Efeitos proapoptóticos aprimorados de complexos dispersos em água de quimioterápicos à base de 4-tiazolidinona com um nanocarreador polimérico contendo PEG

Resumo

Objetivo

Para estudar se a formulação de água do complexo de derivados de 4-tiazolidinona com um nanocarreador polimérico contendo PEG aumenta sua ação pró-apoptótica para células C6 de glioma de rato.

Métodos

Os mecanismos dos efeitos antineoplásicos dos derivados da 4-tiazolidinona foram investigados in vitro com células C6 de glioma de rato. A natividade celular, o padrão de ciclo celular e a expressão de Anexina V foram avaliados e os danos ao DNA foram estimados por análise de DNA cometa. Uma nova formulação à base de água de derivados de 4-tiazolidinona complexados com um nanocarreador polimérico foi utilizada para aumentar a ação pró-apoptótica em relação às células C6.

Resultados

Os derivados de 4-tiazolidinona estudados usam mecanismos de apoptose para matar células C6 de glioma de rato, conforme confirmado pela análise FACS dessas células no estágio pré-G1, o aparecimento de células C6 positivas para Anexina V e um número aumentado de cometas de DNA de classes superiores. A complexação dos compostos estudados com um nanocarreador polimérico contendo PEG aumentou significativamente os efeitos pró-apoptóticos em células C6 de glioma de rato medidos por todos os métodos mencionados acima.

Conclusão

A complexação de derivados de 4-tiazolidinona com um nanocarreador polimérico contendo PEG forneceu-lhes solubilidade em água e efeitos pró-apoptóticos aumentados em células C6 de glioma de rato.

Introdução

A quimioterapia é a principal modalidade de tratamento para muitos tumores, e os quimioterápicos são escolhidos como última opção, principalmente nos casos em que o câncer já se disseminou [1]. No entanto, os graves efeitos colaterais negativos reduzem a eficácia clínica de muitos medicamentos anticâncer atuais. Portanto, há uma necessidade contínua e crucial de desenvolver drogas anticâncer alternativas ou sinérgicas com efeitos colaterais reduzidos ou mínimos [2].

A baixa solubilidade em água de drogas anticâncer tem sido um problema prevalente e sério que impede seu desenvolvimento e aplicação clínica, e muitos agentes quimioterápicos altamente ativos e promissores foram excluídos por causa de sua baixa solubilidade em água [3]. Surfactantes e co-solventes são usados ​​em altas concentrações para solubilizar agentes anticâncer insolúveis em água; entretanto, essas substâncias também podem produzir efeitos colaterais adversos, limitando o uso de muitos medicamentos anticâncer [4].

Um grande desafio para o desenvolvimento de fármacos é eliminar ou pelo menos reduzir os efeitos colaterais negativos de fármacos altamente ativos, especialmente os agentes antitumorais que apresentam toxicidade geral no organismo que restringe significativamente seu uso [5,6,7,8,9 ] Uma maneira eficaz de superar esse problema é usar um nanocarreador multifuncional da droga que permitirá que os agentes antitumorais tóxicos se liguem no local de sua entrega às células-alvo em órgãos ou tecidos específicos [8, 10, 11]. O tamanho pequeno, a estrutura específica controlada, a grande área de superfície e a forma das nanopartículas fornecem-lhes várias vantagens em comparação com outros materiais [5, 8, 9]. Ao usar nanopartículas, é possível otimizar a eficiência, minimizar os efeitos colaterais negativos e melhorar a terapia do câncer [12, 13]. Assim, os medicamentos que falharam anteriormente devido à alta toxicidade geral podem agora ter uma segunda oportunidade para uso clínico, devido à sua inclusão em um sistema de entrega que tem melhor biodisponibilidade e liberação controlada. Esses complexos portadores de drogas penetram mais facilmente através das barreiras naturais, como as barreiras hematoencefálicas ou membranas de células individuais. A grande área superficial das nanopartículas possibilita a formação de complexos com biomoléculas vetoriais específicas que auxiliam na administração do fármaco ao órgão alvo, levam a uma redução significativa ou mesmo à eliminação completa dos efeitos colaterais negativos, permitem um aumento na dose mínima efetiva durante uma única administração do medicamento, aumenta a eficácia da ação do medicamento e dá um novo estímulo para o desenvolvimento da farmacoterapia personalizada. Além disso, as nanopartículas podem encapsular moléculas que melhoram a solubilidade, estabilidade e absorção de certas drogas [11, 13,14,15]. Os sistemas de distribuição de drogas podem fornecer circulação prolongada de uma droga no sangue, a capacidade da droga se acumular durante o processo fisiopatológico e a capacidade de transferir eficazmente a molécula da substância ativa para as células e organelas das células. As nanopartículas devem ser estáveis, manter sua estrutura química por um determinado período de tempo e, ao mesmo tempo, ser capazes de biodegradação [16, 17].

Para avaliar novas drogas anticâncer, é importante medir sua atividade citotóxica e potência usando várias linhas de células de câncer humano alvo e modelos experimentais de tumor in vivo . A quimioterapia freqüentemente falha devido a uma deficiência no processo de apoptose que desempenha um papel fundamental na morte celular induzida por drogas, consecutiva ou resultante de uma alteração na tumorigênese [18,19,20,21].

Uma vez que muitas células malignas podem escapar da morte por apoptose, uma abordagem racional deve ser usada no projeto e desenvolvimento de novos medicamentos anticâncer. Os principais objetivos para a criação de novos medicamentos anticâncer são (1) encontrar maneiras de superar as mutações de células cancerosas individuais que afetam os mecanismos independentes de ação do medicamento; e (2) desenvolver regimes de quimioterapia capazes de direcionar simultaneamente vias independentes. Uma melhor compreensão da relação entre a genética do câncer e a sensibilidade ao tratamento é uma questão chave para o desenvolvimento de novos medicamentos anticâncer eficazes [22].

Em estudos anteriores, demonstramos que derivados sintéticos de 4-tiazolidinona (Les-3288, Les-3833 e Les-3882) provavelmente usam mecanismos de ação diferentes de outros agentes anticâncer para matar células de glioma C6 de rato e de glioblastoma U251 humano in vitro, ao contrário a doxorrubicina (Dox). Les-3288 não afetou significativamente o nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células tratadas [23, 24]. Deve-se enfatizar que esses potentes agentes antitumorais apresentaram menor toxicidade geral no corpo de animais experimentais, conforme demonstrado pelos parâmetros bioquímicos medidos de sua ação tóxica em células tumorais e animais, em comparação com os de Dox [7, 8]. Assim, a ligação de um fármaco antitumoral com um nanocarreador polimérico (PNC) e a aplicação do fármaco na forma de um sistema de distribuição de água estável pode reduzir os efeitos tóxicos nos órgãos dos animais, em comparação com a ação dessas substâncias na forma livre [ 7, 8].

O objetivo deste trabalho foi estudar a indução de apoptose em células de glioma de rato da linha C6 in vitro e in vivo por formulações à base de água de complexos de derivados de 4-tiazolidinona com um PNC contendo PEG, e comparar a indução de apoptose usando esses derivados na forma livre.

Materiais e métodos

Drogas anticâncer

Os derivados heterocíclicos de 4-tiazolidinonas (compostos Les-3288 e Les-3833, Fig.1) foram sintetizados no Departamento de Química Farmacêutica, Orgânica e Bioorgânica de Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ucrânia, conforme descrito anteriormente [25].

Estrutura dos compostos investigados - Les-3288 e Les-3833

Antes do uso em cultura de células, esses compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO, Arterium, Lviv, Ucrânia). A solução foi adicionalmente mantida por 5 min em banho-maria e diluída em água destilada para atingir as concentrações de trabalho. A concentração final do DMSO no meio de cultura foi inferior a 0,1%. O Dox foi comprado em uma farmácia local de um representante da Pfizer (Itália) na Ucrânia.

Nanocarrier polimérico

O PNC para entrega de drogas foi sintetizado no Departamento de Química Orgânica da Universidade Nacional Politécnica de Lviv, Ucrânia, usando uma metodologia descrita anteriormente [26, 27]. Síntese de poli (VEP- co -GMA) -enxerto-PEG foi realizado por meio de etapas subsequentes como se segue. Poli (VEP- co -GMA) foi sintetizado por copolimerização radical de 5- tert butilperoxi-5-metil-l-hexeno-3-ino (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (monômero de peróxido sintetizado pelo método descrito [28]) e metacrilato de glicidil (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich , EUA) em acetato de etila (7,9 mL) (Merck, Darmstadt, Alemanha) usando azoisobutironitrila (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Alemanha) como o iniciador radical. A polimerização foi realizada a 343K até que a conversão máxima de 65% foi atingida. Poli (VEP- co -GMA) foi usado como a espinha dorsal para a ligação de cadeias de PEG laterais por meio de reações de adição de éter de poli (etilenoglicol) metílico (mPEG) com grupos epóxido laterais. Eterato de trifluoreto de boro (0,027 mL, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado à solução de copolímero (1,0 g) em dioxano (20 mL; Merck, Darmstadt, Alemanha) a 313 K e agitado durante 3 h. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvido em dioxano (15 mL) e a solução foi misturada com a solução de polímero de base e agitada por 6 h a 313 K. O mPEG não reagido foi removido usando sacos de diálise com tamanho de poro de corte de peso molecular (MWCO) de 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, EUA). Resultante de poli (VEP- co semelhante a um pente -GMA) -enxerto-PEG foi seco à temperatura ambiente sob vácuo até peso constante. As estruturas e algumas características do PNC são apresentadas na Figura 2 e foram previamente descritas [29].

Estrutura esquemática do PNC - poli (VEP -co- GMA) - enxerto -PEG com a cadeia principal na base de um copolímero de peróxido insaturado de 2- tert -butilperoxi-2-metil-5-hexen-3-in (VEP, denotado por "k"), com cadeias laterais de metacrilato de glicidil (GMA, denotado por "l") e polietileno glicol (PEG, denotado por "m" )

Para preparar as soluções de PNC à base de água, 0,09 g de PNC foi dissolvido em 0,9 mL de DMSO. Esta solução de PNC foi adicionada a 8,0 mL de solução de NaCl a 0,9%. Em seguida, a solução foi agitada durante 0,5 he sonicada durante 10 s. Dispersões de água dos complexos foram obtidas jogando a solução de DMSO de 4-tiazolidinonas e PNC na água na seguinte ordem:0,045 g de PNC foi dissolvido em 0,15 mL de DMSO (Sigma-Aldrich, EUA) e 0,0015 g de Les -3288 (ou Les-3833) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO. As soluções de PNC e 4-tiazolidinonas foram misturadas e adicionadas a 4,25 mL de solução aquosa de NaCl a 1% e sonicadas por 10 s.

Este PNC de superfície ativa contém as cadeias de PEG hidrofílicas enxertadas na estrutura hidrofóbica (Fig. 2a). Em soluções aquosas, o PNC anfifílico forma estruturas semelhantes a micelas que podem solubilizar compostos insolúveis em água (por exemplo, drogas) ou esses compostos podem ser adsorvidos na superfície das nanopartículas, aumentando assim sua biocompatibilidade. A técnica desenvolvida para obter dispersões de água altamente estáveis ​​dos quimioterápicos à base de 4-tiazolidinona consiste na nucleação de partículas de fármaco em nanoescala que ocorre quando as soluções diluídas em DMSO são transferidas para a solução salina precipitante contendo surfactante polimérico PNC que fornece revestimento de polímero para o superfície de nanopartículas. Como resultado, devido à agregação e sedimentação, o complexo foi estabilizado e a dispersão foi evitada. Além disso, os complexos em nanoescala de derivados de 4-tiazolidinona são protegidos de possíveis interações com o microambiente biológico circundante. Essa proteção permite que eles permaneçam por mais tempo no corpo sem perder a estabilidade e se acumulem no tecido ou órgão alvo sem causar efeitos colaterais negativos. Assim, tal modificação fornece agregação aprimorada e estabilidade de sedimentação de dispersões em água das nanopartículas de compostos anticâncer.

Os tamanhos das micelas de polímero de PNC e dos complexos de PNC com 4-tiazolidinonas heterocíclicas foram medidos por dispersão de luz dinâmica (DLS) usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Alemanha) e DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, EUA) e por espectros de correlação de fótons usando tecnologia de retrodifusão não invasiva (NIBS) a 25 ° C. As amostras para medições DLS foram preparadas conforme descrito acima e, se necessário, foram diluídas com água bidestilada, pH 6,5–7,0. Três a cinco medições foram feitas para cada amostra (cada medição consistiu em 5 ciclos e o intervalo entre as medições foi de 5 min). A Figura 3 mostra a distribuição de tamanhos das estruturas micelares do PNC e das nanopartículas dos complexos de PNC com as 4-tiazolidinonas heterocíclicas (Les-3833 e Les-3288) analisadas por DLS. O tamanho e a morfologia das micelas PNC, bem como das nanopartículas de 4-tiazolidinona revestidas com PNC, foram estudados usando um microscópio eletrônico de transmissão JEM-200А (JEOL, Japão) a uma tensão de aceleração de 200 kV [30, 31]. As amostras foram preparadas conforme descrito acima e, se necessário, foram diluídas com água bidestilada. As amostras foram preparadas pulverizando a solução testada sobre um substrato por meio do dispersante ultrassônico UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ucrânia), o que facilita um revestimento uniforme no substrato. Um fino filme de carbono amorfo depositado em uma grade de cobre foi usado como substrato. Os tamanhos e morfologia das micelas PNC e os complexos com as 4-tiazolidinonas heterocíclicas (Les-3288 e Les-3833) estudados pelos métodos de DLS e TEM são apresentados na Fig. 3.

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) do PNC (esquerda) e complexo de PNC + Les-3833 (direita)

Os estudos de DLS e de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) demonstraram que os tamanhos das micelas PNC eram 50 ± 25 nm e as nanopartículas formadas por complexos de PNC com as 4-tiazolidinonas heterocíclicas Les-3833 e Les-3288 eram 140 ± 25 nm e 155 ± 30 nm, respectivamente . As dispersões de complexos de PNC com derivados de 4-tiazolidinona são altamente estáveis ​​e protegidas da agregação e sedimentação pela camada de PNC adsorvida na superfície da nanopartícula de tiazolidinona. Conforme mostrado na Fig. 4, as mudanças nos tamanhos das nanopartículas dispersas no sistema de água são desprezíveis em múltiplas diluições com água, bem como após 6 meses de envelhecimento dos sistemas de água de complexos de PNC com 4-tiazolidinonas.

Estudo DLS de diâmetros hidrodinâmicos de PNC e complexos ( a ) e dependência de tamanhos médios de complexos de PNC-droga na diluição de dispersão ( b ):dispersões de água de PNC (1), complexos de Les-3833 + PNC (2) e Les-3288 + PNC (3), bem como tamanhos hidrodinâmicos de Les-3833 + PNC (1–3) e Les- 3288 + PNC (4–6) dispersões após armazenamento por 2 dias (1,4), 4 meses (2,5) e 6 meses (3,6) ( c )

Cultura de células

As células de glioma de rato da linha C6 foram obtidas da Cell Culture Collection no Instituto de Biologia Molecular e Genética, Academia Nacional de Ciências da Ucrânia (Kiev, Ucrânia). As células foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma, EUA). As células foram cultivadas em um CO ₂ -incubadora a 37 ° C, 5% CO ₂ e 95% de umidade. A ressemeadura das células foi realizada na proporção de 1:5 uma vez em 2-3 dias.

Avaliação da ação citotóxica de substâncias estudadas

As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma concentração de 100.000 células / mL em um poço. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, EUA). As substâncias em estudo foram adicionadas nas concentrações de 0,1, 0,5 e 1,0 μM após um período de adaptação de 24 horas que começou após a semeadura das células. A contagem de células foi conduzida em intervalos regulares na câmara de contagem hemocitométrica usando corante Trypan Blue (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, EUA) na concentração final de 0,01%, 2 min após sua adição à suspensão de células . As células mortas absorveram esse corante devido a danos em sua membrana plasmática.

Citometria de fluxo

Para estudar o ciclo celular e a apoptose, as células C6 foram tratadas com Les-3288, Les-3833 e seus complexos com PNC, bem como com PNC na forma livre, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), peletizadas por centrifugação a 1000 rpm por 5 min a 4 ° C e ressuspenso em PBS frio (2 milhões de células por 1 mL de PBS). Em seguida, as células foram fixadas pela adição de alíquotas de 4 mL de etanol absoluto resfriado a -20 ° C com mistura suave. As amostras fixadas foram mantidas a - 20 ° C até o uso (não mais de 1 semana). Para análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), as amostras de células foram centrifugadas a 1000 rpm por 5 min a 4 ° C, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular foi ressuspenso em 1 mL de PBS. Cem microlitros de RNase livre de DNase (Sigma, EUA) foram adicionados a essa suspensão, e as amostras foram incubadas a 37 ° C por 30 min. Em seguida, cada amostra foi suplementada com 100 μl de iodeto de propídio (PI) (Sigma, EUA, 1 mg / mL) e incubada em temperatura ambiente por 10 min. Por fim, as amostras foram transferidas para tubos de plástico Falcon e a suspensão celular monitorada com citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA) e software Summit v3.1 (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, EUA) para medir os parâmetros do ciclo celular e apoptose.

A medição das células positivas para anexina V (apoptóticas) foi realizada usando análise FACS. Células de glioma C6 de rato foram tratadas com concentrações de 0,1 mg / mL, 0,5 mg / mL e 1 mg / mL de PNC, Les-3288, Les-3833 e seus conjugados poliméricos conforme indicado nas figuras. No final do experimento, as células foram destacadas do fundo da placa com solução de Tripsina-EDTA, lavadas duas vezes com PBS e coradas com Anexina V-FITC usando o Kit de Detecção de Apoptose (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) , de acordo com as instruções do fabricante. As células lavadas foram incubadas durante 15 min no tampão de ligação de Anexina V (BD Pharmingen), contendo 1/50 do volume de solução de Anexina V conjugada com FITC. Em seguida, as amostras foram diluídas duas vezes com um volume apropriado do tampão de ligação de Anexina V e imediatamente medidas no canal FL1 / FL2 (FITC-PI) de um citômetro de fluxo (Becton Dickinson, EUA). As células positivas para Anexina V foram classificadas como apoptóticas.

Ensaio de DNA Cometa

O ensaio do DNA cometa foi realizado em condições alcalinas. Dez mil células foram misturadas em 75 μl de agarose de baixo ponto de fusão (0,5%) por amostra. Após a mistura, a amostra foi pipetada para uma lâmina que havia sido coberta com agarose com ponto de fusão normal a 1,5% anteriormente. As amostras foram incubadas a 4 ° C durante 18 h em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-base, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão do dano alcalino-lábil, as lâminas foram incubadas em solução alcalina em temperatura ambiente por 20 min (conduzidas no escuro). Para a eletroforese (~ 74 V / cm por 30 min), as lâminas foram transferidas para uma câmara horizontal e tampão de eletroforese 1x (NaOH 0,3 M, EDTA 1 mM, pH> 13) foi adicionado. As lâminas foram fixadas em metanol 100% gelado e secas. As lâminas foram coradas com 80 μL 1 × brometo de etídio (EtBr) por 5 min e depois mergulhadas em água destilada gelada para remover o excesso de mancha. Os cometas de DNA foram visualizados usando um microscópio (Carl Zeiss, Alemanha), e as imagens foram analisadas usando o software ‘CASP’ (software Casplab-1.2.3b2, CASPlab, Wroclaw, Polônia). Cem cometas por amostra foram contados. O dano ao DNA foi categorizado em cinco níveis de genotoxicidade de acordo com o tamanho da cauda do cometa:0 (0–5% de dano), 1 (5–25% de dano), 2 (25–45% de dano), 3 (45–70% de dano ), e 4 (mais de 70% de danos) [32]. O índice de dano (DI) foi calculado, conforme descrito anteriormente [33].

Ensaio de intercalação de DNA usando corante verde de metila

Os compostos Les-3288 e Les-3833 foram investigados quanto à capacidade de intercalar na molécula de DNA usando o ensaio de verde de metila [34]. DNA de esperma de salmão (10 mg / mL) foi incubado por 1 h a 37 ° C com 15 μL de solução de verde de metila (1 mg / mL em H ₂ O). Os compostos foram adicionados a 1 μg / mL e incubados a 37 ° C no escuro por 2 h. O volume total final das amostras foi de 1 mL. A absorção do verde de metila foi medida a 630 nm, após incubação da amostra por 2 h a 37 ° C, usando um microfotômetro multicanal BioTek 76 883 (BioTek, Winooski, VT, EUA). EtBr foi usado como controle positivo.

Análise de dados e estatística

Todos os experimentos foram repetidos três vezes com três paralelos em cada variante. A análise de variância (ANOVA) foi usada para comparação dos grupos. Os dados da distribuição de células de glioma de rato C6 em diferentes fases do ciclo celular foram analisados ​​por ANOVA de uma via, seguido pelo teste de comparação múltipla post hoc de Tukey. Todos os dados são apresentados como média ± DP. A p valor de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Efeito citotóxico (teste de exclusão de azul de tripano) de derivados de 4-tiazolidinona usados ​​na forma livre e em complexo com o nanocarreador polimérico

Os resultados do teste de exclusão de azul de tripano demonstraram que as formas à base de água dos complexos Les-3288 e Les-3833 com o PNC aumentaram a toxicidade para células de glioma C6 (tratamento de 24h e 48h) em comparação com a citotoxicidade observada com o uso do forma livre destes compostos (Figs. 5 e 6). O maior efeito de citotoxicidade foi observado em doses de 0,1 e 0,5 μM de compostos Les-3288 e Les-3833 em seus complexos com o PNC, enquanto que na dose mais alta (1,0 μM) desses compostos, foi detectado um aumento da complexação com o PNC apenas no caso de Les-3288 por 24 h (Figs. 5 e 6).

Número de células vivas de glioma C6 de rato medido pelo teste de exclusão de azul de Tripan após o tratamento por 24 he 48 h com diferentes concentrações (0,1, 0,5 e 1,0 μM) de Les-3288 sozinho em comparação com a ação de seu complexo com o nanocarreador polimérico ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( diferença em comparação com o controle, 100%)

Número de células vivas de glioma C6 de rato medido pelo teste de exclusão de azul de Trypan após o tratamento por 24 h e 48 h com diferentes concentrações (0,1, 0,5 e 1,0 μM) de Les-3833 sozinho em comparação com a ação de seu complexo com o nanocarreador polimérico ( PNC) * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 (diferença em comparação ao controle, 100%)

Complexação de compostos Les-3833 e Les-3288 com nanocarreador polimérico aumenta sua atividade pró-apoptótica in vitro para células de glioma C6 de rato

Duas abordagens alternativas foram utilizadas para avaliar o efeito modulador do PNC no potencial citotóxico dos derivados de 4-tiazolidinona selecionados. Primeiro, a análise do ciclo celular foi conduzida para investigar o impacto dos complexos droga-PNC no ciclo celular. Além disso, a coloração dupla com anexina V / PI foi utilizada para distinguir o tipo exato de morte celular induzida por esses nanocompósitos.

Os compostos Les-3288 e Les-3833 em doses baixas (0,1 μg / mL e 0,5 μg / mL) não produziram nenhum efeito visível na progressão do ciclo celular ou na indução de apoptose, como mostrado na Fig. 7 e Tabela 1. No entanto, complexação de ambos os compostos com o PNC aumentaram significativamente o número de células no pré-G ₁ fase (4 vezes para Les-3288 e 6 vezes para Les-3833), o que indica um grande aumento de seu potencial pró-apoptótico. Deve ser enfatizado que o PNC na forma livre não teve impacto no ciclo celular ou na indução de apoptose; assim, o aparecimento observado de uma grande população de células pré-G1 sob tratamento com os complexos tiazolidinona-nanocarreador não pode ser explicado por um efeito sinérgico simples do PNC e das drogas experimentais.

Impacto na progressão do ciclo celular de derivados de 4-tiazolidinona Les-3288 e Les-3833 na forma livre e em complexo com o nanocarreador polimérico (PNC) em células de glioma de rato C6. Coloração com iodeto de propídio (PI), citometria de fluxo. R2, pré-G1; R3, G1; R4, S; R5, fase G2. FL2-H, valores de emissão de pico do segundo canal (filtro 585/40) do citômetro de fluxo

A fim de confirmar que o pico sub-G1 observado consiste em células apoptóticas, os resultados do ensaio de coloração com Anexina V / PI foram analisados. Não observamos externalização significativa de fosfatidilserina (principal marcador de apoptose precoce, detectado por Anexina V conjugada com FITC) durante o tratamento de glioma C6 com baixas (0,1 e 0,5 μg / mL) e altas doses de Les-3288 (1,0 μg / mL) , sugerindo que este composto é um indutor fraco de apoptose. Em vez disso, encontramos um aumento na população de células necróticas (de 1,2% no controle para 11,25% para Les-3288, 1,0 μg / mL), o que pode indicar que Les-3288 causa, pelo menos parcialmente, a morte celular necrótica. No entanto, a complexação de Les-3288 com o PNC mudou completamente o modo de ação desta droga. Houve um aumento maciço no número de células apoptóticas precoces (anexina V (+) / PI (-)) e células apoptóticas tardias (anexina V (+) / PI (+)), enquanto a quantidade total de células puramente necróticas permaneceu em o nível de células de controle (não tratadas) (Fig. 8a). Assim, a ligação de Les-3288 com o PNC não apenas aumenta fortemente sua atividade pró-apoptótica em relação às células de glioma, mas também diminui seu potencial mecanismo de morte celular pró-necrótica. Esses achados podem ser de importância fundamental para a prática clínica porque os fármacos pró-necróticos não são recomendados para uso devido a uma indução maciça de inflamação que é inconveniente para os pacientes.

Comparação da atividade pró-apoptótica de Les-3288 ( a ) e Les-3833 ( b ) compostos e seus complexos com o nanocarreador polimérico (PNC) para células C6 de glioma de rato. Coloração dupla com anexina V / PI, citometria de fluxo. PI, iodeto de propídio

Surpreendentemente, não observamos o mesmo efeito para o complexo Les-3833 + PNC. Na verdade, a atividade pró-apoptótica do complexo Les-3833 + PNC foi menor em comparação com Les-3288 na forma livre em todas as concentrações testadas (Fig. 8b). Essa diferença drástica entre os dois compostos pode ser explicada pela especificidade de sua estrutura química, e especulamos que, no caso de Les-3833, a estrutura do polímero deve ser otimizada para obter melhores resultados.

Ensaio do cometa de danos ao DNA em células de glioma C6 de rato causados ​​por derivados de 4-tiazolidinona na forma livre e complexados com o PNC

O ensaio do cometa alcalino permite a detecção de quebras de DNA de fita simples em sítios de DNA alcalino-lábil. Os resultados obtidos foram estimados utilizando o valor médio do momento de cauda de oliva (OTM). Nossos dados mostraram que o tratamento de células de glioma de rato С6 com Les-3288, Les-3833 e PNC (concentração 0,5 μg / mL) por 3 h (Figs. 9 e 10) não causou dano significativo ao DNA (OTM =0,7299 ± 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =0,5846 ± 0,1078, respectivamente), em comparação com as células não tratadas no controle (OTM =0,4541 ± 0,07273). No entanto, o tratamento de células com o complexo Les-3833 + PNC (OTM =2,3880 ± 0,2212) causou danos ao DNA mais significativos do que o tratamento de células com a forma livre de Les-3833. Tal aumento no dano não foi observado para a ação do complexo Les-3288 + PNC (Figs. 9 e 10).

O dano ao DNA foi avaliado usando o momento da cauda de oliva em células C6 de glioma de rato tratadas por 3 h com compostos antineoplásicos experimentais usados ​​na concentração de 0,5 μg / mL. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001. PNC, nanocarreador polimérico; Dox, doxorrubicina (controle positivo)

Presença de DNA na cauda do cometa de células С6 de glioma de rato após tratamento por 3 h com ( a ) controle (células não tratadas), Les-3288 ( b ), Les-3288 + PNC ( c ), Les-3833 ( d ) Les-3833 + PNC ( e ), PNC ( f ) e doxorrubicina ( g ), usado em uma concentração de 0,5 μg / mL

Um aumento do tempo de incubação das células para 6 h (Figs. 11 e 12) causou maior dano ao DNA em todos os grupos experimentais:Les-3288, Les-3288 + PNC, Les-3833, Les-3833 + PNC e Dox (controle positivo ) However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. * P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Discussion

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Conclusions

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Abreviações

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Doxorrubicina

EtBr:

Brometo de etídio

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS:

Espécies que reagem ao oxigênio

PBS:

Salina tamponada com fosfato

PEG:

Polietileno glicol

PI:

Propidium iodide

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in

Uso de íons diferentes para ajustar estruturas de pilha de grafeno de folha a semelhante a cebola durante a esfoliação de plasma, com aplicações de supercapacitor Passivação de Si melhorada e Eficiência de célula solar PERC por óxido de alumínio depositado por camada atômica com recozimento pós-recozimento de duas etapas