram dois picos significativos a 224 e 280 nm atribuíveis a transições p~p* e n~P* de C=C e C=O, respectivamente. Também, espectro de fluorescência de CQDs exibiu dois sinais em λ_ex máximo = 360 e λ_em = 453 nm. Além disso, espectro UV-Vis de nanocompósito CQDs/ZnO foi estudado. Pico de absorção significativo foi observado a 370 nm exibindo deslocamento azul-esverdeado. Propriedades fotoluminescentes (FL) de nanocompósito CQDs/ZnO foram estudadas. Tamanho e defeitos superficiais de CQDs afetam grandemente suas propriedades de luminescência. Como função de comprimento de onda de excitação, emissão (FL) de CQDs variou. Também, partículas nanométricas de ZnO exibiram emissão relacionada a defeitos na região de absorção visível azul a verde. Portanto, ZnONPs decorados com CQDs produziram excelente nanocompósito para emissão FL. Como mostrado na Fig. 4b, espectro FL de CQDs/ZnO exibiu deslocamento azul com pico significativo a 520 nm após comprimento de onda de excitação 470 nm. Deslocamento observado pode ser atribuído à sobreposição entre bandas de energia de CQDs e ZnONPs. Deslocamento azul exibido estava no nível de emissão de defeito 2,1 eV.

Para confirmar formação de nanocompósito CQDs/ZnO e nanocompósito CQDs/ZnO imobilizado com anticorpo monoclonal não conjugado BM 19.21, estudo comparativo FT-IR foi realizado. Espectro FT-IR registrado de CQDs revelou presença de diferentes picos distintos correspondentes a certos grupos funcionais, incluindo picos de vibração de estiramento a 3462 cm⁻¹ e 2932 cm⁻¹ para grupos C–OH e C–H, respectivamente. Além disso, três bandas de absorção de vibração foram observadas a 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹ e 1246 cm⁻¹ correspondentes à presença de grupos funcionais C=O, C–N e C–O–C, respectivamente. Novo pico a 436 cm⁻¹ correspondente a banda de vibração de estiramento de Zn–O foi observado. Propriedades redutoras e estabilizadoras de CQDs foram obtidas da presença de grupos –OH e COOH em sua superfície. Esses grupos funcionais atuam como doadores de elétrons e têm forte afinidade para formação de nanocompósito CQDs/ZnO. Portanto, CQDs reduziram e estabilizaram nanocompósito formado. Como mostrado na Fig. 5c, notou-se que dois novos picos foram formados a 3254 cm⁻¹ e 1675 cm⁻¹. Esses picos foram atribuídos a vibração de estiramento de N–H e C=O, respectivamente, confirmando imobilização de nanocompósito CQDs/ZnO-BM 19.21 via ligações peptídicas.

Espectros de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) dos CQDs sintetizados verde foram examinados. Espectro obtido de CQDs (Fig. 6a) mostrou diferentes grupos funcionais a 288 e 286 eV para C=O e COOH, respectivamente. Também, dois picos significativos de energia de ligação foram observados a 1044,4 e 1021,5 eV para Zn 2p_1/2 e Zn 2p_3/2, respectivamente. Além disso, espectro XPS de alta resolução de nanocompósito CQDs/ZnO confirmou presença de diferentes picos de energia de ligação a 560, 385, 350, 246 e 200 eV para O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p e Zn 3d, respectivamente. Todos os dados mencionados provaram presença de ZnO na superfície de CQDs formando nanocompósito CQDs/ZnO.

Estudo comparativo entre padrões XRD de CQDs e nanocompósito CQDs/ZnO foi realizado. Pico largo a 20° (2Ɵ) para pontos de carbono foi notado no padrão XRD de CQDs. Contudo, diferentes picos agudos foram reconhecidos a 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° e 80° (2Ɵ) para Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) e (202), respectivamente. Picos observados refletiram distribuição de ZnO na superfície de CQDs formando nanocompósito CQDs/ZnO.

Espectros Raman dos CQDs preparados, CQDs/ZnO e nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21 foram estudados. Sinais Raman são comumente usados para estudar estrutura cristalina e seus defeitos. Figura 8a mostrou duas bandas D e G típicas a 1300 e 1520 cm⁻¹ para nanopartículas de carbono, respectivamente. Como reportado anteriormente, banda D comumente representa defeitos sp³, e banda G é característica de vibração planar de carbonos sp²-ligados. Razão I_D/I_G foi calculada para CQDs preparados, e foi 1,02 ± 0,03. Novos picos agudos foram observados a 440 e 520 cm⁻¹ para nanopartículas de ZnO e picos típicos de CQDs observados a 1364 e 1595 cm⁻¹. Razão I_D/I_G foi 1,2 ± 0,01 indicando formação de nanocompósito CQDs/ZnO. Espectro Raman de nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21 exibiu numerosos picos facilmente reconhecíveis como sinais confirmatórios de estruturas secundária e terciária. Picos observados na região 1007–1128 cm⁻¹ foram atribuídos à estrutura secundária maior do anticorpo monoclonal. Picos Raman a 550–682 cm⁻¹ foram atribuídos a conformações de dissulfeto, enquanto os de 867–797 cm⁻¹ representaram estado de ligação de hidrogênio de resíduos de tirosina. Também, deslocamento significativo em pico do espectro Raman para 1630 cm⁻¹ pode ser atribuído à presença de estrutura terciária do anticorpo imobilizado. Razão I_D/I_G aumentou para 1,4 ± 0,04 revelando melhor estrutura cristalina devido à formação de nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21.

Otimização de Condições de Imunoensaio de Fluorescência

Seleção e otimização das condições sugeridas de imunoensaio de fluorescência foram conduzidas estudando vários parâmetros. Geralmente, quantidade de nanocompósito imobilizado, pH e concentração do tampão usado, tempo de incubação entre analito alvo nas amostras de soro e reagentes imunosensores devem ser investigados e otimizados. Para selecionar quantidade adequada de nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21, diferentes quantidades na faixa de 10–100 μL foram testadas. Intensidade máxima de fluorescência foi observada adicionando 50 μL do nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21. Quatro soluções de tampão fosfato salino de pH 7,2–7,5 foram preparadas e testadas como função de intensidade de fluorescência. Pequena mudança em intensidade de sinal de fluorescência foi observada mudando valores de pH. Em pH 7,2 e 7,3, sinal de fluorescência diminuiu devido à instabilidade química do nanocompósito CQDs/ZnO imobilizado. Sinal de fluorescência aumentou em pH 7,4 a 7,5 devido à excelente interação entre moléculas monoclonais na superfície do nanocompósito. Verificou-se que 7,4 é o valor de pH mais adequado para manter atividade do antígeno alvo que pode ser decomposto aumentando pH acima de 7,5. Portanto, pH 7,4 foi selecionado para estudos posteriores.

Influência da concentração de tampão fosfato salino na intensidade de fluorescência foi estimada usando faixa de concentração de 0,01–0,05 mol L⁻¹. Intensidade máxima de sinal de fluorescência foi obtida usando concentração de tampão de 0,01 mol L⁻¹. Em concentrações de tampão maiores, nanocompósito imobilizado CQDs/ZnO-BM 19.21 agregou-se, e instabilidade da solução imunosensora pode causar diminuição na intensidade de fluorescência. Para calcular tempo de imunorreação, procedimento analítico foi repetido usando tempo de reação variando de 10 a 60 min. Intensidade máxima de sinal de fluorescência foi observada mantendo reação entre antígeno testado e solução imunosensora por pelo menos 30 min.

Quantificação Analítica

Sob condições otimizadas, método de imunoensaio sugerido foi realizado usando 12 amostras de soro contendo antígeno CYFRA 21-1 na faixa de concentração de 0,01–500 ng mL¹. Resultados foram plotados para construir gráfico de calibração linear sobre faixa de concentração de 0,01–100 ng mL⁻¹ com limite de detecção de 0,008 ng mL⁻¹. Equação calculada foi I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Após seis repetições, porcentagem do desvio padrão relativo (%RSD) foi 1,3%. Resultados aceitáveis revelaram alta sensibilidade do método imunosensor de fluorescência para quantificação de antígeno CYFRA 21-1 em amostras de soro.

Adequação do Sistema

Adequação do sistema foi investigada realizando estudo comparativo entre método imunosensor sugerido de CQDs/ZnO-BM 19.21 imobilizado e métodos previamente abordados. Sistema de fluorescência sugeriu vantagens significativas como simplicidade, ecológico e fácil detecção do analito alvo em amostras de soro. Resultados registraram alta sensibilidade com ampla faixa linear de detecção de 0,01–100 ng mL¹ e menor limite de detecção de 0,008 ng mL¹.

Exatidão, Precisão e Seletividade do Sistema Imunosensor Imobilizado

Para garantir exatidão do sistema imunosensor de fluorescência CQDs/ZnO-BM 19.21 imobilizado sugerido para determinação de antígeno CYFRA 21-1 em amostras de soro, 12 amostras de soro foram testadas. Dados de resultado foram comparados com outra técnica previamente relatada, baseada em ensaio eletroquimioluminescente usando complexo tris 2,2′-bipiridil rutênio (II) excitado por tripropilamina. Resultados aceitáveis foram obtidos. Ensaios intra-dia e inter-dia foram usados para investigar precisão do método sugerido. Teste foi realizado usando amostra de soro contendo 10 ng mL⁻¹ de antígeno CYFRA 21-1. Desvios padrão relativos médios foram 1,1% e 1,3% para ensaios intra-dia e inter-dia, respectivamente, revelando alta precisão. Além disso, seletividade do método sugerido para determinação de antígeno CYFRA 21-1 foi avaliada usando algumas espécies interferentes possíveis como aminoácidos (cisteína, lisina, serina, tirosina e glicina), alguns cátions (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ e Zn²⁺) e outros biomarcadores como CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9 e CA 125. Teste foi realizado sob condições ótimas usando soro humano contendo 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 na presença de 10 ng mL⁻¹ de espécies coexistentes. Dados de resultado foram calculados como porcentagem de erro relativo (Er%) e resultado correspondente não excedeu ± 5% para cada espécie interferente. Valores de tolerância calculados (F-F⁰/F⁰) estavam dentro dos limites de tolerância (< 5%). Portanto, sistema imunosensor de fluorescência CQDs/ZnO-BM 19.21 imobilizado sugerido exibiu alta seletividade para determinação de antígeno CYFRA 21-1 no soro humano.

Análise de Espécimes Reais

Em espécimes humanos reais, sistema imunosensor de fluorescência sugerido baseado em solução CQDs/ZnO-BM 19.21 imobilizada foi explorado para detectar e quantificar porcentagem (%) de recuperações do marcador tumoral antígeno CYFRA 21-1. Como mencionado anteriormente no procedimento imunosensor, sistema sugerido foi usado para determinar antígeno CYFRA 21-1 encontrando relação entre intensidade de fluorescência e concentração de antígeno CYFRA 21-1 em amostras de soro. Certas quantidades do antígeno alvo (0,5, 1,0 e 2,0 ng mL⁻¹) foram adicionadas às amostras estimadas, e aumento nas intensidades de sinal foi avaliado. Após seis determinações, desvios padrão relativos porcentuais (%RSD) foram calculados. Porcentagens de recuperação variaram de 96,7 ± 0,7 a 100,0 ± 1,3%. %RSD calculado variou de 0,2–1,4%. Amostras de soro testadas foram analisadas usando método previamente relatado e porcentagens de recuperação variaram de 96,1 ± 1,6 a 100,0 ± 0,4% com %RSD 0,3–1,7%. Para garantir adequação da técnica de fluorescência imunosensora sugerida usando solução CQDs/ZnO-BM 19.21 imobilizada, estudo estatístico comparativo usando teste t de Student e teste F foi realizado entre resultados presentes e aqueles obtidos por outros de métodos previamente conduzidos. Valores obtidos de teste t e teste F variaram de 0,354 a 2,181 (2,228)* e 1,16 a 4,0 (5,05)* com relação aos valores tabelados de P = 0,05, respectivamente. Resultados revelaram boa concordância entre método sugerido e procedimentos publicados anteriormente. Além disso, todas as quantidades detectadas de antígeno CYFRA 21-1 em amostras de soro estavam dentro do limite normal indicando que nenhum câncer de pulmão foi diagnosticado nas amostras de soro investigadas.

Conclusão

Estudo presente concerniu à preparação de CQDs de síntese verde conjugados com nanocompósito ZnO usando Citrus lemon como precursor. Nanocompósito CQDs/ZnO foi empregado para formar novo sistema imunosensor de fluorescência imobilizando anticorpo monoclonal BM 19.21 através de simples ligações peptídicas. Sistema de fluorescência altamente sensível foi usado para determinar marcador tumoral de câncer de pulmão (CYFRA 21-1) no soro humano. Antígeno CYFRA 21-1 foi determinado via reação sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo usando outro anticorpo monoclonal KS 19.1 revestindo poços de microplaca. Características únicas e alta sensibilidade do sistema sugerido facilitam determinação do marcador tumoral alvo com alta estabilidade e reprodutibilidade. Estudo comparativo foi realizado e resultados confirmaram adequação e alta sensibilidade do sistema imunosensor sugerido, e resultados concordaram com técnica convencional previamente relatada.